KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

Any Guntarti

POMPA

DC18

Injektor

SKEMA HPLC

Integrator

Kolom analitik

Ke penampungan

Instrumen HPLC

1. Reservoir Fase Gerak↓

Bisa lebih dari 1↓

dari gelas / stainless steel↓

Daya tampung 1- 2 LDilengkapi degasser (menghilangkan gas terlarut) → gas

NO2 & O2 → membuat gelembung-gelembung di dalam kolom & detektor

↓ - Pelebaran pita analit - Respon detektor terganggu

• Degassing → pompa vakum dihubungkan reservoir &

diaduk / dipanaskan

Solven disaring dengan kertas Millipore

Pemisahan dengan 1 jenis FG dengan konsentrasi konstan

→ Elusi Isokratik

Bila dengan 1 atau lebih FG yang polaritasnya berbeda →

Elusi Gradien

Digunakan FG segar → mendapatkan hasil yang

reprodusibilitas optimum dalam pemisahan

2. Pompa

Tekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi)

Kec. Alir 1-3ml/menit

Bahan harus resisten secara kimiawi

Ex : dari teflon & stainless steel

Tidak ada pulsa getaran

Kontinyu

3. Peredam Pulsa Fase Gerak

Ada beberapa detektor sensitive terhadap

variasi kec. Alir FG → ex : index refraksi,

elektrokimia & konduktometer

Peredam aliran dengan gas yang ditekan

4. Sistem Injeksi Sampel

Menentukan presisi perhitungan → reprodusibilitas

sampel

Sampel dimasukkan dengan tekanan tinggi → merupakan

pita dengan sampel tipis → pelebaran diperkecil

Konvensional atau automatik

Injektor Automatik

5. Kolom Kromatografi

Bentuk tabung, permukaan dalam rataDari gelas / stainless steelLapisan luar kadang dilapisi logam → menahan tekanan ad 6000 psi, rx kimia dari FGSambungan kolom → tidak menyebabkan FG stagnantPanjang kolom (10 – 30) cmAnalisis pemisahan cepat (3 – 8) cmInternal diameter (4 – 5)mmPartikel diameter (3 – 5) µmGuard kolom → sebelum kolom analitik

Kolom dari stainless steel

 

6. Detektor

Pemilihan didasarkan pada problem pemisahan↓

Harus sensitif (menghindari pelebaran)

Ada 2 macam :

1. Berdasarkan sifat umum larutanRefraktif indeks → control temperaturKurang sensitive

2. Berdasarkan sifat solut/analit/sampel

UV – VisFluorescenceElektrokimia

↓Sinyal analit yang berbeda dari FG

↓Lebih sensitif (µg – ng)

↓Dikembangkan dengan derivatisasi pre & post kolom

Derivatisasi/modivikasi Instrumen HPLC

17

Alur sampel ke Detektor

7.Interpretasi output dari Detektor/integrator

• Direkam berupa rangkaian puncak-puncak• Puncak untuk data kualitatif dan kuantitatif

Profil kromatogram

Dalam gambar, area di bawah puncak Y < dibanding dengan area dibawah puncak X. Hal ini mungkin disebabkan :a.Karena Y lebih sedikit dari Xb.Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X.

Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.

Fase Normal HPLC

• Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase Balik/Reverse Phase HPLCSilika dimodifikasi menjadi non polar berupa atomkarbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polardigunakan berupa campuran air dan alkoholseperti metanol.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan bereaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.

Hasil Analisis dengan menggunakan HPLC