- 1. Estratgias de Sequenciamentogenoma e transcriptomaProf.
Adriana DantasUERGS Bento Gonalves
2. COMO ISOLAR UM GENE DE INTERESSE?Genoma estruturalMapeamento
de geneSequenciamentoAnotao gnicaGenoma funcionalPerfil de expresso
TranscriptomaAnotao gnica Protemica 3. GenmicaCincia que estuda o
genoma, ou oconjunto do material gentico de umorganismo.Ex.: Genoma
da Xylella fastidiosa composto pelo DNA cromossomal mais oDNA
plasmidial. 4. GENOMA COMO ESTUDAR?Marcador molecular
Sequenciamento de DNA Polimorfismo Bancos de sequencias Biblioteca
genmicaAnlise de segregaoMapa genticoGenoma funcional Mapeamento de
interesse (QRL QTL)Expresso gnica - RNAm 5. Metodologias de anlise
e obteno de genes de interesseSeleo diferencial e hibridizao
subtrativa(Sambrook et al., 1989) cDNA-AFLP (Bachem et
al.,1996)Mapeamento PosicionalHibridao Somtica assimtrica (Xu e
Korban, 2000)Differential Display Reverse Transcription PCR
-(DDRT-PCR) (Liang and Pardee., 1992)RFLP-coupled differential
display (RC4D) (Fischer etal., 1995)Serial Analysis of Gene
Expression (SAGE)(Velculescu et al., 1995)Macroarrays (Chen et al.,
1998)Microarrays (Schena et al., 1995) 6. ControleTratado Extrao de
RNA e sntese de cDNAConstruo da biblioteca
sequenciamentosequenciamento e sequenciamentoSequncia
consensuclusterizaoExpresso gnica : tratado = 2x controle 7.
Biblioteca subtrativaRNA PoolsSntese de cDNAControle Tratado
Digesto de cDNAcom 4 enzimas de Driver Testercorte Ligao
dosAdaptador adaptadores paraamostra do testerDriver Driver
andTesterHibridizao TesterTester/ driver PCR com primersespecificos
paraadaptador j ligadoa amostra do Amplificao testerNo Amplificao
ExponencialEnriquecimento deamplificado linearbibliotecas
deEnriquecido cDNA nos genesTesterexpressos nas Eliminado
Eliminadoamostras do tester 8. Construo de bibliotecas Subtrativas
cDNA testercom adaptador 1 RcDNA DrivercDNAtestercom adaptador 2 R
(em excesso) TesterDriver RNA tecido ARNA tecido B 1 Hibridizaoa
cDNAbcRNA mensageirodDigesto com Dpn II 2 Hibridizao mistura de
amostras, :adio de Driver desnaturado anelamento e cDNAa, b, c, d +
eLigao ao oligo A Ligao ao oligo BPreenchimento dos
terminaisDigesto comRsaIab Hibridizao com excesso de DriverLigao
dos cadaptadoresd PCR com a utilizao de iniciadores complementares
ao oligo Ae Adio de primers SubtraoAmplificao por PCRAmplificao
seletiva dos cDNAs derivados do Testera e d - nenhuma amplificaob-
b - nenhuma amplificaoc - amplificao linear Clonagem em vetores e
montagem da biblioteca5 3 ee - amplificao exponencial3 5 9.
cDNA-AFLP 10. cDNA-AFLPVantagens: Alta reprodutibilidade; Poucos
falso positivos; Necessita de pequenas quantidadesiniciais de
RNA.Desvantagens: O cDNA precisa conter o stio derestrio da enzima
utilizada. 11. DDRT-PCR(Differential Display Reverse Transcription
PCR) 12. SNPs (Single nucleotide polymorphisms)Polimorfismo de um
nico nucleotdeo5 leader Coding sequence 3 end Poly-A(exons)
Seqnciamento 3Seqnciamento 5 13. SNPs - Princpio detectar a variao
de seqncia na janela de um alinhamento de ESTs de um mesmo gene,
parcialmentesobrepostasVariaes mais frequentes no genoma:- 1
substituio a cada 31 pb no codificadora- 124 pb em regies
codificadoras 14. Deteco e validao de SNPs 15. Princpio da
genotipagemSNP site1. PCR amplificao
TTACGCATAACCTATCGAATTCCATCGCATCGAC2. Restrio do produto PCR com a
enzima adequada (ex: EcoRI, GAATTC)Se A est presente ocorreSe C est
presente, no ocorrea restrioa
restrioTAACCTATCGAATTCCATCGTAACCTATCGACTTCCATCG NR- N R-++ 16.
Hibridao somtica assimtrica transferncia parcial do genoma da clula
doadorapara uma clula somtica receptora...1. Eliminao do genoma
doador por radiao e posterior fuso2. Microinjeo Varivel, instvel
e3. Fuso de microprotoplastos contendo aleatria! microncleos com um
ou poucos cromossomos do genoma doador 17. Caracterizao
molecularIdentificao de marcas candidatas 18. Hibridao somtica
assimtricaIdentificar marcadores genticos ligados aosgenes de
interesse, nos respectivos cromossomos. AFLP Gene Vf (Sarna) Xu
& Korban, 2000 19. Mapeamento por Saturao(AFLP) 20.
840marcadores:475 AFLPs235 RAPDs129 SSRs 21. Marcador PrimerGene
ReferenciaRAPDSOPM18900 CACCATCCGTVf Koller et al.,1994OPU01400
ACGGACGTA Vf Koller et al.,1994OPD20500 ACCCGGTCACVf Yang &
Kruger, 1994OPC081100TGGACCGGTGVf Tartarini 1996OPC09900
CTCACCGTCCVf Tartarini 1996OPAL07580CCGTCCATCCVf Tartarini
1996OPAM192200 CCAGGTCTTCVf Tartarini 1996OPA15900 TTCCGAACCCVf
Durham and Korban 1994OPO141700AGCATGGCTCVf King et al.
1998OPAF132000 CCGAGGTGACVf King et al. 1998OPAG051900 CCCACTAGACVf
King et al. 1998OPAG12800CTCCCAGGGTVf King et al.
1998SSRCH05e03For:CGAATATTTTCACTCTGACTGGG VbjM.Gygax (Frey et
al.,2004) Rev:CAAGTTGTTGTACTGCTCCGACH02B10For:
CAAGGAAATCATCAAAGATTCAAG Vr Hemmat et al.,2002 Rev:
CAAGTGGCTTCGGATAGTCHVf1For: ATCACCACCAGCAGCAAAGVf C.Gessler (Frey
et al.,2004) Rev: CATACAAATCAAAGCACAACCCCH02c06For:
TGACGAAATCCACTACTAATGCAVr Baldi et al.,2004 Rev:
GATTGCGCGCTTTTTAACATCH02C02a For:
CTTCAAGTTCAGCATCAAGACAAVr2Patocchi et al., 2003 Rev:
TAGGGCACACTTGCTGGTCCH02B07For: CCAGACAAGTCATCACAACACTCVd Calenge et
al., 2005 Rev: ATGTCGATGTCGCTCTGTTGPrimers especficos VfVfa1 For:
TCTATCTCAGTAGTTTCTATAATTCC Vf Xu & Korban (2002)
Rev:GTAGTTACTCTCAAGATTAAGAACTTVfa2 For: CTCAATCTCAGTAGTTTCTATGGA Vf
Xu & Korban (2002) Rev: CCCCCGAGATTAAGAGTTGVfa3
For:ATATTAGTAGTTTCTATAATCTGAAGG Vf Xu & Korban (2002)
Rev:CCCCCGAGATTAAGAGATGVfa4 For:TATCTCAATCTCAGTAGTAATAGTATC Vf Xu
& Korban (2002) Rev:GACCTTGGAAACCACAATCAL07/SCAR 450 464 For:
TCCTTACTGAGGAGGAAACCAG Tartarini et al. (1999) Rev:
CAAGGGAACTGATCTTTCGTTGARGHARGH 25/CH02B07
For:CAAACATCATCGTAATTTTGACGVd Baldi et al.,2004
Rev:CATACTCTTCATGAGGATAATTCARGH37 For:TGCACGACATTAGCAACACTG
Vr2Baldi et al.,2004 Rev:GAAACAACTTCTTTTGAGAGTTCARGH17
For:TTGCCGACGTTCGTGATGCTVr2Baldi et al.,2004
Rev:GATATCCTTTGTTTGGACAACCARGH
34/CHVf1For:TGTATGACCAGCCGAAGGTGVf1Baldi et al.,2004
REv:CCAGGACAACAATGTACCTCSeleo assistida por marcadoresmoleculares
(SAM) 22. A.C.M. Dantas, N. F. Martins, M. Costa, M.S.Teixeira
Junior. Characterization ofResistance gene analogs in apple
resistant and susceptible cultivars toGromerella leaf spot.Cluster
Acesso NCBIIdentificaoe-value CL1Contig2AAP45181.1 putative disease
resistant protein rga3 [Solanum bulbocastanum]1.49657E-51
CL1Contig2AAT09451.putative NBS-LRR type disease resistance protein
[Prunus 1.89882E-71pbpersica]",39F1/1R1 1F/P3b3F2/13R12F/13R1F G F
GF GF GCL2Contig2AY599223.1 Prunus persica putative NBS-LRR type
disease resistance2.79193E-27 protein (RPM1) mRNA
CL3Contig1AM167520.1 Malus x domestica transposon gene for putative
DNA 7.5496E-22 topoisomerase II, hypothetical protein, putative
CC-NBS- LRR resistance protein, and putative cyclin-related protein
CL6Contig1AC130799.19Medicago truncatula clone mth2-34b13, complete
sequence1.30146E-21 1000 CL6Contig1CAB79834.1 putative protein
[Arabidopsis thaliana]2.1971E-79 CL7Contig1ABE86887.1 Disease
resistance protein; Peptidase aspartic, active site4.05789E-65
[Medicago truncatula] 500 370 CL7Contig1ABE87630.1 Disease
resistance protein; AAA ATPase [Medicago truncatula] 9.04004E-65
CL12Contig1 ABE86887.1 Disease resistance protein; Peptidase
aspartic, active site3.26504E-56 [Medicago truncatula] CL12Contig1
ABE86891.1 Disease resistance protein; Peptidase aspartic, active
site1.62042E-55 [Medicago truncatula] CL12Contig1 AAQ15192.1
resistance protein [Vitis vinifera]4.41283E-53NBS-ARC domain
RNBSCl1|Sequence
RNBS-B-------------------------MQDHG-------TTRKEE-----------------
11 CL12Contig1 AJ581790.1|PCO5817 Pyrus communis partial gene for
putative nucleotide binding site 2.28422E-34 90leucine-rich repeat
disease resistance protein, cloneCl23|Sequence
MRYFLVLDDVWTRDRKKWEQLEAALIQSGAKGSRIVVTTRQHE----------------- 43
RGA03Cl16|Sequence
---------MGPLDACSSGRQCDGYLQNSPLRYFLVLDDVWNDNYSDWDLVRTPFTYGAR
51Cl19|Sequence
---------MGPLDACSSGRQCDGYLQNSPFG--QVVHNVVQN-----------------
32CL12Contig1 ABE87630.1 Disease resistance protein; AAA ATPase
[Medicago truncatula6.37212E-52Cl18|Sequence
---------MITTRDVNVAKFMG-------------------------------------
14Cl7|Sequence------------------------------------------------------------
CL13Contig1 AJ581790.1|PCO5817 Pyrus communis partial gene for
putative nucleotide binding site
3.4056E-55Cl8|Sequence------------------------------------------------------------
90leucine-rich repeat disease resistance protein,
cloneCl17|Sequence
---------MVTTRKKDIA----------------------------------------- 10
RGA03Kinase 2 CL13Contig1 PCO581780Pyrus communis partial gene for
putative nucleotide binding site
1.03544E-33Cl1|Sequence-----------VVRMIGAVTQKIDLERLSEPDCLAIFNRMAFF-SRD--KDSVLESIGEE
57leucine-rich repeat disease resistance protein,
clonecl23|Sequence
-----------VADMMRAKSHMISMGELSEQFCLSIFNHMAFY-GKEVNKSNKFEDISQE
91RGA13cl16|Sequence
GSKVIVTTRNKSVASIVHTGPIHYLKHLSHKDCWLLLRKHAFR-NENPSAHPHLKEIGKQ
110cl19|Sequence
------------------TIPIHDLEKLSDDDCWLLLAKHAFR-NENSSAHPDLEEVGKK 73
CL13Contig1 ABE86887.1 Disease resistance protein; Peptidase
aspartic, active site6.47369E-57cl18|Sequence
------------------AAGVHNLKCMRDDDCLEIFERHAFG-ELNDGKPVNYELIRRK 55
[Medicago
truncatula]","cl7|Sequence-------------------------------------MIKKFHEGRKEEVPEHLNSMRY-
22CL15Contig1 AF516631.1 Malus prunifolia putative disease
resistance gene
analog-like8.3607E-25cl8|Sequence-------------------------------------MIKQFHQGRKEEVTEHLNSMSY-
22NBS-LRR (RGA-I8)cl17|Sequence
------------LYSFEVESRPFEIEPLENNEAWELFSKKAFSSYDNKSCPPELESLAWK 58 *
.: : CL15Contig1 AM075244.1"Rosa hybrid cultivar partial brp36 gene
for putative LZ-NBS-LRR1.75467E-10RNBS-C LRRresistance
proteinCl1|SequenceIAKKCKGLPLAAKTMGSLMRYKQTRKEWQEVLNSKIWELEEVEQQVFKPLLLS--YFDLA
115 CL16Contig1 BAC56785.1 unknown protein [Oryza sativa (japonica
cultivar-group)]"1.95037E-22cl23|Sequence
IVKKCKGLPLAAQTLGSLMHNKTTRREWQDVLSSKMWGLKDVEQEVFQPLLLS--YYDLA
149cl16|Sequence
IARKCNGLPLAAKALGGLLGCNVGYREWSHILNSNLWETLHTDKNVLPSLRLS--YHYLP 168
CL17Contig1 AAQ15192.1 resistance protein [Vitis
vinifera]1.02163E-52cl19|Sequence
IAHKCNGLPLASKTLGGLLGCNLDYKEWNHILESNFWDLPHSDS-VLPSLRLS--YHYLP 130
CL15Contig1 AAR19096.1 NBS-LRR type disease resistance protein
RPG1-B [Glycine max] 1.46353E-46cl18|Sequence
IVEKCRGLPFAARTLGGLLRCKE-KDEWEEILNNKLWNIADKSD-ILPVLKLS--YHYLP
111cl7|Sequence-----EEL---LEMLSTYLKSKRYLVVLDDVWDIKLWQEIRIPLLN----------RHHG
64CL17Contig1 AJ581789.1|PCO5817 Pyrus communis partial gene for
putative nucleotide binding site
3.59679E-42cl9|Sequence-----EEL---LEMLSTYLKSKRYLTVLDDVWDIKLWQEIRIPLLN----------RHHG
6489leucine-rich repeat disease resistance protein,
clonecl17|Sequence
LVEKCEGLPLAVVTLGGLMSSKRSSSEWRSVYNSLNWHLTNNPMLEPMSSILLLSFNNLP 118
RGA02 . * :. : :: . * CL17Contig1 AJ581791.1|PCO5817 Pyrus communis
partial gene for putative nucleotide binding site 5.6158E-41
91leucine-rich repeat disease resistance protein,
cloneCl1|SequencePAVKRCLLYCVIFPKDYLIYKDYLIELWMSQDYLYSKGNTEK--EIIGQRCFDNLAMRSF
173 RGA04"cl23|Sequence
PEVKCCLLYCAIFPKDYQFDKDCLINLWMAQDYLNS---------LDGQAYFDNLVARSF
200cl16|Sequence
TYLKQCFAYLSIFPKDYEFEKENIIQLWMALGLIPQ-AESGQGLEELGGRYFDELLSRSL 227
CL17Contig1 AY369228.1 Malus x domestica NBS-LRR resistance
gene-like protein 2.21901E-40cl19|Sequence
SYLKRCFAYCSIFPKGYELEKENVLLLWVAEGLIPQ-SESGNTMEEVGERYFDELLSRSL 189
ARGH04 genecl18|Sequence
SNLKRCFAYCSILPNDYEFREKQLVLLWMAEGLIQQKPKDNKQMEDLGRDYFRELLSRSL 171
CL17Contig1 AJ581781.1|PCO5817 Pyrus communis partial gene for
putative nucleotide binding site
1.369E-38cl7|SequenceSRIM-------------LTTRKKDIAFYSFEVESRPFE---IEPLEYNE--AWELFSKKA
106 81leucine-rich repeat disease resistance protein,
clonecl8|SequenceSRIM-------------LTTRKKDIASYSFEVESCPLE---IEPLENNE--AWELFSKKA
106 RGA14cl17|Sequence
NRLKPCFLYCAFFPEDCLIKRKRLIRLWIAEGFVEPIDG--VTPEEVAEGYLLELIVRSM 176
23. Hibridao somtica assimtrica Controle do processo datransferncia
genmica parcialusando microprotoplastos,micromanipulao e citometria
de fluxo. 24. Mapeamento Posicional 25. Predio dos aminocidos 26.
Genoma Expresso (Transcriptoma):SUCEST Sugarcane EST Project Cana:
Desafio & Oportunidade 27. A Arquitetura da ResistnciaSequncias
similares conferem resistncia adiversos patgenos como vrus,
bactrias, fungosand nematides.A maioria dos genes de resistncia
(genes R)pertence a famlias multignicas.Genes R so altamente
polimrficos e apresentamdiversas especificidades de
reconhecimento.Grupos vegetais diferentes apresentam genes R
comdomnios e padres (motifs) com significativaconservao.Clusters de
genes R parecem evoluir maisrapidamente do que outras regies do
genoma. 28. Modelo da Interao Gene-a- GenePatgen oInteraoR &
avrProduto ElicitoresavrGene R HRSA JA EtilenoMorte CelulaCalosisr
Genes PR Etileno Genes PR Fitoalexinas SA 29. Interao
Hospedeiro-Patgeno Avr & R NematideFungoBactriaAfter Bonas
&Lahaye Curr. Opn. Transferabilidade & Diversas
localizaesMicrobiol. 2002 Mudana de Funo subcelulares 30. Estrutura
de Genes RA Ser/Thre KinaseBLRR-Ser/Thre-KinaseC NBS-LRR TIR
NBS-DLRRE LRR Nucleot. Binding Site Domniosconservado
Toll-Interleukins de genes Dom. R Transmembrane Dom. Leucine Rich
Repeats 31. Arabidopsis thalianaEstima-se que
contenhaaproximadamente 220 genesque codificam protenas com
odomnios NBS (em 21clusters genmicos e 14 loci)Seqncias TIR ainda
maisabundantesCerca de 600 seqncias no-TIR 32. Estratgias de
Amplificao Diferencial(RGAs = Resistance Gene Analogs)Isolamento de
genes da classe NBSKinase-1a and Transmembrane Region: 550 Bp H2 N
COOH Kinase-1a and Kinase-3a: 340 BpNucleotide-binding Site
(NBS)(Kinase-1a, Kinase-2, and Kinase-3a Domain)Putative
Transmembrane Region Leucine-rich Repeats 33. Obteno e Identificao
de RGAs Amplificao por PCR Clonagem dos Produtos de PCR Mapeamento
de RestrioSeqenciamento AutomticoAnlise de ORF (Open Reading
Frame)Anotao e Identificao do Gene 34. Isolamento de RGAs
(Resistance Gene Analogs): Domnio Kinase (1a) & Regio
Transmembrana Questes em Aberto sobre Genes RMacroevoluo Evoluo em
plantas silvestresComportamento em lenhosas e grupos primitivos 35.
Isolamento de RGAs (Resistance GeneAnalogs):Domnio Kinase 1a &
Kinase 3a 36. Tcnica de AFLP e SSAPRestriction of Genomic DNA
Ligation of AdaptorsPre-Amplification with Adaptor
PrimerAFLPSelective Amplification SSAP(Amplified Fragment Length
Polymorphism) (Sequence-specific Amplified
Polymorphism)32Eco+32GRP1PMse+3PMse0 232 Eco+ 32GRP2PMse+3PMse02
37. Mapeamento Gentico Cruzamento Interespecfico Cicer arietinum
XC. reticulatum ICC4959PI489777(Resistant) (Susceptible) F7 to F8
Recombinant Inbred Lines131 Individuals Fusarium oxysporum fsp.
ciceriResistance Loci Linkage Group 2 38. Marcadores MolecularesDAF
- DNA Amplification FingerprintingRAPD - Random Amplified
Polymorphic DNASSR Simple Sequence RepeatsSTMS - Sequence Tagged
Microsatellite MarkersAFLP - Amplification Fragment Length
PolymorphismSCAR - Sequence Characterized Amplified RegionsISSR -
Inter Simple Sequence RepeatsRGA - Resistance Gene AnalogsSSAP -
Sequence-Specific Amplified Polymorphism 39. Mapa Gentico
GeradoCaractersticas:412 marcadores em 8 grupos de ligaoTamanho
total 2.330 cM 8 grandes + 8Distncia Mdia entre os marcadores: 6,7
cMRelao Mdia Kb / cM = 322 (genoma = 750 pequenos grupos deMb)Ilhas
ou clusters com acmulo de ligao 40. Mapeamento FinoAnlise
Segregante de BulksCaando um Gene EspecficoRespectivamente 12
Linhagens: Bulk Resistente:R14, R18, R22, R29, R53, R56, R72, R74,
R87, R88, R94, R96 Bulk Suscetvel:S11, S25, S32, S37, S40, S49,
S55, S61, S63, S64, S65, S77 Primeira Seleo de Primers: 432 Primers
Testados em 2 Semanas 174 Primers Polimrficos Anlise nos parentais
e em sete indivduos R e S 41. ltima Seleo de MarcadoresR1 R7 S1 S 7
PRPSPR= AParental ResistentePS=Parental suscetvel 500 kb R=indivduo
resistenteS=indivduo suscetvel32 Primers testados B24 Ligados (no
LG 2) 500 kb18 seqenciados 42. Mapeamento Fino do Gene Foc 4 Regio
deresistnciaao redor dos genesFoc 4 e Foc 5 43. Identidade de
Marcadores Seqenciados OP-P08-1 840 bp =
N-Polyacetil-Benzoyltransferase (protenareguladora da sntese de
fitoalexinas) OP-M20-1/3 1103 bp = Disease resistance N
(Nicotiana)-likeprotein from Arabidopsis thaliana (E-value 0.0)
OP-P15-3/1 577 bp = Hypersensitivity response related gene
201isolog from Arabidopsis thaliana (2e-28) P-U17-1 1014 bp =
Pathogenic related thaumatin-like proteinprecursor from Prunus
avium (1e-10) OP-M20-1/2 1045 bp = MUTS2 DNA mismatch repair
protein fromArabidopsis thaliana (7e-09) OP-P06-1 784 bp =
Retrotransposon-like gag-protein sequence fromNicotiana tabacum
putatively linked to black root rot resistance in -04 44. Sintenia
e Colinearidade 45. SEQUENCIAMENTO MOLECULARBreve histrico: Gilbert
e Sanger: 70s: 20 bases em dois anos Seqenciamento manual Gis de
poliacrilamida Radioistopos Seqenciamento automticoSlab gelCapilar
2001: Genoma humano Sanger Institute Celera Genomics 500 bases /
segundo 46. Como ???Atravs de sequenciamento de DNA Determinao da
sua seqncia nucleotdica (ACGTs). Utilizar uma tecnologia de
sequenciamento : Sanger sequencing Pirosequenciamento 47.
Sequenciamento de DNADeterminar a seqncia nucleotdica (ACGTs).A
tecnologia de sequenciamento atualexige que se quebre o DNA em
pequenos fragmentos de cerca de 2.000 pares de bases (shotgun),
exigindo a montagem dos fragmentos. 48. TranscriptomaSeqenciamento
de material gentico,DNA e RNA, de organismo e anotao deestruturas
dos genes encontrados.Ex.: Seqenciamento do genomahumano; do
cromossomo IV de S.cerevisiae; de ESTs de diferentesespcies de
Eucalyptus. 49. Tipos de ProjetosDNA seqenciamento de estruturas
dogenoma ou de trechos destas.ESTs sequenciamento de cDNA, feitos
partir de bibliotecas de mRNA. Ex.:ESTs de cana-de-acarSAGE
sequenciamento de fragmentosem torno de 20 pb do cDNA
(especificocom conhecimento) 50. Sequenciamento DNASequenciamento
de DNA, feito de formaaleatriaInformaes sobre regies codantes
(genes) epromotoresGera sequncias em regies inter-gnicas (aprincpio
sem nenhuma funo) 51. Sequenciamento de mRNAInformao direta sobre
os genes e tambmsobre a expresso gnicaMas genes pouco expressos so
mais rarosde serem sequenciados por essa tcnica 52. SAGESAGE
fornece informao sobre aexpresso gnica de forma mais eficienteque
ESTs, mas til apenas quando ogenoma completo do organismo
forconhecido A situao ideal para um projeto genoma sequenciar ambos
DNA e cDNA 53. Serial Analysis ofGene Expression(SAGE) 54. Serial
Analysis of Gene Expression(SAGE)Vantagens:Comparvel ao
microarray;Permite uma anlise digital dos resultados;Permite
identificar pequenas variaes dequantidade do transcrito;No depende
de informao anterior deseqncia.Desvantagens:Pode apresentar
possveis problemasdurante a realizao da tcnica. 55. Estratgias de
Sequenciamento DNA Shotgun de genoma inteiro Shotgun em pedaos do
genoma clonados em BACs Primer walking ESTs RNA oriundos de
diferentes tecidos ou condies Biblioteca subtrativa 56.
Sequenciamento por shot-gunParte de bibliotecas genmicas
representativasSeqenciamento aleatrio de clonesMontagens das
seqncias em contigsMontagem de scaffoldsFinishing 57.
Shot-gunsequencing 58. Shotgun do genoma inteiroQuebrar em pedaos
aleatrios ~2000pb(shotgun)readsclonar em vetor sequenciamento 59.
Reconstruo do DNA original a partir dofragmentos (clusterizao)reads
Sequncia consensu (DNA original)A reconstruo feita a partir de
sobreposio dos fragmentos 60.
montagemAGATATGAGAGACACAGAAATTTCCGGACACAGAAATTTCCGATAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCAAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAGGACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCC
TTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACC TACCCCAAATACCCTAAGATTA 61.
GACACAGAAATTTCCGATAAGATATGAGAGACACAGAAATTTCCG
ATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCAAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAGGACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCC
TTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACC
TACCCCAAATACCCTAAGATTAAGATATGAGAGACACAGAAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACCCTAAGATTA
62. GACACAGAAATTTCCGATAAGATATGAGAGACACAGAAATTTCCG
ATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCAAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAGGACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCC
TTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACC TACCCCAAATACCCTAAGATTA
ContigAGATATGAGAGACACAGAAATTTCCGATACAAACCTGGTAAGACAGCTAAGGTTAGGACGACTTTAGGACCGATACCCCAAATACCCTAAGATTA
63. Os reads so agrupados em
contigsACGTTGCCTAGTAGATGCTAreadsGATGCTAACGTTGCCTAGTAGCCTAGTAGATAACGTTGCCTAGTAGCTclusterizao
Contig (contguo)ACGTTGCCTAGTAGATGCTAACGTTGCCTAGTAGCT 64.
Visualizando o ContigContigReads 65. Montagem do scaffold
Cosmdeos/BACScaffold 1contigs Scaffold 2 66. Evoluo do projeto 67.
Anlise de transcriptomaExpressed Sequence TagsSerial Analysis of
Gene ExpressionMicroarranjos 68. Expression Sequences
TagsAAAAAAAAATTTTTTTTTRTPCRClonagem Seqenciamento 69. Genes
diferencialmente expressosGenes exclusivos de uma formaBiblioteca
de miclioBiblioteca de levedura Genes comuns 70. Expressed sequence
tags (ESTs) Extrair RNA de diferentes tecidos/condies Sntese de
cDNA5 EST3 EST clonar em vetor sequenciamento 71. 250200150100 72.
Serial Analysis of Gene Expression 73. O SAGE se baseia na anlisede
pequenas seqnciasrtulo de cDNA (10-14 pb)concatenados.O processo de
concatenaomantm a proporcionalidadedos rtulos.O seqenciamento
maciodos rtulos permite aquantificao da expressode cada rtulo. 74.
Shotgun de pedaos do genomaQuebrar em pedaosaleatoriamente
desde50Kpb at 300KpbClonar em BACs e sequenciar apenas as pontas de
cada fragmento~800 bp ~800 bpQuebrar em pedaos de2000pb clonar em
vetor e sequenciar os fragmentos 75. Shotgun do genoma inteiroDNA
genmicoQuebrar em pedaos aleatrios ~2000pb(shotgun)Ligao do
adaptador e separao em fitasimples 76. Primer WalkingVector Clone
to sequencePrimerSequence New Sequence PrimerRepeatSempre desenhar
o primer de forma que a sequncia amplificada tenhasobreposio com a
anterior (tipicamente 100 pb de sobreposio) 77. Chemical
SequencingMtodo de Maxam e GilbertDNA pode ser sequenciado , atravs
de uma marcao terminalque quebra a molcula, em cada base do DNAO
tamanho dos fragmentos ir determinar posteriormente aposio das
bases.Para G = tratamento com dimetil sulfato metilaPara G+A =
tratamento com cido frmico que enfraquece asligaes glicosdicas,
protonando os nitrognios dos anis depurinaPara T+C = tratamento com
hidrazinal cliva anis de timina ecitosinaPara C = tratamento com
hidrazina na presena de NaCl. NaCl 78. Chemical Sequencing - Mtodo
de Maxam e Gilbert G+AGCC+TCACCTTGGCAA 79. Tecnologias atuais
parasequenciamentoSanger sequencing PNAS 74 (1977), n. 12,
5463-5467 Sequenciador MegaBACE (1Mpb/24 horas)Pirosequenciamento
Science 281 (1998), n. 5375, 363-365 Nature 437 (2005), 362-7
Sequenciador 454 (150Mpb/24 horas) 80. Seqenciamento de
DNAFrederick Sanger (1918-)Graduado em Cincias em CambridgeEstudou
protenas insulina1943 tcnicas de sequenciamentoPrmio Nobel de
medicina e fisiologia em 1980J. Mol. Biol. v.94, p. 441-448, 1975
81. Dideoxy Sequencing, Mtodo Sanger (1977)Terminao de cadeia com
didesoxirribonucleosdeotrifosfato, ou ainda dideoxinucleotdeo o
mais empregado, permitindo o sequenciamentode DNA tanto de fita
simples, como de fita dupla,desnaturado.Neste mtodo o DNA
hibridizado com umoligonucleosdeo ou iniciador (foward ou
reverseseparadamente), na presena dos quatrodesoxinucleotdeos
(dATP, dCTP, dGTP e dTTP),um dideoxinucleotdeo 32P-dATP ou 35S-dATP
eDNA polimerase. 82. PRE PA RA O DO DNA (C LONA GE
M)PlasmdeoClivagem com Insero denuclease defragmentorestriode
DNAMultiplicaovia colniasbacterianas 83. Sanger Sequencing
anelamento dos primers desnaturao 84. ddATP32ddCTP32 Repetidos
ciclos de:DNA polimerase DNA polimerasedesnaturao,DNADNA A, C, G e
TA, C, G e Tanelamento extensoddTTP32ddGTP32DNA polimerase DNA
polimeraseDNADNA A, C, G e TA, C, G e T A C TG
InterpretaoCACCTTGGCAA 85. Filme de Sequenciamento Exemplo de gel
utilizado nos seqenciadores de gel (ex.: 377). A diferena de
tamanho permite a separao dos grupos de fragmentos, eesta
distribuio normal da passagem dos fragmentos Representada pelo
eletroferograma (ou cromatograma) de cada seqncia(read). 86.
Eletroforese dos produtos de amplificaoda reao de sequenciamento
87. Mtodo de SeqenciamentoAutomatizadoSubstituio damarcao
radioativapela marcao comfluorocromosMais segurana,rapidez e
economiaMarcao dasquatro bases em um mesmo tubo 88. PROJETOS GENOMA
89. SEQUENCIAMENTO DE DNAComponentes da reao: DNA tampo apropriado
primer enzima (Polimerase) dNTPs normais dNTPs (Menor quant.)GGAAC
T+C T 90. primer polimerase templatedNTPslabelled ddNTPs 91.
ATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAAATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAG
GATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCCATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCT
TATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCTAAATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCTAC
CATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCTACGGATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCTACGA
AATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCTACGACCATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCTACGACG
GATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCTACGACGTTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCTACGACGTC
CATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCTACGACGTCTTATCTCGTAGCTATCTCGTAGCTAGCTACGACGTCTA
ATAGAGCATCGATCGATGCTGCAGATGATGCTAGCATCGGCTAGGCGACG 92.
Sequenciamento de DNAT G C A C G T G A C A G T Fita MoldeG T G C AG
T G C A CG T G C A C TG T G C A C T G 93. Eletroforese capilar e
deteco fluorescenteSequnciaAdaptado de Belo,2003 94. Incio Receber
Processar Anotar DepositarFim 95. O programa PHRED l o cromatograma
identificando e dando uma notapara cada base que forma a sequncia
:0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40 ...
Genome Research 8 (3) (1998), 175-185 96. background- A identificao
dos picos feita atravs de uma transformada de fourier do sinal- A
nota ligada com a resoluo entre os picos vizinhos e a altura do
background 97. Analisando o GenomaRegio de qualidade alta Picos bem
definidos e grandes. Linha de base boa. Distncia entre picos
anterior e posterior constante. 98. Regio de qualidade mdia poucas
ambigidades Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho mdio.
Linha de base boa a razovel. Distncia entre picos anterior e
posterior razovel. 99. Regio de qualidade baixa baixa
confiabilidade Picos mal definidos e de tamanho pequeno. Linha de
base confusa. Distncia entre picos anterior e posterior
inconstante. 100. Sequenciamento de seqncias da ordem de 500 pbOnde
q a nota phred e P a probabilidade encontrar uma baseerrada :- Nota
phred = 20 => 1 base errada a cada 100 (99%)- Nota phred = 30
=> 1 base errada a cada 1000 (99.9%) 101. PirosequenciamentoFita
simples Cmera de CCDReao dedegradao Filme sequenciamentoScience 281
(1998), n. 5375, 363-365 102. ProtocoloO adaptador permite que o
DNA se ligue em grnulos minsculos(dimetro de 28 mm). Apenas um DNA
ligado em cada grnulo; Os grnulos so envolvidos em gotas de leo que
contm todosos reagentes necessrios para amplificar o DNA; Cada gota
contendo o grnulo mantida isolada para evitarcontaminaoProduz 10
milhes de cpias numa reao depirosequenciamento; Um pmol de DNA numa
reao de piroseq. produz 1011molculas de ATP gerando mais de 109
ftons, num comprimentode onda de 560 nm, e num perodo de 3-4
segundos.Facilmente detectado por uma cmera de CCD Nature 437
(2005), 326-327 103. O sequenciador 454 Cmara de fluxo contendo as
amostras e as fibras pticas (1,6 milhes/slide) Bombeamento Cmera de
de fludos CCDComputador Nature 437 (2005), 376-380 104.
PirogramaLinearidade mantida at homopolmeros de 8 nt 105. So
obtidas seqncias de at 100-120 b 106. Sanger x
PirosequenciamentoSANGERPirosequenciamento Depende de clonagem
embactria (2 semanas de No h clonagemtrabalho) 1 milho de pb em 24
horas 25 milhes de bp em 4 horas(100x mais rpido) Reads de ~700 bp
Reads de ~100 bp Clones de fita dupla permitem Fragmentos fita
simples noseqenciamento em ambaspermitem seqenciamento emdirees
(facilita orientao eambas direesmontagem) 6 meses de
sequenciamento,24 hs/dia, para sequenciar o 24 horas para
sequenciar ogenoma de um fungogenoma de um fungoConcluso : a unio
faz a foraPNAS 103 (2006), 11240 107. Caminhos map (Mbp)YACsBACs
ormap (200kbp)Cosmidsm13, plasmidsequence (kbp) 108. Produto
gnicoTransposonGene hipotticoGene preditoContig Gene 1Gene
2....actctagt.... Dados de outros genes e genomas permitem anotar
uma funo e produto para o Gene 2 com o auxlio do programa BLAST. A
presena do suposto Gene 1 foi assinalada Regies repetitivas como
transposons por um algoritmo que busca por ORFs podem ser anotadas
com o auxlio de significativas, enquanto no se conhece seu
programas como BLAST, RepeatMasker e produto (protena), considerado
hipottico. outros. bioinformtica Receber Processar Anotar Depositar
109. Predio de genes em procariotosSinais na sequncia de DNA de um
procarioto quepodem ser utilizados na predio de genesRegies da
sequncia de DNA de um procarioto queapresentam diferenas nas
anlises de contedo GC ecodon usage 110. Contedo GC - Regies
condantes (que codificam um gene) tem alto contedo GC(rica em
nucleotdeos G e C) Regio do DNA que contm um geneContedo GC elevado
nessa regio- Regies rica em GC so mais difceis de sofrerem mutaes
(ligao qumica forte) 111. ORF open read frameACGTG TAACA CTGAG
ACTAT AGGTG TGAAA A TC A T C G G GTA ACT GAC TAGGTGAAT TAA
CTGACTAGGTGA- Cada grupo de nucleotdeos em trincas
consecutivasconstituem um read frame- Existem 3 diferentes read
frames na direo 5 -> 3 e mais 3na direo contrria (outra fita)-
Uma sequncia de trincas que no contm um stop dentro chamanda de
open read frame (ORF) 112. -A probabilidade de uma sequncia
aleatria de n nucleotdeosno conter um cdon de stop (61/64)n- Quando
n=50 a probabilidade de ter um cdon de stop no meio dasequncia de
92%- Normalmente usa-se, para procariotos, ORFs de tamanho
n>=60para definir possveis candidatos a genes 113. Cdon
usage-Baseado no fato que o uso do cdon diferente para cada
organismo- Regies codantes seguem o codon usage do
organismodiferentemente das regies intergnicasL, S, R => 6
combinaesV, P, A, G => 4 combinaesI,* => 3 combinaesF, Y, H,
Q, N, K, D, E, C => 2combinaesM, W => 1 combinaes 114. Clculo
do cdon usagehttp://www.kazusa.or.jp/codon/ 115. - A tabela de uso
do cdon do organismo facilmente obtida usando programas como codonw
ou cusp e usando como entrada sequncias em nucleotdeo que codificam
protenas e no frame correto (tipicamente obtidas via similaridade
entre a sequncia e a
protena)http://bioweb.pasteur.fr/docs/EMBOSS/cusp.html
http://codonw.sourceforge.net/ 116. Sinais no promotor One type of
RNA polymerase.- Com o alinhamento de sequncias de promotores
ortlogos possvel reconhecer regies que se mantm conversadas
durantea evoluo, observem que as distncias tambm so conservadas
117. Positional Weight MatrixFor TATA box: 118. Juntando
tudo-Promotor e incio de transcrio so sinais obtidos atravs de
alinhamentos entrepromotores ortlogos (treinamento feito usando
sequncias de organismosprximos)- Regies codantes (exons) so obtidos
por codon usage (treinamento feitousando regies do DNA que possuam
com similaridade forte com protenasconhecidas) e contedo GC- Outro
vnculo importante a ordem dos sinais. No tem sentido um sinal
deincio de transcrio no meio do exon 119. Predio de genes em
eucariotos Gene length: 30kb, coding region: 1-2kb Binding site:
~6bp; ~30bp upstream of TSS Long Introns Average of 6 exons, 150bp
long 120. Identificando splice sites (juno ntron-exon)- Com o
alinhamento entre sequncias de cDNA e DNA possvel identificar as
regies dos ntrons 121. - Com o alinhamento global entre os ntrons
constroem-se amatriz de posio com os padres de splice sites, branch
site etamanho mdio dos ntrons 122. Juntando tudo-Promotor e incio
de transcrio so sinais obtidos atravs de alinhamentos
entrepromotores ortlogos (treinamento feito usando sequncias de
organismosprximos)- Regies codantes (exons) so obtidos por codon
usage (treinamento feitousando regies do DNA que possuam com
similaridade forte com protenasconhecidas) e contedo GC- Informaes
sobre os ntrons so obtidas atravs de alinhamento do DNA comESTs-
Outro vnculo importante a ordem dos sinais. No tem sentido um sinal
deincio de transcrio no meio do exon 123. Sp=TP/(TP+FP)- Usando
genes conhecidos e de preferncia no usados no conjunto
detreinamento podem ser usados para medir a performance do preditor
124. - Usando genes conhecidos e de preferncia no usados no
conjunto detreinamento podem ser usados para medir a performance do
preditor 125. PerformanceSn=TP/(TP+FN) Sp=TP/(TP+FP)KORF, I. Gene
finding in novel genomes. BMC Bioinformatics 5:59. 2004.
