TIỂU LUẬN MÔN HỌC

PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

AFLATOXIN, E.COLI TRONG THỰC PHẨM VÀ

PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

GVHD: Ths. Hoàng Thị Kim Khuyên

Lớp: ĐHPT5

SVTH: Nguyễn Hữu Tiến 09078011

Huỳnh Thị Bích Vân 09082441

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

◊…….◊

NỘI DUNG

1. Tổng quan về Aflatoxin và phƣơng pháp phân tích

2. Tổng quan về E.Colivà phƣơng pháp phân tích

1. Tổng quan về Aflatoxin và phƣơng pháp phân tích

1. 1 Tổng quan về Aflatoxin

1.2 Các phƣơng pháp xác định Aflatoxin

1.3 Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng

1.4 phƣơng pháp Elisa

1.1 Tổng quan về Aflatoxin

Khái niệm, tính chất

Độc tính

Các thực phẩm chứa Aflatoxin

Giới hạn cho phép

Aflatoxin là một độc tố được tiết ra từ nấm Aspergillus flavus,

parasiticus và fumigatus.

Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là

• AFB1: C17H12O6

• AFB2: C17H14O6

• AFG1: C17H12O7

• AFG2: C17H14O7

Giữa 4 loại trên thì thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản

và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất

Khái niệm, công thức cấu tạo

Hình. AFB1 và AFB2 Hình. AFG1 và AFG2

Khái niệm, công thức cấu tạo

Độc tính của aflatoxin cao gấp 10 lần HCN và gấp 68 lần Arsen.

Gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết ngƣời khoảng 10mg)

Phá huỷ tế bào gan, thận và các bộ phận sống còn khác.

Ảnh hưởng lên hệ miễn dịch.

Ăn mòn thành ruột và dạ dày.

Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết, gây ra ung thư cho gia súc, gia

cầm.Và nếu con người ăn thịt chứa aflatoxin thì có thể bị ung thư

gan.

Aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư.

Hình. Bệnh ung thƣ gan

Độc tính

Thực phẩm có thể nhiễm Aflatoxin

Hàm lƣợng

(ppm) Tiêu chí

20 Ngô và các loại hạt cho vật

nuôi chưa trưởng thành.

100 Ngô và các loại hạt cho giống

vật nuôi đã trưởng thành

200 Ngô và các loại hạt dùng cho

lợn thịt từ 100 pound trở lên

300 Ngô và các loại hạt cho bò

giai đoạn cuối

FDA đƣa ra giới hạn tối đa

Bộ Y tế Việt Nam

ML

(g/kg) Tiêu chí

5 Aflatoxin B1

15 Aflatoxin B1,

B2, G1, G2

0.5

Aflatoxin M1

trong sữa và các

sản phẩm sữa

Giới hạn cho phép

1.2 Các phƣơng pháp phân tích Aflatoxin

•Phương pháp vi cột.

•Phương pháp cột ái lực - típ Florisil.

•Phƣơng pháp Elisa.

•Phương pháp huỳnh quang kế - ái lực

•Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng.

•Phương pháp sắc ký lỏng (LC)

Phƣơng pháp

định lƣợng

• Phương pháp BGYF Phƣơng pháp

định tính

Nguyên tắc

Dụng cụ - hóa chất

Quy trình phân tích

Công thức tính Aflatoxin

Lƣu ý

Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng phân tích Aflatoxin

Mẫu sau khi xử lý sẽ được đưa qua cột sắc ký, cột được nhồi

bằng các gel kháng thể.

Khi mẫu đi qua cột, các gel kháng thể sẽ làm nhiệm vụ hấp phụ

các vi nấm Aflatoxin.

Sau đó, chúng ta rửa cột bằng nước cất để loại bỏ các chất còn

lại và giải hấp Aflatoxin bằng dung môi methanol.

Tiến hành định lượng Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng.

Nguyên tắc

Dụng cụ - Hóa chất

THIẾT BỊ

Cột sắc ký ái lực miễn dịch

Micro pipet

Bình chạy TLC

Bản TLC silicagel 10 x 10 cm

Bình thổi khí N2

Xiranh 20 – 30 ml

Mycrosiringe Hamilton 10 l

Dụng cụ làm khô gia nhiệt

Máy lắc Vortex

Máy soi đèn UV 395nm

HOÁ CHẤT

Dung dịch chiết mẫu:

MeOH/Nước cất (75:25)

Methanol HPLC grade chiết mẫu

Aflatoxin chuẩn B1 trong Benzen

- Acetonitrit (98:2)

Dung dịch triển khai: Cloroform

– Aceton (9:1)

Nước cất

Quy trình phân tích

Chuẩn bị mẫu

Mẫu đã

nghiền

Trộn đều

25g mẫu 125ml MeOH 70%

Bình định mức

Lắc đều. Để yên

15p-20p. Lọc

Lấy 15ml pha

loãng 1/3 nƣớc.

Lọc và lấy 15ml

phân tích

5g NaCl

Quy trình phân tích

Qua cột sắc ký

H2O vào đầy cột.

Tránh tạo bọt khí

20 ml PSB để rửa

Dịch lọc qua cột (tốc độ 1 giọt)

20ml dd chiết mẫu đã lọc

Bơm 2-3 ml không khí qua cột

để khô, tháo cột và lau cột.

1ml MeOH rửa

giải, hứng dd

Lấy 15 ml dd

Dung dịch

mẫu

Dd mẫu

Quy trình phân tích

Qua cột sắc ký

Hình. Minh hoạ cột

Quy trình phân tích

Định lƣợng

Làm khô dd giải

hấp bằng khí N2 ở

40-50oC

Hoà tan cặn bằng

Benzen-acetonitril

(98:2)

Chấm mẫu và chuẩn

trên giấy silicagen

Cho vào hệ dung

môi, đậy nấp

Lấy bản ra. Làm

khô

Soi đèn UV 365nm

Kết quả.

Clorofom-aceton (9:1)

Khoảng 30 phút

Công thức tính toán

𝑨𝒍𝒂𝒕𝒐𝒙𝒊𝒏 𝑩𝟏 =𝑺. 𝒀. 𝑽

𝑿.𝑾 ( 𝒈

𝒌𝒈 𝒉𝒐ặ𝒄 𝒑𝒑𝒃 )

Trong đó:

S: thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng X l mẫu (l)

Y: Nồng độ của Aflatoxin B1 chuẩn (0.5 l/ml hoặc 0.5 ppm)

V: thể tích hoà tan cặn (200 l)

X: Thể tích có độ sáng bằng S l chuẩn

W: Số gam mẫu đi qua cột (1g)

Nồng độ của Aflatoxin B1 là

Lƣu ý

Chấm trong tủ hút để dung môi bay nhanh, chấm từ từ để các chấm

thật nhỏ, kích thước chỉ khoàng 1mm/chấm,\.

Đeo găng tay khi làm thí nghiệm.

Các vết Aflatoxin phải được lau sạch bằng nước Javen 10 %.

Dụng cụ thuỷ tinh hay nhựa tiếp xúc với Aflatoxin phải được ngâm

trong nước Javen 10% tối thiểu là 30’ trước khi rửa.

Nguyên tắc

Dụng cụ - hóa chất

Quy trình phân tích

Công thức tính Aflatoxin

Lƣu ý

Phƣơng pháp Elisa phân tích Aflatoxin

Phương pháp này kết hợp của kháng thể và kháng nguyên.

Kháng thể kháng Aflatoxin được phủ lên bề mặt các giếng nhựa thử.

Aflatoxin trong mẫu sẽ cạnh tranh với Aflatoxin có gắn enzyme.

Tác dụng của enzyme, cơ chất sẽ có màu. Càng nhiều Aflatoxin

trong mẫu thì càng ít Aflatoxin có gắn enzyme bám vào kháng thể.

Như vậy, màu sẽ đậm khi có ít Aflatoxin và màu nhạt khi có

nhiều Aflatoxin.

Bằng phương pháp đo màu trên máy Elisa có thể xác định được

hàm lượng Aflatoxin.

Nguyên tắc

Dụng cụ - Hóa chất

THIẾT BỊ

• Micro pipet 1,8,12

• Máy đọc Elisa

• Máy lắc (để chiết mẫu)

• Máy lắc Vortex

• Pipet tip

• Giếng mini phủ kháng thể

• Và các dụng cụ thủy tinh của

phòng thí nghiệm

HOÁ CHẤT

• Methanol để chiết mẫu

• Cơ chế B (H2O2/ Đệm axetat)

• Các thành phần của bộ kit Elisa

để kiểm tra Aflatoxin

• Đệm pha cộng hợp

• Cơ chế A (TMB)

• Dịch hãm

• Nước cất

• Cộng hợp Enzim 10x

• Aflatoxin B1(1,2,4,8 ppb)

Quy trình phân tích

Chuẩn bị mẫu

Mẫu đã

nghiền

Trộn đều

5g mẫu 25 ml MeOH 60%

Bình định mức

Lắc đều. Để yên

15p-20p. Lọc

Lấy 15ml phân

tích

Quy trình phân tích

Phân tích mẫu

50 ml MeOH 50 ml chuẩn 50 ml MeOH 50 ml mẫu

Tiến hành song song

Các giếng mẫu (không phải Erlen, hình minh họa)

Để yên 10p.

Cho vào

chậu nƣớc

Javen 5%.

Đập khăn

giấy.

Rửa lại 5 lần

bằng dd rửa

Phân tích

= 450 nm

Công thức tính toán

Màu đậm Aflatoxin ít

Màu nhạt Aflatoxin nhiều

Tính độ ức chế màu theo công thức:

% Ứ𝑐 𝑐ℎế = 1 −𝐴1𝐴0

. 100

A1: là mật độ quang A của mẫu

A0: Là mật độ quang A của chuẩn.

Dựa vào % ức chế màu của mẫu và đồ thị Aflatoxin của chuẩn tính được

nồng độ Aflatoxin của mẫu.

Nồng độ Aflatoxin trong mẫu = 5. Nồng độ Aflatoxin trong giếng

Lƣu ý

Chấm trong tủ hút để dung môi bay nhanh, chấm từ từ để các chấm

thật nhỏ, kích thước chỉ khoàng 1mm/chấm,\.

Đeo găng tay khi làm thí nghiệm.

Các vết Aflatoxin phải được lau sạch bằng nước Javen 10 %.

Dụng cụ thuỷ tinh hay nhựa tiếp xúc với Aflatoxin phải được ngâm

trong nước Javen 10% tối thiểu là 30’ trước khi rửa.

2. Tổng quan về E.coli và phƣơng pháp phân tích

2. 1 Tổng quan về E.Coli

2.2 Các phƣơng pháp xác định E.Coli

2.3 Phƣơng pháp đếm lạc khuẩn

2.1 Tổng quan về E.Coli

Khái niệm, tính chất

Độc tính

Các thực phẩm chứa E.Coli

Vi khuẩn E.coli (Escherichia coli) thuộc nhóm vi trùng đường

ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của

người và gia súc. Trong đường ruột, chúng hiện diện nhiều ở đại tràng

nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng.

Khái niệm

Hình. Vi khuẩn E.Coli Hình. Vi khuẩn E.Coli biến chứng mới

Vi khuẩn E.Coli được chia thành 5 nhóm với các tác hại như sau:

• Enteroaggregative (EAggEC): ST là vi khuẩn bền nhiệt.

• Enterohemorrhagic (EHEC): Gây bệnh chảy máu ruột, tiêu chảy.

• Enteroinvasive (EIEC): Gây sốt, nôn mửa, co rút cơ bắp.

• Enteropathoaenic (EPEC): Nội độc tố.

• Enterotoxigenic (ETEC): Độc, tiêu chảy, lây nhiễm.

Như vậy, khi E.Coli xâm nhập vào cơ thể với hàm lượng đủ lớn sẽ gây

ra các bệnh về đường ruột

Độc tính

Thực phẩm có thể nhiễm Aflatoxin

1.2 Các phƣơng pháp phân tíchE.Coli

•Phƣơng pháp đếm lạc khuẩn

• Phƣơng pháp MNR

Nguyên tắc

Dụng cụ - hóa chất

Quy trình phân tích

Công thức tính Aflatoxin

Lƣu ý

Phƣơng pháp đếm lạc khuẩn xác định E.Coli

Mẫu đã đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định trong môi

trường thạch thích hợp có chứa Lactozo.

Môi trường có chứa Natri sunfit và fucshin có khả năng ức chế

vi khuẩn gram (+).

Môi trường này, E.coli sinh trưởng và sinh ra andehyt, acid.

Andehyt tác động đến phức chất sunfit – fucshin và giải phóng fucshin.

Fucshin nhuộm các khuẩn lạc có màu hồng, tròn, có khi có ánh kim.

Giả sử, các khuẩn lạc có màu hồng, có ánh kim là E.coli thì kiểm tra

có sinh Indol hay không.

Nguyên tắc

Dụng cụ - Hóa chất

THIẾT BỊ

• Đĩa Petri

• Tủ sấy

• Tủ hấp

• Tủ lạnh

• Dụng cụ đồng nhất mẫu

• Pipet

• Tủ ấm

Dụng cụ phải vô trùng

HOÁ CHẤT

• Môi trường thạch Lucozo màu

lục đỏ sáng mật bò

• Môi trường EMB

• Môi trường Endol

• Môi trường Istatri

• Thuốc thử Indol

Các hóa chất phải được pha chế

trước, khử trùng, bảo quản lạnh.

Quy trình phân tích

Gieo cấy. Cấy 1ml mẫu vào Endol

Dung dịch mẫu

Pha loãng (0.1; 0.01; 0.001)

Mỗi nồng độ làm 3 lần

Nuôi ủ

Tủ ấm, 370C, 48h

Quan sát, ghi nhận lạc khuẩn màu hồng, ánh kim

Khẳng định E.coli

Quy trình phân tích

Nuôi ủ 370C, 24h

Khẳng định E.coli

Kiểm tra hình thái

Nhuộm gram, soi kính xác

định gram (-)

Phản ứng IMVIC

Lạc khuẩn màu đỏ

MT Endo/EBM 370C, 24h

Phản ứng Indol Phản ứng MR Phản ứng Citrate Phản ứng VP

Cấy(Sim nitrate) Cấy (NH4)2SO4)

Quan sát

Cấy(Clark Lubs)

Nuôi ủ 370C, 24h

Cấy(MT: Trypton)

Nuôi ủ 440C, 36h

Quy trình phân tích

Kết quả

• Phản ứng Indol: sau khi thêm thuốc thử Indol, để yên 1 phút.

Kết quả dương tính là màu đỏ.

• Phản ứng MR: sau khi thêm MR. Kết quả dương tính là có màu

đỏ ngay khi cho vào

• Phản ứng VP: Kết quả dương tính khi không có màu đỏ sau khi

cho thuốc thử 15 – 20 phút.

• Phản ứng citrate: Kết quả dương tính khi màu đỏ thành màu

xanh.

Công thức tính toán

Dựa vào số khuẩn lạc nghi ngờ là E.Coli đã đếm được trên các đĩa, tổng

số ống nghiệm thử Indol dương tính và tổng số ống nghiệm thử Indol.

Số lượng E.Coli có trong 1ml (1g) mẫu:

N = C

n1 + 0.1n2 f1. vR(đơn vị

CFU

ml,CFU

g)

C: Tổng số E.Coli trên các đĩa.

n1: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thấp nhất

n2: Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng cao nhất

f1: Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất

v: Thể tích mẫu cấy cả đĩa Petri

R: Số ống nghiệm thử Indol dương tính/Số ống nghiệm thử Indol.

Lƣu ý

• Khi tiến hành phân tích xác định vi sinh vật phải tiến hành trong môi

trường vô trùng.

• Dụng cụ, thiết bị phải được khử trùng.

• Hóa chất phải được pha trước, vô trùng, bảo quản lạnh

• Đeo gang tay khi tiến hành thí nghiệm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO