TOMA DE MUESTRAS Y LABORATORIO

EN INFECCIONES ORALES

TEMARIO: CONSIDERACIONES

Infecciones asociadas :

Agentes asociados:

Metodología de búsqueda etiológica

Identificación y susceptibilidad

INFECCIONES

Manifestaciones orales de enfermedades sistémicas

Locales:

Caries

Periodontitis

Ulceras orales

Candidiasis

Actinomycosis

Tuberculosis y otras

AGENTES

Porphyromonas gingivalis*

Tannerella (Bacteroides) forsythia

Aggregatibacter actinomycetencomitans*

Streptococcus spp (hasta nivel especie)

Etc etc

Dificilidentificación

BACTERIAS - TINCION DE GRAM

POSITIVAS NEGATIVAS

COCACEAS BACILOS COCACEAS BACILOS

En racimo:

Staphylococcus spcoagulasa: (+) S. aureus

(-) S. coag. neg.S. saprophyticusS. epidermidis

Tetradas:Micrococcus sp

En pares o cadenas:

Enterococcus sp

Streptococcushemólisis: () S. pneumoniae

() S. viridans() muchas() S. pyogenes (A)() S. agalactiae (B)() S. grupo C (mitis)() S. grupo D (bouis)() S. grupo F() S. grupo G

Otros:

PeptoestreptococcusPeptococcusLeuconostocAerococcusLactococcusPediococcus

Difteromorfos:

CorynebacteriumPropionibacterium*

Grandes, con esporas:

Clostridium*Bacillus

Ramificados:

NocardiaActinomyces*

Otros:ListeriaLactobacillusMicobacterias

Diplococos:NeisseriasBranhamella

Cocaceas anaer:

Veionellas*

Cocobacilos:

AcinetobacterKingellaPasteurellaBrucella

Enterobacterias: Fermentan glucosa

Oxidasa -

L(+): E. coliK. pneumoniaeEnterobacter spCitrobacter sp

L(-): Proteus spProvidencia spSerratia sp Morganella spSalmonella** Shigella**

Yersinia**

No fermentadores:

Acinetobacter spPseudomonas spAlcaligenes spFlavobacterium spStenotrophomonasBurkholderia sp

Fastidiosos:Haemophilus spAggregatibacterCardiobacteriumEikenellaKingellaCapnocytophagaBordetella

Fermentadores glucosa Oxidasa +Vibrio**Aeromonas**

Otros:Bacteroides*Fusobacterium*Prevotella*

* Anaerobios

** Enteropatógenos

Medicina

EXÁMENES

Generales :

Hemograma

Proteina C Reactiva/VHS

Hemocultivos

Locales:

Gram /Cultivo tejido corriente/hongos

Reacción polimerasa en cadena

Sospecha de infección sistémica: derivar para manejo conjunto con

infectologos

DILEMAS

Dificultades de carácter técnico :

1. Muestra no exenta de contaminación con fluido oral y/u otro contaminante

2. Medios de cultivo óptimos para el desarrollo de los verdaderos patógenos no siempre disponible

3. Identificación precisa de ellos limitada1. Bioquímica tradicional

2. Bioquímica comercial (semi/automatizada)

3. PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

4. Determinación de susceptibilidad (no) estandarizada para todos.

5. Susceptibilidad in vitro v/s biopelículas

Microbiología endodóntica: últimos avances.

Rev. Estomatológica visión dental Vol9 N°3 2006 Lima Peru.

Luis Chavez de Paz, U. de Malmö, Suecia.

METODOLOGÍAS

1. Cultivo

Ampliamente distribuido en laboratorios clínicos

Identifica y apoya con determinación de susceptibilidad

Tiempos de espera entre 48 a 96 hrs o más si se incluyen anaerobios (7 días).

Requiere conocimiento de microbiología oral para hacer dgco apropiado… laboratorios de hospitales no preparados para ello!

Identificación limitada a métodos utilizados:

Clásico (batería bioquímica): generalmente hasta género en muchos patógenos orales

Semi-automatizado: regular concordancia, requiere confirmaciones (ej. galerías API)

Automatizado: buena concordancia, algunas especies no posible identificar

METODOLOGÍAS

2. Biología molecular

Limitado a laboratorios especializados y algunos adicionados a laboratorios clínicos de rutina

Métodología que permite identificar la mayor diversidad bacteriana en boca

Métodos diversos a revisar:

PCR tiempo real

PCR multiple

Identificación por ARNr16S

Arrays

QUÉ ES LA BIOLOGÍA

MOLECULAR O PCR

El proceso de detección de un agente infeccioso poramplificación genética se desarrolla de manerahabitual en tres etapas:

1° Extracción y purificación de los ácidos nucleicosdel microorganismo de la muestra biológica

2° Amplificación de un segmento seleccionado delgenoma del microorganismo mediantereacción en cadena de la polimerasa, es decir,la PCR propiamente dicha.

3° Detección de los fragmentos amplificados en laPCR (amplicones) por electroforesis en gel deagarosa o mediante hibridación con sondasespecíficas. En general todo este proceso sueledurar aprox 24 h .

PCR TIEMPO REAL

Los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior.

Mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.

Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación.

Al ser simultánea se acortan los tiempos. Promedio 50 minutos. .. Puede ser múltiple además.

PCR MULTIPLE

Reacciones que consiguen amplificar simultáneamente y enun único tubo diferentes secuencias diana,permitiendo la detección e identificación simultánea dedistintos genes de interés.

Usos en dgco de sindromes clínicos como neumoniacomunitaria, meningitis, etc.

ARRAYS

Los chips o arrays de ADN son una serie de sondas de ADN unidas a un soporte sólido en una disposición regular y prefijada.

El ácido nucleico diana que será detectado puede ser ADN o ARN y previamente a la hibridación debe ser marcado con una sustancia fluorescente o radiactiva.

La principal ventaja con respecto a PCR es que pueden detectarse en un único procesamiento miles de genes.

Investigación de la patogenia bacteriana

análisis de la evolución bacteriana y epidemiología

estudio de los mecanismos de acción y de resistencia de los antibióticos

diagnóstico microbiológico de las enfermedades infecciosas.No disponible clinicamente

ANÁLISIS DEL ARN

RIBOSOMAL 16 S

Molécula muy antigua, presente en todas las bacteriasactuales.

Estructura y función constantes durante un tiempo muyprolongado, de modo que las alteraciones en lasecuencia reflejan probablemente cambios aleatorios .

El tamaño relativamente largo de los ARNr 16S (1.500nt)minimiza las fluctuaciones estadísticas.

Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los ADNr16S existen bases de datos amplias, en continuocrecimiento que se compara con lo obtenido

Directo de cultivo puro o de muestra tejido/fluido estéril.

Útil en no cultivables o emergentes.

LIMITACIONES BIOLOGÍA

MOLECULAR

No disponible en laboratorios clínicos generales

Identifica MO vivos y muertos

No posible relacionar rol patógeno

No reproducible en cultivo

No permite determinación susceptibilidad

Riesgos contaminación toma muestra y procesamiento

Patógeno único? --- PCR múltiple? ---numerosas PCR?

Identifica con mayor precisión y rapidez

Permite cuantificar

PCR DISPONIBLES

Virus: herpes, enterovirus papiloma

Bacterias diversas:Aggregatibacter

actinomycetemcomitansActinomyces israeliiBacteroides fragilisCampylobacter rectusCapnocytophaga spp.Eikenella corrodensEnterococcus spp.Fusobacterium nucleatumFusobacterium spp.Mycobacterium avium-

intracellulare

Mycobacterium tuberculosisNeisseria gonorrhoeaePeptostreptococcus anaerobiusPeptostreptococcus microsPorphyromonas gingivalisPorphyromonas spp.Prevotella intermediaPrevotella nigrescensPrevotella spp.Streptococcus intermediusStreptococcus mutansTannerella forsythiaTreponema denticolaTreponema pallidum

TOMA DE MUESTRAS

Preparación:

Reunir material, realizar órdenes de exámenes, etiquetar tubos.

Higiene de manos y colocación de guantes (precauciones estándar que puede incluir gafas y mascarilla).

4 manos

TOMA DE MUESTRAS

Sitio exacto de la lesión

No poner en contacto con antisépticos

Rápido

Idealmente aspirar abscesos cerrados por punción o raspado, cureta (preferir por sobre hisopado) o trozo tejido biópsico (sin preservantes).

Previo a inicio de tto ATB (idealmente).

Inocular en medio de transporte aerobio/anaerobio

Transporte t° ambiente inmediato (excepto virus 4°C)

DERIVACIÓN SEGÚN AGENTE

BUSCADO

VIRUS: DETECCIÓN DIRECTA

detección elemento viral directamente desde la muestra(fase aguda 5-7 días)

frotar con fuerza mucosa para desprender células infectadas conhisopo. Conservación 4°C hasta 48 hrs o 7 días a -70°C.

Microscopía óptica+tinción: visualización de él en célulashumanas por técn.inmunológicas (IF), enzimas (ELISA) oisótopos radiactivos (RIA). No disponible virus orales.

Cultivo viral: cultivos celulares en forma de monocapas a partirde tejidos animales o humanos. Detección viral se efectúa por

1. Efecto citopático o su neutralización con sueros con Acfrente al virus sospechado.

2. Adición de Ac para detección medianteinmunoflurorescencia (identifica Ag). Shell vial.

3. Biología molecular.

VIRUS

PCR para los virus sospechados desde

muestra o cultivo viralDisponible toda la

familia HerpesVHS 1 y 2

VVZCMVVEB

HHV-6 y 8Echo

Coxsakie

Celulas no infectadas de riñón de conejo

Celulas infectadas de riñón de conejo

VHS-1

HONGOS

1. Cultivo hongos (toma y transp similar a bacterias)

Filamentosos: lento crecimiento.

Levaduriformes: rápido crecimiento, contaminantes/florav/s patógenos.

Ojo con: dermatofitos, dimórficos como Histoplasma (noforman parte de la rutina de laboratorios)

Metodología:

Siembra en agar sabouraud c/s CAF

Morfología colonias, micromorfología.

Levaduras: medios cromógenos, galerías identificación: API,ID 32C; Sistemas automatizados: Vitek .

Filamentosos: morfología colonia, tinción de colonia conazul de lactofenol-

CHROMagar Candida. C. albicans ATCC 90028 (arriba)C. krusei ATCC 6258 (derecha)C. glabrata (abajo), C. tropicalis (abajo izq)C. parapsilosis ATCC 90018 (arriba izq)

Candida krusei

BACTERIAS

1. Cultivo corriente:

Siembra en medios sólidos enriquecidos ydiferenciales (ASC-ACH-MC) y caldos (tioglicolato).

Adicionar anaerobios si lo solicitan y muestra no estáaireada.

Identificación a nivel especie solicitada.

2. Antibiograma:

La mayoría de los lab: difusión con disco, insuficientepara estomatología.

Requerido por tipo de patógenos orales: CIM dilucióno bien E test por difusión.

IDENTIFICACION

BACTERIANA

Identificación automatizada: sistema Vitek

Alrededor de 94% identificación especies cocáceas

Bajo nivel discriminación en alrededor 5%

Menos 1% sin identificar

Además incluye susceptibilidad con CIM

Optimo para laboratorios clínicos no moleculares.

SUSCEPTIBILIDAD

BACTERIANA

1. Susceptibilidad por difusión en agar:

1. Con discos

2. E-test (CIM)

2. Susceptibilidad por dilución

1. En placa (agar)

2. En caldo (tubos)

3. Microdilución

SUSCEPTIBILIDAD

BACTERIANA

1. Susceptibilidad por difusión en agar:

1. Con discos

2. E-test (CIM)

2. Susceptibilidad por dilución

1. En placa (agar)

2. En caldo (tubos)

3. Microdilución

ANTIBIOGRAMA: NORMA

CLSI

1. ANAEROBIOS: CIM

1. Beta lactámicos sólos y en combinación

2. Lincosamidas (clindamicina)

3. Carbapenémicos

4. Quinolonas (moxifloxacino)

2. STREPTOCOCCUS no beta hemolíticos (CIM)

1. Penicilina

2. Cefalosporinas 3° gen

3. Lincosamidas (discos)

4. Quinolonas (discos)

3. Otros: de acuerdo a la rutina de laboratorio

CONCLUSIONES

Diagnostico de laboratorio de infecciones estomatológicas limitado a:

Automatización y tecnologías del Laboratorio

Conocimiento de patógenos orales de profesionales del laboratorio

Solicitud expresa de búsqueda de patógenos puntuales por odontólogos

Comunicación directa entre ellos oportuna

Toma de muestra de buena calidad

Gracias