Embed Size (px)
Rakutsükli kontrollOnkobioloogia
Taavi Päll lektor, Tallinna Tehnikaülikool
/
Recap
/
Tuumor-suppressor geenidTuumor-suppressor geen, või anti-onkogeen, on geen mis hoiab ära raku transformatsiooni.Kui see geen muteerub rakus ja tema funktsioon kaob või väheneb, siis võib see rakk arenedavähiks. Tavaliselt on vaja ka teisi onkogeenseid lisamuutusi (Wikipedia).
/
Rakutsükkel
http://tpall.github.io/Rakutsyklikontroll
RakutsükkelRakutsükkel on järjestikuste sündmuste jada mille käigus rakk duplitseerib kõik omakoostisosad ja jaguneb kaheks tütarrakuks
Rakutsüklit kontrolliv 'masinavärk' on universaalne kõigis organismi rakutüüpides.
Raku rakutsüklisse sisenemist ja 'masinavärgi käivitamist' reguleerivad raku väliskeskkonnasignaalid
·
·
·
/
Rakutsükli käivitamist reguleerivad rakuvälisedsignaalid
Eksponentsiaalselt kasvav imetajarakk peab peale igat raku jagunemist otsustama,
Seda otsust mõjutavad mitogeensed kasvufaktorid - kui neid on piisavalt siis rakk jätkabjagunemist, vastasel juhul jääb rakk vaikeolekusse
·
kas kasvada ja jaguneda veel üks tsükkel või
jääda vaikeolekusse
-
-
·
/
Rakutsükli käivitamist reguleerivad rakuvälisedsignaalidKeskkonna signaalid, mis rakku jagunema/mittejagunema mõjutavad, pärinevad erinevatestallikatest:
türosiin kinaas retseptorid (mitogeenid)
G-valk retseptorid (GPCR)
toitainestaatus
·
·
·
/
Ka rakutsüklist väljumist reguleerivad rakuvälisedsignaalidKa raku vaikeolekuse minek võib olla aktiivselt reguleeritud.
TGF- on üks kesksemaid anti-mitogeene
Vaikeolek on rakkudel enamasti pöörduv
Rakke mis enam ei jagune ja on terminaalselt diferentseerunud nimetatakse post-mitootilisteks, nt. neuronid
· β
·
·
/
Rakutsükli faasidRakutsüklis on neli üksteisele järgnevat faasi:
G1 algab peale mitoosi ja kestab kuni DNAreplikatsiooni alguseni S faasis,
S-faasis toimub genoomse DNA süntees
G2 faas on intervall DNA sünteesi edukalõpu ja mitoosis toimuva kromosoomidelahknemise vahel
M-faas mitoos.
·
rakk kasvab ja valmistub sisenema Sfaasi
-
·
·
suhteliselt lühike
mitoosis vajalike valkude süntees
-
-
·
/
M-faasis toimub kromosoomide lahknemine Mitoosi faasid vesiliku kopsurakus
Mitoosi faasid
Profaasis toimub kromosoomidekondenseerumine
Metafaasis joonduvad õdekromatiidid
Anafaasis toimub õdekromatiididelahknemine poolustele
Telofaasis moodustub uuestituumamembraan ja tuum
Tsütokinees: moodustub kaks tütarrakku
·
Moodustub mitoosikääv-
·
·
·
·
Pilt: DOI: 10.1126/science.1082177
/
Rakutsükkel liigub ühes suunasTuuma tsükkel on koordineeritud raku kasvu ja pooldumisega
Replikatsioon peab toimuma vaid üks kord rakutsükli jooksul
Replikatsioon peab eelnema kromosoomide lahknemisele
Kromosoomide lahknemine peab omakorda olema toimunud enne tsütokineesi e. rakujagunemist
·
·
·
·
/
Rakkude kasv vs jagunemineKui rakk on aktiivses kasvu-jagunemise tsüklis, siis peab see rakk kohe peale mitoosi läbimistvalmistuma uueks jagunemiseks
Selleks peab rakk 'kahekordistama' oma suuruse
Pärmi katsed on näidanud, et raku suurus valitseb rakutsükli üle: väikesed rakud ei jagune
Mutatsioonid mis kiirendavad rakutsükli kulgu põhjustavad väiksemate rakkude tekke.
Rakkude kasv toimub G1 faasis
·
·
·
·
·
Mutation of Tsc1 Increases Cell and Organ Size. Source: DOI: 10.1016/S0092-8674(01)00333-6
/
Rakutsükli kontrollpunktid, checkpoints1. G1-S DNA kahjustuste kontrollpunkt: S-faasi sisenemine on blokeeritud kui genoom on
vigane
2. S-faasi kontroll: replikatsioon aeglustub või seiskub vastusena DNA kahjustustele.
3. G2-M kontroll blokeerib raku mitoosi sisenemise kuni genoomi replikatsioon S-faasis onlõpule viidud
4. eksisteerib veel hilise G2 dekatenatsiooni kontroll mis monitoorib, et kromosoomid ei oleksomavahel 'sõlmes'
5. M faasis kontrollpunkt mis blokeerib sisenemise anafaasi kuni kõik kromosoomid onkorrektselt käävile kinnitunud
/
Komosoomi aberratioonid RAD17 flox/−rakkudes. Metafaasi komosoomid:
Rad17: genoomi replitseeritakse ainult üks kordRad17 sensorvalgu fosfrüleerimine ATRi poolt on vajalik DNA-kahjustuste poolt indutseeriudG2-faasi blokiks
Katkenud komosoomid (all vasak, nool).
Endoreduplitseerunud kromosoomid (allparem).
·
·
/
ATR replikatsiooni checkSeriin-treoniin kinaas ATR tagab fragiilsetesaitide stabiilsuse
ATR aktiveeritakse vastuseksüheahelalisele DNA-le
Aktiveeritud ATR fosforüleerib CHK1kinaasi ja käivitatakse signaalirada mis viibrakutsükli blokini
·
·
·
/
See BUB1-vaigistatud rakk on kaotanudkromosoomid 1 ja 6.
BUB1: käävi kontrollpunktKäävi kontrollpunkt ( , SAC) hoiab ära aneuploidia tekke
Mutatsioonid mitoosikäävi kontrollpunktisvõib põhjustada kromosomaalseebastabiilsuse ja aneuploidsuse, üle 90%tahketest kasvajatest sisaldabkromosomaalseid aberratsioone.
BUB1 funktsiooni eksperimentaalnepärssimine on piisav rakkudesaneuploidse fenotüüpi tekkeks.
·
·
/
G1 restriktsioonipunktTagab mitogeense kontrolli rakutsükli kulgemise üle
Varases- ja keskmises G1 faasis on S-faasi sisenemine seerum sõltuv.
Hilises G1 faasis on rakud juba pühendunud S-faasi sisenemisele ja ei sõltu enamrakuvälistest signaalidest
·
Samuti on rakud tundlikud TGF- anti-mitogeensele toimele.- β
·
/
Ka rakutsükli masinavärki reguleerivad kinaasidRakutsükli kinaaside (CDK) substraadid:
Tsentrosoomi valke ( ) fosforüleeritakse G1/S üleminekul tsentrosoomiduplitseerumiseks
Enne S-faasi aktiveeritakse replikatsioonikompleks ( )
fosforüleerimine S ja M faasis kromatiini kondenseerumiseks
Tuumamebraani valkude ( ) fosorüleerimine põhjustab tuumamembraani lagunemiseM-faasis
·
·
·
·
/
Rakutsükli kinaasid (CDK)CDK on Ser/tre-kinaasid
40% aa järjestusest identsed
CDK aktiveerub seostumisel tsükliiniga
Tsükliinid tagavad ka substraat spetsiifilisuse
·
·
·
tsükliin E + CDK2 kompleksi kinaasne aktiivsus tõuseb 400000 korda-
·
Mechanism of CDK activation revealed by the structure of a cyclinA-CDK2 complex. Jeffrey, P.D., Russo, A.A., Polyak, K., Gibbs, E., Hurwitz, J., Massague, J.,Pavletich, N.P. (1995) Nature 376: 313-320
/
TSÜKLIINI
KINAAS
TSÜKLIIN RAKUTSÜKLI FAAS
CDK4/6 D1, D2, D3 varane G1
CDK2 E1, E2 hiline G1, G1/S
üleminek
CDK2 A S
CDC2 (CDK1) A S/G2
CDC2 B M
Iga tsükliin paardub kindla kinaasiga kindlasrakusükli faasis
/
Tsükliinide hulk rakus muutub rakutsükli käigusTsükliine kontrollitakse läbi proteolüütilise lagundamise
Tsükliini järkjärguline tõus ja kiire lagundamine tagab rakutsükli 'hammasrataste' liikumiseühes sunas
D-tsükliinid erinevad: nende puhu ei toimu järske kõikumisi rakutsükli käigus
D-tsükliinid on reguleeritud mitogeensete signaalide poolt
·
·
·
·
/
Erinevad mitogeensed rajad konvergeeruvad tsükliinD regulatsioonilKasvufaktorid stimuleerivad kiire tsükliin D taseme tõusu rakus, samuti kasvufaktorite 'äravõtmine' koekultuuri tingimustes viib tsükliin D lagundamiseni (poolestuseg ~30 min)
Kasvufaktorite rajad mis kontrollivad tsükliin D ekspressiooni:
GF türosiin kinaas reseptorid Ras Raf/RalGDS Fos/Jun D1
GF HER2/Neu Sp1 D1
Wnt -kateniin Tcf/Lef D1
Tsütokiinid tsütokiini retseptorid Jak STAT D1
Hedgehog Patched Smoothened Gli D1
Erinevad ligandid erinevad retseptorid IKK NF- B D1
· → → → → →
· → →→→ →
· →β → →
· → → → →
· → → → →
· → → → κ →
/
Kolme D-tüüpi tsükliini induktsioonimuster erinebSIGNAALI ALLIKAS SIGNAALIRADA D TSÜKLIINI ISOVORM
RANK retseptor NF B D1
Prolaktiini retseptor Jak/Stat D1
Östogeeni retseptor AP1 (Fos/Jun) D1
Focal adhesion kinase D1
HER2/Neu E2F ja Sp1 D1
WntFrizzled kateniinTcf/Lef D1
Bcr/Abl D2
FSH retseptor cAMP D2
erinevad mitogeenid Myc D2
IL4/7 retseptor D2
IL5 retseptor STAT3/5 D3
E2F transkriptsiooni faktorid D3
κ
β
/
Tsükliin D1 regulatsiooni mehhanismidGF-Ras-Raf-Erk ja Wnt signaalirada kontrollib tsükliin D1 ekspressiooni ning stabiilsust ja GSK3on siin negatiivne regulaator.
β
Stabiilne 5–6 tundi kestev ERK signalisatsioon indutseerib tsükliin D1 ekspressiooni kesk-G1faasis (~8–9 tundi peale mitogeense stimulatsiooni algust vaikeolekus rakkudes)
PI3-kinaas/Akt fosforüleerib glükogeen süntaasi kinaasi 3 (GSK3 ) ja inhibeerib selleaktiivsuse
GSK3 fosforüleerib tsükliin D1 Thr286 mistõttu see translokeerub tuumast tsütoplasmasseja satub lagundamisele
Teisalt indutseerib Wnt signaalirada D1 ekspressiooni läbi -kateniini
·
· β β
· β
· β
-kateniini lagundamist kontrollib samuti GSK3
lisaks kontrollib GSK3 p27Kip1 degradatsiooni
- β β
- β
/
Tsükliin D-CDK4/6 lükkavad raku läbi Restriktsiooni-punkti
Rakud vastvad rakuvälistele mitogeensetele signaalidele kuni R-punktini
Peale R-punkti läbimist on tsükliinide E A B regulatsioon automaatne jaautonoomne
·
· → →
/
Lisaks tsükliinidele reguleerivad tsükliin-sõltuvaidkinaase ka CDK inhibiitorid (CdkI)Praeguseks on kirjeldatud seitse erinevat CdkI-d
INK4 valgud (inhibitors of CDK4), mis inhibeerivad spetsiifiiselt ainult CDK4 ja CDK6
p21Cip1 , p27Kip1 , p57Kip2 : inhibeerivad kõiki teisi tsükliin-CDK komplekse
·
p16INK4A , p15INK4B , p18INK4C , p19INK4D-
·
Crystal structure of the p27Kip1 cyclin-dependent-kinase inhibitor bound to the cyclin A-Cdk2 complex. Russo, A.A., Jeffrey, P.D., Patten, A.K., Massague, J.,Pavletich, N.P. (1996) Nature 382: 325-331. Structural basis for inhibition of the cyclin-dependent kinase Cdk6 by the tumour suppressor p16INK4a. Russo, A.A.,Tong, L., Lee, J.O., Jeffrey, P.D., Pavletich, N.P. (1998) Nature 395: 237-243.
/
TGF- indutseerib p15INK4BβTGF- peamine raku jagunemist pidurdav mehhanism töötab läbi p15INK4B
p15INK4B blokeerib tsükliin D-CDK4/6 komplekside moodustumise ja inhibeeribolemasolevaid
Ilma aktiivse tsükliin D-CDK4/6 pole rakutsükkel võimeline arenema läbi varase ja keskmiseG1 faasi R-punktini
Kui rakk on juba R-punkti läbinud pole enam D-CDK4/6 aktiivsus vajalik
Peale R-punkti muutub rakk 'tundetuks' ka TGF- inhibeerivale toimele
CDKN2A/B lookuse naabruses asuv 9p21.3 lookus on üks sagedamini muteerunud piirkondieri tüüpi vähkides (vt. Supplementary Table 3)
· β
·
·
·
· β
·
/
p21Cip1 aktiveeritakse vastusena stressilep21Cip1 toimib läbi terve rakutsükli
TGF- indutseerib nõrgalt ka p21Cip1
Peamine p21Cip1 induktor on DNA kahjustused
p21Cip1 inhibeerib E-CDK2, A-CDK2, A-CDC2, B-CDC2 komplekse
Kui DNA kahjustused on parandatud, siis võetakse p21Cip1 -blokk maha
p21Cip1 inhibeerib ka DNA replikatsiooni masinavärgi valku PCNA ()
·
· β
·
·
·
·
Pilt: p21 (A, punane) blokeerib PCNA-l (sliding clamp) DNA polümeraasi seostumiskoha (B, C). http://www-bioc.rice.edu
/
Mitogeenne signalisatsioon inhibeerib p21Cip1 jap27Kip1PKB/Akt inhibeerib p21Cip1 ja p27Kip1 tuuma lokalisatsiooni
HER-2/neu-vahendatud raku jagunemine käib läbi Akt aktivatsiooni,
Akt seostub p21Cip1 ja fosforüülib selle treoniin-145, põhjustades tsütoplasmalokalisatsiooni
Akt raja blokeerimine dominant-negatiivse Akt mutandiga taastab p21Cip1 tuumalokalisatsiooni ja rakkude jagunemist inhibeeriva toime
Sarnaselt toimub p27Kip1 inhibitsioon, seal fosforüülib Akt treoniin-157
Aktiveeritud Akt ekspresseerivad rakkudes ei suuda p27WT tekitada G1 arresti
Tsütoplasmaatiline p27 esines 41% (52/128) inimese primaarsetes rinnavähkides kus onkõrge Akt aktivatsiooni (Liang et al. 2002)
Tsütoplasmaatiline p27 korreleerub halva prognoosiga
·
·
·
·
·
·
·
/
p21/p27 dko rakkudes on vähem tsükliin D-CDK komplekse Cheng et al. 1999.
p21Cip1 ja p27Kip1 seostumine on vajalik D-CDK4/6aktivatsiooniks
Primaarsed hiire fibroblastid, millespuuduvad nii p21 ja p27 ei suudamoodustada aktiivseid tsükliin D-CDKkomplekse,
Tsükliin D-CDK4/6 tase tõuseb rakusvarases-keskmises G1 faasis ja korjab ärap21 ja p27 nii, et see ei saa inhibeeridatsükliin E-CDK2
·
ekspresseerivad palju vähem tsükliinD ning
neis ei lokaliseeru tsükliin D tuuma
-
-
·
/
RB fosforülatsioon reguleerib restriktsioonipunktiläbimist
Kui rakud läbivad M/G1 ülemineku, siis RBdefosforüleeritakse täielikult (PP1fosfataas)
G1 faasis tsükliin D-CDK4/6hüpofosforüleerib RB
Hüpofosforüleeritud RB muutub tsükliin E-CDK2 substraadiks jahüperfosforüleeritakse
RB jääb hüperfosforüleerituks koguülejäänud raku tsükli (kuni jälle G1-ni)
·
·
·
·
/
RB valgud ehk 'taskuvalgud' (pocketproteins)RB, p107 ja p130 moodustavad 'taskuvalkude' perekonna
RB on 25% homoloogne ülejäänud kahega ja p107 ning p130 on omavahel 54% identsed
RB on hiirele embrüonaalselt surmav, kuid p107 või p130 -il pole silmaganähtavat fenotüüpi
RB omab tugevat tuumorsupresorfunktsiooni ja p107/p130 mutatsioonid on vähkidesharvad
·
·
·
·
Molecular mechanisms underlying RB protein function. Frederick A. Dick & Seth M. Rubin. Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 297-306 (May 2013)doi:10.1038/nrm3567
/
Imetajate E2F TF perekondKaheksa geeni E2F1-8, kolm toimivad aktivaatoritena (E2F1-3a) ja ülejäänud repressoritena(E2F3b-8)
E2F1-6 valgud sisaldavad DP1,2 ( ) heterodimerisatsiooni domäänija seostuvad DNA-le heterodimeerina koos DP valguga
E2F1-5 valgud seovad RB 'taskuvalke' üle C-terminaalse domääni
Taskuvalgud pRB, p107 ja p130 seovad E2F ainult hüpofosforüleeritud olekus
·
·
·
·
Pilt: Signalling In The Epidermis: The E2f Cell Cycle Regulatory Pathway In Epidermal Morphogenesis, Regeneration And Transformation, doi:10.7150/ijbs.1.87
/
RB valgud toimivad läbi E2FHüpofosforüleeritud pRB seostumine maskeerib aktivaatoritel transkriptsiooni aktivatsioonidomääni
Repressorvalkude E2F4 ja E2F5 seostumine taskuvalkudele (peamiselt p107 ja p130)moodustab E2F märklaudgeenide promootoritele repressorkompleksid
Hüpofosforüleeritud RB valgud seostuvad ka DNA-l olevatele E2F valkudele vaigistadesniimoodi geeniekspressiooni. Kompleksi 'tõmmatakse' ka histooni deatsetülaas HDAC mismuudab kromatiini struktuuri transkriptsioonile mittepermissiivseks
pRB seostub eelkõige E2F1-3 valkudele ning p107 ja p130 E2F4/5
·
·
·
·
/
pRB valkude E2F TF seostumiskoht onkonserveerunud
Rb tasku on konserveerunud (mida punasem seda konserveerunum) nii eri liikidel kui valguisovormidel p107 ja p130 valkudel (Lee et al. 1998). Kollane on E2F2 peptiid mis onseostunud taskusse.
Tärniga nool näitab B-domäänil asuvat LxCxE-motiivi sisaldavate valkude (HPV E7)seostumiskohta (Lee et. al 2002)
HPV E7 valgu seostumine RB-le rikub 'tasku' konformatsiooni nii, et see ei saa enam sidudaE2F valke
·
·
·
/
Transkriptsioonist sõltumatu RB rakutsükliregulatsioonRB stabiliseerib p27Kip1
RB vahendab ka p27 proteolüütilist lagundamist vahendava Skp2 degradatsiooni
Skp2 on ubikvitiini ligaasi kompleksi p27 ära tundev subühik
RB seob Skp2 üle oma C-terminaalse domääni ja esitleb selle APC/C () lagundamisele
APC seostub RB B-boxi LxCxE-motiivi sisaldavate valkude seostumiskohta
·
·
·
·
/
pRB hüperfosforüleerimist võimendab positiivnetagasisideG1/S faasi kiire ülemineku tagavad positiivse tagasiside mehhanismid
Tsükliin E transkriptsiooni reguleerib E2F ja hüpofosforüleeritud RB repressioonist vabanevE2F võimendab edasist kiiret RB hüperfosorüleerimist läbi tsükliin E-CDK2
p27Kip1 on tsükliin E-CDK2 substraat ning fosfo-p27 määratakse ubikvitiin-proteasoomselelagundamisele
·
·
/
Vähis mitmeid strateegiaid RB funktsioonitasalülitamiseks, MYC
RB geeni mutatsioonid retinoblastoomis, osteosarkoomis ja väikserakulisteskopsukasvajates
HPV E7 seostumine pRB-le inaktiveerib selle >99.7% emakakaela vähkides
Myc-Max aktiveerib tsükliin D2 ja CDK4 transkriptsiooni
Myc on üle ekspresseeritud 15-30% vähkides
Lisaks aktiveerib Myc-Max ka Cul1 transkriptsiooni, mis on SCF(SKP2) sisaldava kompleksiE3 ubikvitiin ligaas ja ubikvitineerib fosfo-p27kip
Myc-Miz1 heterodimeer inhibeerib aga p15INK4B ning p21Cip1, p27Kip1 transkriptsiooni
·
·
·
·
·
·
/
Tsükliini kinaasi inhibiitorid toimivad läbi RBD-tsükliini inhibiitorite p15/p16 mutatsioonid ja RB mutatsioonid välistavad teineteistvähkides
·
Link andmetele: RB vs CDKIs
/
Normaalselt TGF- supresseerib Myc ekspressiooniVõttes arvesse Myc-i võimet p15INK4B ekspressioon kinni panna ja seega TGF- jagunemistkontrolliv mõju nullida, siis
Tabel. Erinevates rakutüüpides CdkI üles-regulatsioon varieerub vastusena TGF-stimulatsioonile, kuid Myc alla-regulatsioon on universaalne.
RAKUD P15INK4B P21CIP1 P57KIP2 CMYC
epiteeli eellasrakud üles üles alla
neuraalsed eellasrakud, astrotsüüdid üles üles alla
hematopoeetilised eellasrakud üles alla
T rakud üles alla
ββ
normaalsetes rakkudes on Myc geen siiski TGF- raja kontrolli all
Fosfo-SMAD3 istub koos E2F4/5 (repressiivsed E2F valgud), p107 ja C/EBP valkudega Mycgeeni promootoril ja paneb sellelt transkriptsiooni efektiivselt kinni
· β
· β
β
/
Molekulaarsed muutused kasvajates mis viivadrakutsükli deregulatsiooniniErinevat tüüpi kasvajates kuni 90% vähke sisaldab muutusi rakutsükli regulatsioonis.
/
Lingid teistele loengutele
Sissejuhatav loeng
Vähitüübid
Onkoviirused
Onkogeenid
Retseptorid
Signaalirajad
Tuumorsupressorgeenid
Rakutsüklikontroll
·
·
·
·
·
·
·
·
p53 ja apoptoos
Immortalisatsioon
Tumorigenees
Genoomiterviklikkus
Mikrokeskkond
Metastaasid
Immuunsus
Vähiravimid
·
·
·
·
·
·
·
·
/
