BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL AULA 2010 Carmen Hidalgo.

EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE SANGRE COMPLETA.MATERIAL:

VORTEX BAÑO MARÍA o TERMOMIXER CONFORT de Eppendorf® con

termobloque para tubos de ensayo micro de 1,5 ml (Termobloque calor/frío). Dice Rubén que nos vende el suyo viejo. Necesitamos +56ºC.

Gradilla con eppendorf de 1,5 y de 0,5 ml. Micropipetas de 200 y puntas con filtro de 200 microlitros. Micropipeta de 1000 ¿? Guantes desechables, batas, gafas protectoras Microcentrífuga para eppendorf. Probeta graduada (50 ml) Etanol (96–100%) Sangre total con EDTA en otra gradilla Mini Kit para extracción de ADN de la marca QIAGEN que contiene:

Elution Buffer AELysis Buffer ALProtease Solvent PSQIAGEN Protease QPWash Buffer AW1 (concentrate)Wash Buffer AW2 (concentrate)

QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Handbook 01/2004:

Preparación de reactivos y tamponesPreparación de la proteasa QIAGENAñada 1,2 ml de disolvente de proteasa (PS) al vial de proteasa QIAGEN (QP) liofilizaday mézclelos bien. Para evitar que se forme espuma, mézclelos invirtiendo el vial repetidasveces. Compruebe que la proteasa QIAGEN (QP) se ha disuelto por completo.No añada la proteasa QIAGEN (QP) directamente al tampón de lisis (AL).

Los BUFFER DE LAVADO hay que prepararlos

Preparación del tampón de lavado 1 Usando una probeta graduada, añada 25 ml de etanol (96–100%) al frasco quecontiene 19 ml de tampón de lavado 1 (AW1) concentrado. Guarde el tampón delavado 1 (AW1) reconstituido a temperatura ambiente (15–25°C).Mezcle siempre el tampón de lavado 1 (AW1) reconstituido invirtiendo el frascovarias veces antes de comenzar el procedimiento.Preparación del tampón de lavado 2Usando una probeta graduada, añada 30 ml de etanol (96–100%) al frasco quecontiene 13 ml de tampón de lavado 2 (AW2) concentrado. Guarde el tampón delavado 2 (AW2) reconstituido a temperatura ambiente (15–25°C).Mezcle siempre el tampón de lavado 2 (AW2) reconstituido invirtiendo el frascovarias veces antes de comenzar el procedimiento.Preparación del tampón de elución (¿Se puede sustituir por agua/ acetato de etilo? Preguntarle a Rubén)

El kit incluye una botella de tampón de elución (AE). Para evitar contaminar el tampónde elución (AE), es muy recomendable utilizar puntas de pipeta con filtro para sacarlodel frasco, y volver a cerrar el frasco inmediatamente. Después de abrir un frasco detampón de elución (AE) por primera vez, guárdelo a 2–8°C. Deje equilibrar el tampónde elución (AE) a temperatura ambiente (15–25°C) cada vez que vaya a usarlo denuevo.

APUNTES DE LA TÉCNICA:

PROCEDIMIENTO.• Rotulamos eppendorf de 1,5 ml1. 180 µl de sangre total en la gradilla. Con EDTA Para que no se coagule. Se

incuban con 20µl de PROTEINASA K (proteasa QIAGEN –QP-) y con 180µl de BUFFER AL (TAMPÓN DE LISIS) a 56ºC durante 10 min. En el termobloque, agitando.

• No añada la proteasa QIAGEN (QP) directamente al tampón de lisis (AL).• Agitar, vortear (en el vorter) y marcarlos). Cierre la tapa y mézclelo agitándolo

en el vortex de forma intermitente durante 15 segundos. Para que la lisis sea eficaz es esencial que la muestra y el tampón de lisis (AL) se mezclen perfectamente hasta obtener una solución homogénea.Como el tampón de lisis (AL) es muy viscoso, asegúrese de añadir el volumen correcto del mismo ya sea pipeteándolo con mucho cuidado o utilizando una pipeta adecuada, como por ejemplo una Eppendorf de varios pasos u otra pipeta equivalente.

2. Lo retiramos y añadimos 200 µl de ETANOL PURO al 100% de la nevera a -20ºC. (Total ¿600 microlitros?). Filtramos impurezas, lo agitamos en un vorter y lo sacamos con una micropipeta de 1000 µl para ponerlo en una columna QIAamp sin tocar el filtro. Lo centrifugamos durante 1 minuto a 13.000 rpm.

3. Después de centrifugar lo pasamos a otra columna. Cambiamos al tubo lo de arriba, lo de abajo se tira. Abrimos con cuidado la columna y añadimos 500uL de BUFFER AW1 y lo centrifugamos durante 1 minuto a 13.000 rpm.

4. A continuación volvemos a desechar el tubo y pasamos la columna al siguiente y añadimos 500uL de BUFFER AW2 y lo volvemos a centrifugar, pero esta vez a 13.000 rpm durante 3 minutos. Se queda con dos tapones

5. Ahora la columna la pasamos al Eppendorf de 1,5ml, previamente identificado, y añadimos 200uL de BUFFER AE (agua ¿con Acetato de Etilo?). Incubamos a TA 2 minutos y lo centrifugamos durante 1 minuto a 13.000 rpm.

6. Finalmente desechamos la columna y nos quedamos con el Eppendorf que contiene la muestra de DNA, y lo congelamos a -20ºC. (O ponemos en marcha la Electroforesis).

PROTEINASA K--- Rompe las cadenas de proteínas, y junto con el BUFFER AL

hacen la lisis.

BUFFER AL--- Buffer de lisis

AW1 y AW2--- Soluciones de lavado diluidas en ETANOL.

BUFFER AE--- Desprende el ADN

MONTAR LA ELECTROFORESIS

PROPUESTA DE ELECTROFORESIS PARA EL AULA.A. GEL DE AGAROSA Y TINCIÓN CON FAST BLUE.

Preparamos la solución de trabajo con 80 ml de gel de agarosa + 50 microlitros del colorante.

REACTIVOS:

Gel de Agarosa: 0,8 % de Agarosa: 80 ml de volumen total 0,64 g. de Agarosa: y hasta 80 ml de TBE 0,5 x (Trisboro Edta Buffer. Lo

venden al 10x, lo diluiremos hasta 0,5 x)

50 µ l de Colorante Fast Blue (líquido azul) a. 900 aguab. 100 TBEc. 666 microlitros del concentrado de Fast Blue

Tampón de carga: Pedírselo a Rubén

MATERIAL Y EQUIPO: Microondas Guantes de goma Balanza que pese gramos … centigramos (dos decimales) NO TOCAR (¿Qué

significa aquí no tocar? No lo sé, lo ponía en la libreta.VENDEN TODO JUNTO: Casting de distintos tamaños para electroforesis Cubeta de electroforesis Fuente de alimentación Nivelador

1. Gel de Agarosa más 50 microlitros de colorante.

En la gradilla tendremos 3 tubos (cada uno, cada muestra):• columna de filtro marcar (CA: Carmen)• dos tubos vacíos del kit

En total tenemos 4 muestra para cargar (4 alumnas: Marina, Carmen, Elena y ….)

2. Cargar 5 gotas de 5 microlitros de Tampón de carga (pedírselo a Rubén) más concentrado + 10 microlitros de la muestra. Mezclar bien con el tampón de carga. Poner la mezcla en el pocillo ..y a correr a 150 V

• Control de PM sin tampón de carga ¿?• Cartulina negra para observar mejor los pocillos3. Conservar en agua o en gliceraldehídoVer los dibujos en la libreta

Mezclar bien con el tampón de carga

-ánodo

+cátodo