Medios Bioquímicos

Medios diferenciales


Son empleados para detectar reacciones bioquímicas, con carácter diferencial de grupos, géneros o especies microbianas, mediante el viraje de color del indicador presente en el medio, demostrando algunas de sus características.

Estos medios son el TSI, LIA, Citrato de Simmons, SIM, Caldo úrea.


LIA UREA

TSI (Triple Sugar Iron)

• Color: rojo ladrillo

• Inhibidores: no tiene

• Indicador: rojo de fenol

• Sustratos principales: lactosa, sacarosa y glucosa (la proporción en el medio de lactosa y sacarosa es de 10: 1 con la glucosa)

• Sustratos secundarios: tiosulfato sódico, peptona, citrato férrico amoniacal y extractos.

• Se siembra por picadura profunda con aguja y luego se siembra por estrías en el pico


TSI (Triple Sugar Iron)En este medio se busca determinar la capacidad de

la bacteria para degradar los azúcares y la formación de gas y de H2S.La fermentación aeróbica se produce en el pico de tubo y la anaeróbica en el fondo del tubo.

La degradación de la lactosa ocurre en la parte superior, la de la sacarosa en la parte intermedia y la de la glucosa en la parte profunda, produciéndose un viraje del rojo al amarillo.

El tiosulfato es reducido a H2S quien reacciona con el citrato férrico amoniacal para dar formación al sulfuro de fierro que es de color negro.

La presencia de gas se debe al CO2 producto de la fermentación.


1.- Rx en bacterias glucosa, lactosa y sacarosa +

A/A +;-

Ej.: Escherichia coli

A/A -;-

Ej.:

Vibrio cholerae


A/A ++, ++

Ej.: Citrobacter freundii


2.- Rx en bacterias solo fermentadoras de glucosa (glucosa +; lactosa y sacarosa -)

K/A -, ++++

Ej.: Proteus mirabilis

K/A -;-

Ej.: Shigella flexneri


N/N -;-

Pseudomonas

* Este resultado no es de una enterobacteria

3.- Bacilos no fermentadores

LIA (Lysine Iron Agar)

• Color: lila


• Indicador: púrpura de bromocresol

• Sustratos principales: lisina y glucosa

• Sustratos secundarios: peptona, tiosulfato de sodio, extracto de levaduras.

• Se siembra por picadura profunda con aguja y luego por estrías en el pico



En este medio se permite evidenciar la descarboxilación del aminoácido lisina en la diamina cadaverina, como también la desaminación de la lisina en un alfa cetoácido. Esta 2 reacciones se ponen de manifiesto por el viraje del indicador púrpura de bromocresol.

La formación de H2S se pone de manifiesto por la presencia del tiosulfato sódico, que dará formación al sulfato férrico.

También puede verificarse la formación de gas a partir de la degradación de la glucosa.


1.- Lisina descarboxilasa +

Lisina cadaverina (alcaliniza el medio)

lisina descarboxilasa



2.- Lisina descarboxilasa +, H2S +

Ej.: Salmonella


3.- Lisina descarboxilasa -

Ej.: Shigella


4.- Lisina deaminasa +

Lisina alfa cetácidoLisina deaminasa

Ej.: Proteus mirabilis


N/N -;-

Pseudomonas

* Este resultado no es de una enterobacteria

Citrato de Simmons

• Color: verde

• Inhibidor: no tiene

• Indicador: azul de bromotimol

• Sustrato principal: citrato de sodio

• Sustratos secundarios: fosfato dipotásico, cloruro de sodio, sulfato de magnesio y fosfato monoamónico.

• Se siembra por picadura profunda con aguja y luego por estrías en el pico.

Citrato de Simmons

Citrato de Simmons

Este medio nos permite comprobar la capacidad de la bacteria de utilizar el citrato como fuente exclusiva de carbono.

La degradación del citrato conlleva a la alcalinización del medio y el viraje del indicador azul de bromotimol de verde a azul prusia.

Con este medio podemos diferenciar entre las coliformes fecales y bacterias de los grupos Enterobacter y Citrobacter así como algunas especies del grupo Salmonella.

Citrato de Simmons

1.- Citrato positivo:

La bacteria consume el citrato como fuente exclusiva de carbono

Cit- Na+ Cit+ Na+ OH –

alcaliniza el medio

Ej.: Klebsiella pneumoniae

citritasa

Citrato de Simmons

2.- Citrato negativo

La bacteria no consume el citrato como fuente de carbono.


SIM (Sulfuro-Indol-Motilidad)

• Color: crema


• Indicador: no tiene

• Sustrato principal: peptona

• Sustrato secundario: tiosulfato sódico, hierro y amonio

• Este medio se utiliza para comprobar la motilidad, la formación de H2S y la producción de indol por parte de la bacteria.

• Se siembra por picadura


La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de la picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento producido exclusivamente a lo largo de la línea de inoculación.

La producción de H2S se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de crecimiento o del medio debido a la presencia del tiosulfato sódico.

Para la demostración del indol se usa el rvo de Kovacs, que manifiesta la degradación del triptófano por la enzima triptofanasa en indol, que se combina con el aldehído presente en el rvo de Kovacs, para producir un color rojo.


1.- Motilidad positiva 2.- Motilidad negativa

Presencia de turbidez difusa en el medio.


Presencia de crecimiento solo en el sitio de punción

Ej.: Klebsiella oxytoca


1.- H2S positivo 2.- H2S negativo

Ej.: Proteus vulgaris Ej.: Escherichia coli


1.- Indol positivo 2.- Indol negativo

Ej.: Escherichia coli Ej.: Salmonella sp.

Caldo Úrea

• Color: rosado



• Sustrato principal: úrea

• Sustrato secundario: extracto de levaduras, fosfato monopotásico y fosfato disódico.

• Este medio no se autoclava

Caldo Úrea

En este medio se observa la capacidad de la bacteria de degradar la úrea por medio de la enzima ureasa formando amoniaco y carbonato de amonio, que alcalinizan el medio por lo cual el rojo de fenol vira a un rojo cereza.

• Bacterias úrea + rápida: Proteus y Providencia

• Bacterias úrea + retardada: Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter.

• Bacterias úrea negativa: Escherichia coli, Salmonella, Shigella

Caldo Úrea

1.- Úrea positiva

•Rápida

Ejm.: Proteus mirabilis

• Retardada

Ejm.: Klebsiella pneumoniae

Caldo Úrea

2.- Úrea negativa


Otros medios diferenciales y pruebas

bioquímicas

KIA (Kligler Iron Agar)

• Color: rojo



• Sustratos principales: lactosa y glucosa

• Sustratos secundarios: peptona, extractos y tiosulfato sódico.

• Se siembra por picadura profunda con aguja y luego se siembra por estrías en el pico


Este medio se emplea para la identificación de bacilos gram – basada en la fermentación de la lactosa y la glucosa y en la producción de H2S.

Los organismos que fermentan glucosa pero no lactosa mostrarán un crecimiento K/A, mientras que los que si fermentan lactosa mostrarán un resultado A/A, con o sin formación de gas .

La formación de H2S se demostrará por el ennegrecimiento del medio.

Si el tubo no muestra ningún cambio es porque la bacteria no consume ni lactosa ni glucosa.


A/A +;-

Ejm: Escherichia coli

K/A -;-

Ejm:Shigella

K/A -;++++

Ejm: Proteus

MIO (Motilidad-Indol-Ornitina)

• Color: lila


• Indicador: púrpura de bromocresol

• Sustratos principales: ornitina y glucosa.

• Sustratos secundarios: peptona, triptona y extractos.

• Se siembra por picadura profunda


Este medio se usa para la identificación de enterobacterias en base a su movilidad, producción de indol y actividad de ornitina descarboxilasa.

El aminoácido ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descraboxilasa para producir la diamina putrescina y CO2, implicando una alcalinización del medio.

La motilidad se demuestra por un enturbamiento del medio o un crecimiento que se difunde desde la línea de inoculación. Los cultivos no móviles no muestran este crecimiento difuso, sino que más bien crecen a lo largo de la línea de inoculación.

La prueba del indol se basa e la eacción que s eproduce con el rvo de Kovacs.


M: negativa

I: positivo

O: negativo

Ej.: Klebsiella oxytoca


M: positiva

I: negativo

O: positiva

Ej: Enterobacter aerogenes


M: positiva

I: positivo

O: positivo


La catalasa es una enzima respiratoria presente en las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que descomponen el H2O2 que se forma como producto final del metabolismo de los carbohidratos, que reacciona y forma H2O y O2.

En los tubos con la bacteria desarrollada se le vierte 2 gotas de H2O2 y si inmediatamente se forman burbujas se anota que la prueba es +; de no existir burbujas, la prueba es negativa.

Esta prueba sirve para diferenciar cultivos de Streptococcus y Staphylococcus, ya que el Staphylococcus es catalasa + y el Streptococcus es catalasa - . Del mismo modo sucede con Bacillus que es catalasa + y Clostridium que es -

Prueba de la Catalasa o Peroxidasa

Prueba de la Catalasa o Peroxidasa

Prueba de la Coagulasa

La coagulasa es una enzima semejante a la protrombina, producida por más del 96% de Staphyloccocus patógenos. La coagulasa libre es liberada por la bacteria en el medio que la rodea, siendo su determinación realizada en tubos. El “clumping factor “ está fijado a la bacteria y depende de una sustancia de la membrana microbiana, que se combina con el fibrinógeno del plasma y favorece la aglomeración de Staphylococcus, realizándose en un portaobjetos.

Generalmente la coagulasa libre y el clumpling factor coexisten en las cepas patógenas.


Coagulasa + Coagulasa -


1.- Determinación de la coagulasa libre

Se hacen subcultivos a partir de cepas seleccionadas en caldo Infusión Cerebro-Corazón y se deja incubando a 37ºC 24h. Añadir 0,1ml del cultivo a 0,3ml de plasma y dejar incubando a 37ºC. A las 4h examinar los tubos para ver si el medio aparece coagulado, si es negativo, se examina hasta las 24h.

Interpretación:

• Negativo: Ningún signo de formación de fibrina

• Positivo:

- 1+: Presencia de pequeños coágulos organizados


- 2+: pequeño o pequeños coágulos organizados.

- 3+: gran coágulo organizado.

- 4+: todo el contenido aparece coagulado.

2.- Determinación del “clumping factor”

Se colocan sobre un portaobjetos 2 gotas de SSF estéril y en ella se homogeniza la cepa con un asa. Dejar caer una gota de plasma y homogenizar durante 15 a 20”, en este período de tiempo, se observará que si los Sthaphylococus se agrupan rápidamente son coagulasa + y si la cepa permanece sin cambios es coagulasa -.



Prueba de la Citocromo OxidasaLa reacción de la oxidasa se debe a la presencia de

un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana.

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para identificar todas las especies de Neisseria (+)y diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

El reactivo más recomendado para esta prueba es el rvo de Kovacs, ya que es menos tóxico y más sensible que el rvo de Gordon y Mc Leod. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.

Prueba de la Citocromo Oxidasa

Método en placa directa

Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla.

Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

Método indirecto sobre papel

Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.

Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.

La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.




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