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PRACTICA
# 6
TINCION DE
SCHEFFER-
FULTONMESA # 5
Introducción
Dado que la clasificación de las bacterias depende principalmente de su tamaño, forma y propiedades de coloración, el microscopio ha sido durante mucho tiempo el instrumento principal del microbiólogo. Las preparaciones no teñidas pueden ser observadas al microscopio de contraste de fases, pero en general se utilizan preparaciones fijadas al calor y teñidas.
MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS
Cantidad Material y equipo Capacidad
descripción
cantidad Reactivos formulas
24 Portaobjetos Portaobjetos de
25x75mm
100 ml Safranina C20H19CIN4
24 Cubre objetos Cubreobjetos de
25x75mm
100 ml Alumbre de
potasio
KAI(SO4)2·12H
2O
18 Asas Bacterioló-gicas 100 ml Acido tánico C76H52O46
6 Mecheros Bunsen 100 ml Verde de
malaquita
C8H10N4O2
12 varillas de tinción
Armar varillas con
mangueras de hule
100 ml Fucsina básica C20H19N3
100 ml Fenol C6H5OH
100 ml etanol CH3CH2OH
Tinción de Sheaffer-FultonTinción de sheaffer-Fulton usado para colorear biometría hemática
para esporas está también es conocida como la de Wright.
La tinción de Sheaffer Fulton permite observar:
a.- Esporas.
b.- Cuerpos fructíferos
c.- Conidias
d.- Células gemantes.
.-¿De qué color se ven las esporas y
las células vegetativas en la tinción de
Sheafer y Fulton?
.- Verde y rojas
Las esporas
Una espora (Gr. spora=semilla) es una unidad
diminuta y simple; que se propaga sin un embrión y
sirve para la producción de un nuevo individuo de
la misma especie. Desde la espora empieza el
desarrollo del hongo en forma filamentosa.
Tipos de esporas
que existen
Clasificación de las esporas Por su función:
-En hongos, las clamidospora
-Los hipnozigotos de los hongos zigomicetos
Por su origen durante el ciclo biológico
son haploides.
La mayoría de los hongos producen mitoesporas.
Por la motilidad
es la capacidad de moverse autónoma y espontáneamente.
Partes de la espora
¿Que es un frotis? Extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra
o cultivo con objeto de separar lo más posible los
microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la
preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Posteriormente, el frotis debe ser fijado al vidrio del
portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de
tinción La fijación de una extensión bacteriana hace que las
bacterias queden inactivadas adheridas al vidrio alterando lo
menos posible la morfología y bacteriana y las posibles
agrupaciones de células que pudiera haber.
¿Que es un colorante? En química, se llama colorante a la sustancia colorida
usada en tinciones para resaltar diferentes
microorganismos. También se le llama colorante a la
sustancia capaz de absorber determinadas longitudes
de onda de espectro visible. Los colorantes son
sustancias que se fijan en otras sustancias y las dotan
de color de manera estable ante factores
físicos/químicos como por ejemplo: luz, lavados,
agentes oxidantes, etc.
VERDE DE MALAQUITAEl verde de malaquita es un colorante
débilmente básico (tiene una carga positiva
débil) y por tanto, se une débilmente a la
bacteria. Penetra en las células vegetativas.
Cuando se calienta en la preparación también
penetra las esporas.
Durante el lavado con agua,
verde de malaquita se elimina
de las células vegetativas,
pero no de la espora.
Las esporas quedan teñidas de verde y las células
vegetativas teñidas de rosa.
Características:
aspecto Solido verde
Olor Característico
pH 2.4
Punto de Fusión 159ºC
Solubilidad 110g/L en agua a 25ºC
Preparación Verde de malaquita................. 5 g
Agua destilada..................... 100 mil
Preparación:
- Disolver el colorante en el agua y dejar en reposo
durante una hora y media.
- Filtrar.
- Guardar en frasco oscuro.
PELIGROSIDAD
Nocivo en contacto con la piel y por ingestión.
Evitar contacto con los ojos.
Usar guantes adecuados.
En caso de ingestión, acúdase inmediatamente al
medico y muéstrele la etiqueta o el envase.
Ingestión: provoca irritaciones de las mucosas en la
boca, faringe, esófago y tracto gastrointestinal.
Piel: irritante
Ojos: irritante
Inhalación: causa irritación de las vías respiratorias.
SAFRANINAEl colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las células vegetativas (decoloradas por el agua).
La safranina , es un colorante biológico, de contraste que se
utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta
más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacteria s G- ; en histología
y en citología. La safranina se
usa como líquido de contraste en
algunos protocolos de tinción, coloreando
el núcleo celular de rojo.
CARACTERISTICAS:
Aspecto Liquido rojo
Olor Alcohol Etílico
Solubilidad Miscible con agua
Formula C20H19ClN4
Peso molecular 350,85 g/mol
Preparación
Safranina..................................... 0.5 g
Agua destilada............................ 100 mil
Preparación:
- Disolver el colorante y filtrar.
PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis de Bacillus sp. De la manera usual:
Colocar una pequeña gota de agua en el centro
de un portaobjetos limpio.
Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones
asépticas, una pequeña cantidad del cultivo
bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota
de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra
hasta formar una suspensión homogénea.
Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar
su evaporación acercando el porta a la llama del
mechero.
2. Cubrir la extensión con papel de
filtro (dificulta la precipitación del
colorante sobre las bacterias).
3. Depositar la preparación sobre
una platina de Koch. Añadir verde
de malaquita. Esperar un minuto.
4. Seguir la tinción con calor : en
emisión de vapores durante 5-10
minutos. Dejar enfriar.
5. Lavar con agua abundante.
Secar.
6. Teñir con safranina (dos minutos).
Lavar con agua. Secar. Observar
con objetivo de inmersión.
RESULTADOS
Luego del montaje al microscopio
óptico, se observaron bacilos Gram
positivos esporulados; asimismo se
apreciaron esporas solitarias de forma
circular y bacilos que no presentaban
formación de esporas.
Las esporas teñidas de verde y otras
bacterias teñidas de rojo.
CONCLUSION La tinción de Scheffer y Fulton emplea verde malaquita, como
colorante primario, el cual es eliminado posteriormente por el resto
de la célula bacteriana, pero no de la espora, mediante un
enjuague con agua. Como contra tinción la emplea la safranina,
la cual tiñe la célula vegetativa.
Finalmente podemos mencionar que a pesar que la bacteria es
una estructura muy pequeña, por medio de la tinción con verde
de malaquita, el cual requirió del calor para la penetración; se
pudo observar la estructura interna de la célula bacteriana,
particularmente las endeosporas. En este experimento se utilizó una
tinción simple debido a que la misma permite que se coloree toda
la célula excepto la espora que se observa de un tamaño bien aceptable
El colorante Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en
caliente. La Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas
vegetativas. Las endoesporas, tras la primera tinción, no perderán
el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas
vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante
