Upload
yassier-anwar
View
3.303
Download
4
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Citation preview
Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen Penyandi
Metallothionein dari Kedelai Kultivar Slamet
YASSIER ANWARP055040011
Pembimbing1. Dr. Ir. SUHARSONO, DEA2. Dr. Ir. UTUT WIDYASTUTI, M.Si
Latar Belakang
Kebutuhan kedelai dalam negeri2 juta ton/tahun
Produksi kedelai dalam negeri0.8 juta ton/tahun
Impor kedelai1.2 juta ton/tahun
Peningkatan produksi kedelaidengan
INTENSIFIKASIEKSTENSIFIKASI
Potensi lahan + lahan asam ± 20 juta ha
BPS, 2007
Latar Belakang
Kedelai Slamet
Sumber gen untuk mekanisme toleran Al
Kultivar lokal yang toleran terhadap tanah asam
Studi MT Pada Kedelai
Metallothionein
Protein pengikat ion logam, mengandung banyak asam amino cysteine, berat molekul rendah & ditemukan pada berbagai organisme dan berbagai tingkat jaringan/organ Berperan dalam detoksifikasi logam-logam yang dapat bersifat toksik
Terlibat dalam proses fisiologis, proliferasi, aktifitas dari metalloenzim, dan faktor transkripsi Memiliki karakteristik yang unik dari komposisi asam amino cysteine
Berperan dalam mekanisme homeostasis logam-logam esensial Berperan dalam menanggani & mencegah kerusakan akibat cekaman oksidatif
Mengisolasi dan mengkarakterisasi fragmen cDNA dari gen penyandi metallothionein tipe 2
dari G. max (GmMt2) kultivar Slamet
Tujuan Penelitian
Tempat PenelitianBIORINBMST
(PSSHB IPB)
Waktu PenelitianSeptember 2007 s/d April 2008
METODOLOGI PENELITIAN
Tempat penyisipan
2. pGEM-T Easy1. Tanaman Kedelai
Bahan
3. E. coli galur DH5α4. Primer spesifik MF & M7R Primer aktin ActF & ActR
Isolasi RNA total
Sintesis cDNA total
Verifikasi cDNA
Isolasi Fragmen cDNA Mt2
Pengklonan Fragmen cDNA GmMt2
Seleksi E. coli pembawa plasmid
Isolasi plasmid
rekombinan
Analisis cDNA
Sisipan
Sequensing
Analisis danKarakterisasi
Simpulan
Desain Primer
Metode Penelitian
Bahan Absorban pada Rasio λ260/λ280
Total RNA (μg/g sampel
segar)λ260 λ280
1g ujung akar 0.223 0.118 1.88 187Rasio 1.8 s/d 2 menunjukkan kemurnian tinggiTidak terkontaminasi oleh protein
Hasil Penelitian
Isolasi RNA
Elektroforesis RNA total
28S 18S
1.Integritas RNA tinggi
2.Bersih dari Genom
RT
RT-PCR
1. cDNA terbentuk
2. Bebas DNA
1. Terdapat fragmen GmMt2
2. Ukuran 250 pb
mt2 M
1000 pb
250 pb
M Akar
1000 pb
500 pb
Kloning-transformasi dan Verifikasi
vektor pGEM-T Easy
M Mt2
1000 pb
250 pb
PCR Klon Rekombinan
Koloni biru
Koloni putih
Hasil Transformasi
3000 pb
1000 pb
250 pb
p M
EcoRI
Fragmen GmMt2 berhasil diklonkan ke E. Coli DH5α
Plasmid Rekombinan
pGEM-T Easy + GmMt2
Pensekuenan Fragmen GmMt2
Sequence ID: GmMt2
atgtcttgctgtggaggaaactgcggatgtggatctggctgcaagtgcggcaacggttgtggaggttgcaaaatgtaccctgacttgggattctccggcgagacaaccacaactgagacttttgtcttgggcgttgcaccggcgatgaagaatcagtacgaggcttcaggggagagtaacaacgctgagaacgatgcttgcaagtgtggatctgactgcaagtgtgatccttgcacctgcaagtga
Fragmen GmMt2 berukuran 246 pb
Deduksi Asam Amino
81 asam amino
Open Reading Frame
Analisis Restriksi
Tidak mengandung situs restriksi dari MCS pGEM-T Easy
BLASTn
BLASTp
cDNA utuh GmMt2 telah berhasil diisolasi dari G. max L. dengan ukuran 246 pb.
Fragmen GmMt2 mempunyai urutan nukleotida dan asam amino yang sama dengan AtMt2A dari A. thaliana.
Motif urutan asam amino GmMT2 terdiri dari Cys-
Cys, Cys-X-Cys dan Cys-X-X-Cys.
GmMT2 diduga memiliki peran yang sama dengan AtMT2A yaitu mengikat dan mendetoksifikasi unsur logam dan membatasi kerusakan oksidatif pada tanaman
Simpulan
Terima Kasih
1. Proyek HPTP batch III (atas nama Dr. Ir. SUHARSONO, DEA)2. Dr. Ir. SUHARSONO, DEA 3. Dr. Ir. UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO,
M.Si 4. Dr. Ir. MUHAMMAD JUSUF, DEA5. Rekan-rekan di Lab. BIORIN dan BMST
1 g sampel digerus dengan N2 cair
+ 800 μl TRIzol
Inkubasi 3 menit,T ruang
+ 200 μl Chloroform
Inkubasi 5 menit, T ruang
9000 rpm, 6˚C, 15 menit
Fase cair dipindahkan,+ 500 μl Isopropyl alcohol
Pelet + 500μl EtOH 70%
Inkubasi 10 menit,T ruang
9000 rpm, 6˚C, 10 menit
5700 rpm, 6˚C, 5 menit
Pelet dikeringkan + 30μlddH2O-DEPC treated
Kuantifikasi (Spektofotometer)Kualifikasi (Elektroforesis)
Isolasi RNA Total
No Bahan Kons. Jumlah (μl)
1 RNA 5μg/μl 10
2 Buffer RT 1X 4
3 Primer Oligo (dT) 20 pmol 1
4 Dithiotreitol (DTT) 10 mM 2
5 RT enzyme (Invitrogen) 2U/ μl 0.2
6 dNTP mix 2 mM/μl 2
7 ddH2O(DEPC) - 0.8
Final Volume 20
No Suhu (˚C) Waktu (menit)
1 30 10
2 45 50
3 95 5
4 15 10
Sintesis cDNA Total
No Bahan Kons. Jumlah (μl)
1 Template cDNA ( ± 200 ng)
10 ng/μl 1
2 Buffer Taq 10x 1
3 Primer ActF 10 pmol 0.5
4 Primer ActR 10 pmol 0.5
5 dNTP mix 2 mM/μl 1
6 DMSO 4 % 0.4
7 Taq Polymerase 5 U/μl 0.1
8 ddH2O - 5.5
Volume final 10
No PCR Suhu Waktu
1 Pra-PCR 95˚C 5 menit
2 Denaturasi 94˚C 30 detik
3 Annealing 55˚C 30 detik
4 Ekstensi 72˚C 1.5 menit
5 Siklus - 37 siklus
6 Final-PCR 72˚C 5 menit
7 Post-PCR 15˚C 5 menit
Primer ActF : ATGGCAGATGCCGAGGATAT ActR : CAGTTGTGCGACCACTTGCA
PCR Aktin
Searching sequences of Mt2
Clustering of Mt2
FASTA Format a Group
Primer3(http://www.primer3.com)
Find consensus sequence(BIOEDIT versi 7.0.5.2)
Selection of Primer
Spesific Primer of Mt2
Primer MF :TCGAGAAAAATGTCTTGCTGTG M7R :CCTTGCACCTGCAAGTGAAG
Desain Primer Spesifik
No Bahan Kons. Jumlah (μl)
1 Template cDNA ( ± 200 ng)
10 ng/μl 2
2 Buffer Taq (10x) 1x 2
3 Primer MF 20 pmol 1
4 primer M7R 20 pmol 1
5 dNTP mix 2 mM/μl 2
6 DMSO 4 % 0.8
7 Taq Polymerase 5 U/μl 0.2
8 ddH2O - 11
Volume final 20
No PCR Suhu Waktu
1 Pra-PCR 95˚C 5 menit
2 Denaturasi 94˚C 30 detik
3 Annealing 58˚C 30 detik
4 Ekstensi 72˚C 1.5 menit
5 Siklus - 37 siklus
6 Final-PCR 72˚C 5 menit
7 Post-PCR 15 ˚C 5 menit
Primer MF :TCGAGAAAAATGTCTTGCTGTG M7R :CCTTGCACCTGCAAGTGAAG
Isolasi Fragmen cDNA GmMt2
No Bahan Kons. Volume (μl)
1 Produk PCR ± 5 ng 3
2 pGEM-T Easy ± 10 ng 1
3 Buffer T4 DNA Ligase
10x 1
4 DNA ligase 1U/μl 0.5
5 ddH2O - 4.5
Volume final 10
Ligasi Fragmen Mt2 Sel kompeten +
hasil ligasi
Di es 20 menit
Kejutan suhu 42°Cselama 45 detik
Inkubasi 37°C;250rpm; selama 20menit
+ 100μl YT
Di es 5 menit
Sebar di mediaLA+ Ampisilin
Inkubasi 38°C 16 jamSeleksi Biru-Putih
Pengklonan & Seleksi
Inkubasi 4°C;overnight
E. Coli DH5α
Blue-white selection
Kultur klon semalam
@1.5ml
12000rpm 10‘ 4°C
12000rpm 5‘ 4°C
150µl buffer resuspensi, vortex
150µl buffer lysis, bolak-balik
150µl buffer netralisasi
pelet
①②
③
12000rpm 5‘ 4°C vortex
fase aqueous
NaOAc 3M etOH abs
2xvol
Inkubasi -20ºC, 2 jam
12000rpm 5‘ 4°C
pelet
Cuci dg etOH 70%
12000rpm 10‘ 4°C
Kering vacuum 30-45’
Dilarutkan dlm TE/ddH2O, inkubasi semalam
+ RNase 0.1x vol
Plasmid
cek
Isolasi DNA Plasmid
No Bahan Kons. Volume (μl)
1 Plasmid rekombinan 13 ng/μl 15
2 Buffer EcoR1 (10x) 1X 2
3 Enzim EcoR1 10 U/μl 1
4 ddH2O - 2
Volume final 20
Analisis Plasmid Rekombinan
Inkubasi 37°C; 2 jam
Analisis Situs Restriksi http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html
Translasi (deduksi asam amino) http://www.expasy.ch/tools/translate
BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast
ORF http://www.softberry/bestorf/htm
Domain http://www.myhits/motifscan/htm
Analisis Sekuen
Hasil Sekuen
Biomolekuler Website
Cystein
Verifikasi dengan Aktin
450 pbcDNA murni Ekson 1 Ekson 2
Ekson 1 Ekson 2Intron90 pb 540 pb
cDNA tidak murni Template: DNA genom
Primer aktin dari kedelaiPrimer ActF 5’ATGGCAGATGCCGAGGATAT3’Primer ActR5’CAGTTGTGCGACCACTTGCA3’