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PhD Presentation UFRJ Biofisica 2009 Rio de Janeiro
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A chaperona ClpB/HSP104 de Trypanosoma cruzi
Roberta Alvares Campos
Turán Péter Ürményi
Lab. Metabolismo Macromolecular Firmino Torres de Castro
Programa de Biologia Molecular e Estrutural
IBCCF/UFRJ
Protozoário flagelado
Agente Etiológico
da Doença de Chagas
Organismo Eucarioto unicelular
Ordem: Kinetoplastida
- Mitocôndria única e alongada.
- organelas especializadas, ricas em kDNA = cinetoplastos.
Tripanossomatídeos
Trypanosoma cruzi (CL Brener)
The TIGR Genome Project - Julho de 2003
T. cruzi (Esmeraldo) - J. Craig Venter Institute
Afeta 18 milhões de pessoas em 21 países.
Trypanosoma brucei
Agente Etiológico Doença do Sono
Leischmania sp.
Leishmaniose.
Doenças Extremamene Negligenciadas, segundo a OMS.
O modelo de estudo Trypanosoma cruzi
Forma Epimastigota. (Docampo et al., 1975).
Doenças Globais: Doenças crônicas como o câncer, doenças cardiovasculares, distúrbios neurológicos e a AIDS.
Doenças Negligenciadas:Como a malária, provocam um interesse “marginal” na indústria farmacêutica.
Doenças Extremamente Negligenciadas:Doença do sono, Chagas e Leishmaniose, afetam populações de extrema pobreza.
Fonte: DNDi – Drugs for Neglected Diseases 2007 (http://www.dndi.org.br/)
A Doença de Chagas
Vetorialsilvestre
domiciliar ouperidomiciliar
Transfusãosanguínea ouCongênita, damãe para feto.
Transplantesde órgãosinfectados
Via oral
leite maternoou alimentos
Acidentes
em laboratórios
O Ciclo de vida do T. cruzi. (Modificado do CDC, 2009).
Organismos evolutivamente antigos
Transcrição multigênica
Trans-splicing
Regulação gênica pós-transcricional
Mecanismos de resposta ao estresse diferenciado
As peculiaridades moleculares do T. cruzi
Estresse no ciclo biológico do T. cruzi
Hospedeiro mamífero
Baixo pH
Enzimas proteolíticas
Produtos oxidativos
Temperatura = 37⁰
Pontos potenciais de estímulos de stress no ciclo biológico do T. cruzi. Rondinelli, E. 1994.
Estresse & desnaturação protéica
As Chaperonas moleculares e sua importância
Proteínas
imunogênicas
ATPases - Superfamília de Proteínas AAA+ Clp/HSP100
Controle de qualidade de enovelamento protéico
ClpB/HSP104
ClpA (ClpP, ClpS, ClpX, ClpQ)
Clp/HSP100
Funções da proteína ClpB/HSP104
LEE, S. et al. 2003. The Structure of ClpB: A Molecular Chaperone that Rescues Proteins from an Aggregated Stade. Cell 115.
Estrutura da proteína Clp/HSP104
LEE, S. et al. 2003. The Structure of ClpB: A Molecular Chaperone that Rescues Proteins from an Aggregated Stade. Cell 115.
GIAMBIAGI DE-MARVAL et al., 1996.
CLOS et al., 1995.
Resultados anteriores com expressão de HSPs em tripanossomatídeos
CARVALHO et al., 1990.
103 kDa
92
75
61
29 37 40
OBJETIVOS
I. Caracterizar a estrutura gênica de ClpB/HSP104 de T. cruzi.
II. Investigar a expressão gênica de ClpB/HSP104 em resposta ao choque
térmico.
III. Propor a estrutura tridimensional da proteína ClpB/HSP104 por
modelagem molecular.
ESTRUTURA GÊNICA
T. cruzi CDSTc00.104705350
6821.20
HSP100, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (pseudogene), putative, serine peptidase (pseudogene),
putative, 7106.t00002
T. cruzi CDSTc00.104705350
7027.59pre-mRNA cleavage complex II Clp1 protein, putative, 7179.t00009
T. cruzi CDSTc00.104705350
6617.90ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (HSP100)(pseudogene), putative, 7023.t00008
T. cruzi CDSTc00.104705350
9125.20HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78, putative, serine peptidase, putative, 8007.t00002
T. cruzi CDSTc00.104705350
8233.60heat shock protein 100 (clp protein), putative, 7649.t00006
T. cruzi CDSTc00.104705351
1107.41ATP-dependent Clp protease subunit heat shock protein 100 (HSP100), putative, 8599.t00005
T. cruzi CDSTc00.104705350
6941.229pre-mRNA cleavage complex II Clp1 protein, putative, 7147.t00033
T. cruzi CDSTc00.104705350
8737.100HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78, putative, serine peptidase, putative, 7851.t00010
T. cruzi CDSTc00.104705350
8807.10HSP100, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100, putative, serine peptidase, putative, 5618.t00001
T. cruzi CDSTc00.104705350
8665.14ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (HSP100), putative, 7820.t00005
T. cruzi CDSTc00.104705350
9127.10
HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78 (pseudogene), putative, serine peptidase, putative,
8008.t00001
Busca da sequência do gene ALVO clpb/hsp104 de
T. cruzi
Agosto 2005
GeneID: 3532962 Locus tag: Tc00.1047053508665.14 Protein: EAN81877
Sequência incompleta do gene ClpB/HSP104 de T. cruzi, no banco dados do TcruziDB
Estratégia de mapeamento do terço final de Clp/HSP100
200 pb
Obtenção da sequência completa do gene ClpB/HSP104
GAP previsto de 33 pares de bases
Região Codificante total do GeneClpB/HSP104 = 2604 pbProteína de 868 Aa
Sequência completa de aminoácidos de ClpB/HSP104 em T. cruzi
Identidade de 71,9%
Alinhamento de sequências de Clp/HSP100
Análise filogenética preliminar da Proteína ClpB/HSP104
Modelo radial com calculo da distância genética Jukes-Cantor e Método de construção por Neighbor-Joining.
Obtenção de sonda molecular do gene clpB/hsp104
de T. cruzi
980 pb
Análise por padrão de fragmentos genômicos de
clpb/hsp104
Xh
oI
Eco
010
9
Xb
aI
Hin
d II
I
Não
-dig
.
5 kb
2 kb
Eco
RI
Pst
I
Sal
I
Bam
HI
Hin
fI
Sítio de trans-splicing do mRNA de ClpB/HSP104
Sítio de trans-splicing do mRNA de ClpB/HSP104
EXPRESSÃO GÊNICA
Expressão gênica de ClpB/HSP104 em resposta ao choque térmico
4o°C37°C29°C
Extrato Protéico
RNA Total
SDS-PAGEWestern blot
2D-IEFImmunobloting
Northern blot
qRT-PCR
Indução do mRNA ClpB/HSP104 em resposta ao choque térmico
Indução da Proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi em resposta ao
choque térmico
M 29° 37/3 37/6 37/24 40/3 37/6 h 29° 37/3 37/6 37/24 40/3 37/6 horas
Otimização das condições de amostras para 2D-IEF
Isoformas de ClpB/HSP104 de T. cruzi em diferentes temperaturas
250
150 100
75
50
37
15
A B29 37
150
100
75
50
37
15
29
MODELAGEM MOLECULAR
Utilização da Modelagem molecular
Discriminação entre as subfamilias das
Clps/HSP100.
Procura por domínios conservados.
Características estruturais podem ser úteis
para predizer funções.
A caracterização estrutural pode nos guiar ao
estudo de peptídeos candidatos para
diagnóstico de doença de Chagas.
Construção do modelo tridimensional da proteína
ClpB/HSP104 de T. cruzi por Modelagem Comparativa
Explora similaridades estruturais entre PTNs
Depende de um molde disponível no banco (PDB)
Pressupõe regiões de conservação evolutiva entre PTNs
Construção do modelo tridimensional da proteína
Análise e validação do modelo gerado
Moldes disponíveis no banco de dados - PDB
Domínios Conservados – NCBI conserved domain
Escolha do Molde/Template no PDB
Proteína Organismo ID PDB Identidade Similaridade Cobertura
ClpB T. thermophilus 1QVR 53% (457/858) 72% (613/858) 98,84%
ClpA E. coli 1KSF 43% (150/347) 61% (215/347) 39,94%
ClpB E. coli 1JBK 66% (128/192) 84% (162/192) 22,11%
ClpB P. falciparum 2P6S 62% (116/187) 81% (152/187) 21,54%
ClpB S. cerevisiae 2QR9 27% (56/204) 46% (94/204) 23,50%
Modelo “868” construído por modelagem comparativa para a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi
com o programa Modeller e visualizados com Pymol (WARREN, 2004). É um monômero que constitui a sexta parte do hexâmero da proteína.
Modelo tridimensional da proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi
Gráfico de Ramachandran
regiões muito favoráveis – 91.3%, regiões favoráveis – 7.3%, generosamente permitidas – 1.2% ,regiões desfavoráveis – 0.3%
Validação do modelo tridimensional proposto da proteína
ClpB/HSP104 de T. cruzi
Análises utilizando o programa MODELLER:Todos os 300 modelos obtiveram GA341 = 1.0 indicando a boa escolha do molde (template) pelo usuárioOs 300 modelos foram ranqueados segundo o Discrete Optimized Protein Energy (DOPE) quanto menor o DOPE, maior a acurácia do modelo.
Análise utilizando o programa PROCHECK:Os 300 modelos foramranqueados segundo o Gráficode Ramachandran.
(A) TClpB104 de T. thermophilus com os principais domínios estruturais da proteína (LEE et al., 2003).
(B) Modelo do monômero construído por modelagem comparativa para a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi. Em laranja = L1, em marinho = L2, em rosa = L3, em azul claro = L4. Os 2 monômeros foram colocados em eixos semelhantes para esta comparação. Programa Pymol (Yao & Warren, 2004).
Comparação estrutural T. thermophilus X T. cruzi construído
por modelagem molecular
Estudo de peptídeos candidatos da chaperona ClpB/HSP104 de T. cruzi para diagnóstico da doença de Chagas
(A) Modelo “868” de ClpB/HSP104 de T. cruzi (verde) fitado com o modelo de ClpP Humana (1TG6). (B) Modelos fitados com detalhes para os 2 peptídeos propostos para futuros alvos de diagnóstico.
Foi obtida a sequência completa do gene clpb/hsp104 de T. cruzi que dá origem auma proteína de 868 aminoácidos, com identidade de 71,9% quando comparadosaos genes ortólogos dos demais tripanossomatídeos.
Análises de Southern blot sugerem que o gene clpB/hsp104 está presente nogenoma de T. cruzi em cópia única.
Análises do teor relativo do mRNA mostraram que ocorre indução dos níveis demRNAs clpB/hsp104 de T. cruzi após o choque térmico, com um aumento de 4vezes a 37 ºC e de 2 vezes a 40ºC.
Análises de indução por choque térmico com a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi,mostraram que ela está presente tanto na temperatura normal de cultivo 29ºC,como em choque térmico, levando a um acúmulo da proteína à 37 ºC quanto a à40ºC, sendo mais evidente ao final de 24 horas de incubação à 37 ºC.
Conclusões
A proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi está presente em uma única isoforma à 29ºC com pI aproximado de 6.5, e o número de isoformas parece aumentar com o choque térmico a 37ºC.
Foi proposta uma estrutura tridimensional da proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi por modelagem molecular de boa qualidade e que definiu que a proteína de T. cruzi é uma ClpB/HSP104.
Conclusões
-Mapeamento do tamanho e da meia vida do mensageiro deClpB/HSP104 utilizando RNA Poly A+
-Análises proteômicas dos spots encontrados dos géis 2D-IEF emMALDI-TOF.
- Estudo detalhado dos 2 peptídeos funcionais propostos nestetrabalho, ligados a uma molécula de avidina no N-terminal paraensaios de captura em placas de Elisa para testes deimunogenicidade da proteína contra soros Chagásicos.
Perspectivas
RAC - Tese 24/07/2009
Agradecimentos especial as colaborações
Proteômica 2D-IEF
Lab. de Diagnóstico de Doenças Infecciosas
Líder: José Mauro Peralta
Giovani Veríssimo
Inst. de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/UFRJ
Modelagem molecular
Lab. de Física Biológica
Líder: Paulo Bisch
Manuela Leal
IBCCF/UFRJ
RAC - Tese 24/07/2009
MUITO OBRIGADO!