XII Национална конференция с международно участие"Природни науки 2014" (NCNS2014)

Автори: Надежда Петкова, Манол Огнянов,Мина Тодорова, Пантелей Денев

Катедра “Органична химия“Университет по хранителни технологии - Пловдив

Ултразвукова екстракция и характеристика на инулин от

корени на бял оман (Inula helenium L.)

Inula helenium L. (бял оман)

Лечебно растение от сем. Сложноцветни Централна и Южна Европа, Северна

Америка, Азия Североизточна и Източна България, Стара

планина – до 800 м надморска височина Действа спазмолитично, антисептично,

диуретично, противокашлечно и предпазва от развитие на ракови клетки.

Инулин – 11 - 45 % Използваема част – корените Количеството на инулина се влияе от

природо-климатичните условия

Обща характеристика на инулин

• Фруктан • Инулинът е полидисперсен

растителен полизахарид, чиято верига е изградена основно от

• β-фруктофуранозидни звена, свързани (2→1), като много често в единия си край сe съдържа α-глюкопиранозен остатък свързан (1→2).

• Степен на полимеризация (DP) - 2 до 70

• Бяло прахообразно вещество, без мирис и страничен аромат, с неутрален вкус

• Фруктоолигозахариди – инулини с DP от 2 до 12

O

H

HO

H

HO

H

O

OHHH

OH

H2C

CH2OH

HO

OHO

CH2OH

CH2OH

HO

HO

O

n

O

GFn

O

H

HO

H

HO

H

O

OHH

H

OH

CH2

CH2OH

HO

OHO

CH2OH

CH2OH

HO

OH

O

n

O

Fm

CH2

“I give this name to a new vegetable principle, lately discovered by Rose in the root of inula helenium (elecampane)”.

Th. Thomson, 1818

В литерарурата терминът инулин е използван за пръв път от Thomson през 1818 г., за да се наименува веществото, което през 1804 г. германският учен Rose изолира чрез екстракция с гореща вода от растението бял оман (Inula helenium).

Източници на инулин и олигофруктози

Методи за екстракция и анализ на инулин

- Екстракция с гореща вода- Класическа екстракция- Екстракция чрез прилагане на

ултразвук- Микровълнова екстракция

Методи за анализ:- спектрофотометрично- HPLC - IR – спектроскопия- NMR

Здравословен ефект

• Диетични фибри• Пребиотик• Нискокалоричен• Имуностимулатор• Спомага абсорбцията на Са

и Мg• Понижава нивото на

инсулина, триглициридите в кръвта и кръвната захар

Приложение на инулин

• Заместител на мазнини в храните: - кисело мляко - сирена за мазане - сосове - замразени млечни десерти - месни продукти - сирена с намалено съдържание на

мазнини • Замества захарта – шоколади• В тестени и сладкарски изделия,

екструдирани храни• Източник на разтворими фибри• Стабилизатор на пени• Структуро-определящ компонент• Има идеална разтворимост• Подобрява вкуса

Цел

Целта на настоящото изследване е чрез прилагане на ултразвуково въздействие да се изолира полизахаридът инулин от корени на лечебното растение бял оман (Inula helenium L.) и да се определят основните му физикохимични характеристики.

Сухи корени от бял оман

Смилане едрина на частиците 1 мм

Екстракция (трикратна)40 min, при 80 °С и yлтразвук 35 kHz

Филтруване (0.45 μm )

Филтрат

Алкализиране с 2 % Ca(OH)2 до pH 8Престой 60 min при 25 °СФилтруване

Пулпа от бял оман

дейонизирана вода (1:100)

Неутрализация с оксалова киселина Пречистване с активен въгленФилтруване

Филтрат

Утайка

Филтрат

Концентриране, охлаждане на екстракта до 2-5 °СУтаяване с 95 % ЕtOHПрестой 12 часа при 4 °СЦентрофугиране (3000 rpm, 30 min)

Супернатанта

Утайка

Промиване с ацетон Разтваряне в десилирана водаУтаяване с 96 % етанолЦентрофугиране (3000 rpm, 30 min)

Лиофилизация

Утайка

Инулин от бял оман (чистота 95 %)

Утайка

Супернатанта

Промиване с 70 % ЕtOH

Метод 1

Сухи корени от бял оман

Смилане едрина на частиците 1 мм

Екстракция (трикратна)40 min, при 80 °С и yлтразвук 35 kHz

Филтруване (0.45 μm )

Филтрат

Алкализиране с NaOH до pH 7, охлжданеПречистване през колона пълна с хитозан имобилизиран върху носител силикагел

Пулпа от бял оман

дейонизирана вода (1:100)

Елуат

Утайка

Концентриране, охлаждане на екстракта до 2-5 °СУтаяване с 95 % ЕtOHПрестой 12 часа при 4 °СЦентрофугиране (3000 rpm, 30 min)Супернатанта

Утайка

Промиване с ацетон Разтваряне в десилирана водаУтаяване с 96 % етанолЦентрофугиране (3000 rpm, 30 min)

Лиофилизация

Утайка

Инулин от бял оман (чистота 93 %)

Супернатанта

Промиване с 70 % ЕtOH

Метод 2

Материали и методи

• Определяне точка на топене – на апарат Кофлер

• Определяне на специфичния ъгъл на оптично въртене - Automatuc digital polarimeter РЗ001RS, KRÜSS (Germany), при λ=589 nm.

• Определяне на редуциращите групи (PAHBAH) – спектрофотометрично при λ=410 nm.

• Определяне на белтъчно съдържание – метод на Брадфорд.

• Определяне на DP и молекулната маса на изолирания инулин.

Спектрофотометрично опредляне на инулин

Схема на реакцията на Селиванов

OH

CH2OHHOH2CO

HO

OH[ H+]

-3xH2O

CHOHOH2CO

[ H+]

-3xH2O

O

O

CH2OH

HOO

OH

OH

2

фруктоза 5-HMF резорцинол

λ=480 nm

Ход на анализа: - 100 μL проба (екстракт), 100 μL резорцинол (1 mg/cm3), 100 μL

тиоуреа (0,1 %), 800 μL EtOH (95 %) , 900 μL k.HCl (37 %) - Нагряване при 80 ºС за 8 min - Охлаждане, доливане до 10 cm3

- Измерване на абсорбцията при 480 nm

тиокарбамид

Където:• x – концентрацията на фруктоза, отгoваряща от

стандартната права, μg• Vепр – обем на градуирана епруветка, 10 cm3

• Vk – обем на колбата, в която е събиран и долят екстракта, cm3

• К1= коефициент за влага

• К2=0.91, коефициент на хидролиз на инулин• P– масата на претеглената проба (изсушена), g• 100 μL – обем на взетата проба (екстракт)

HPLC АНАЛИЗ НА ИНУЛИН ИЗОЛИРАН ОТ БЯЛ ОМАН

Скорост на потока: 1 ml/minОбем на инжектирана проба: 20 µL

Колона: Shodex® Sugar SP0810 с Pb2+ (300 mm x 8.0 mm, 5 μm)

Температура на колоната: 85 °C

Мобилна фаза: дейонозирана вода

Детектор: RID-10A

Стандартна права за определяне на инулин: Y=769884x+24074R2=0.999

IR-FT СПЕКТРОСКОПИЯАпарат: Nicolet FT-IR Avatar Nicolet Termo Science spectrometerIR-FT спектъра на изолираното вещество е регистриран в КBr таблетка в диапазона от 4000-400 cm-1

Резултати

• Бяло прахообразно вещество с жълтеникъв отенък, без мириз, с неутрален вкус, разтворимо в гореща вода

• Положителна реакция с реактив на Селиванов – положителен тест за кетози

• Фруктозно съдържание – над 89 %• Чистота 95-97 %

Физико-химична характеристика на изолираното вещество

mp, °C Белтъчно съдържание,

%

Редуциращи групи, %

DP Mm, kDa

Инулин от бял оман (Метод 1)

178,5-180

-24 1.0 2.9 33 5.3

Инулин от бял оман (Метод 2)

178-180

-23 0.9 3.1 30 4.9

Търговски инулин от цикория

176 -33 0.2 2.8 22 3.6

Таблица 1 Физико-химична характеристика на изолираното вещество

HPLC-RID анализ на инулин

Mobile phase: deionized waterColumn: Sugar SP0810 with Pb2+

(300 mm x 8.0 mm, 5 μm)Column temperature: 85 °C Flow rate: 1 ml/minInjection volume: 20 µLDetector: RID- 10A

O

H

HO

H

HO

H

O

OHHH

OH

H2C

CH2OH

HO

OHO

CH2OH

CH2OH

HO

HO

O

n

O

IR-FT спектър на изолирания полизахарид

ν(OH)3330 cm-1

β 2→1 -гликозидна връзка817, 874, 933 cm-1

ν(С–С) 1170 cm−1

ν(С–О) 1087 cm−1

ν(С–О–С) 1030 cm−1

νC-Has (CH2)

2931 cm-1

νC-Hs(CH2)

2880 cm-1

05001000150020002500300035004000

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

2,6

Thu Sep 12 13:17:39 2013 (GMT+01:00)

Wavenumbers [1/cm]

Tra

nsm

ittan

ce

Таблица 2. Отнасяне на характеристичните ивици от IR-FT спектъра на изолирания полизахарид от Inula helenium L.

Интервал на характеристичните честоти cm-1*ч

Експериментални честоти, cm-1

Отнасяне

3200-3400 3382 νО-Н(ОН); ir H-връзки

2933-2981 2929 νC-Has(CH2)

2850-2904 2088 νC-Hs(CH2)

1664-1634 1647 Абсорбция н вода1416-1430 1456 δC-H

s (CH2)1335-1336 1338 βо-н (ОН)1225-1235 1220 βо-н (ОН)1125-1162 1141 νC-O-C

as (C-O-C)

1015-1060 1029 νC-O (C-O)985-996 985 νC-O (C-O)930 933 α-D-Glcp остатък във

веригата892-895874

873 δ(C1-H), вибрация на пръстена (2-кетофуранози )

817 817 2-кетози

Заключение•Приложен е ултразвуков метод за изолиране на инулин от корени на бял оман (Inula helenium L.), както и два подхода за пречистване на получените екстракти – действие с активен въглен и пропускане през колона с хитозан-силикагелни частици. И при двата метода се получава добър добив и висока чистота на целевия продукт.•Изолираният инулин се отличава с висока степен на полимеризация DP 30-33 и молекулна маса, което го характеризира като дълговерижен и високомолекулен. •Тези характеристики определя до голяма степен неговите функционални свойства и последващо му приложение като потенциален пребиотик, имуномодулатор и текстуриращ агент в храните.

В чест на 110 години от рождението на Проф. Стойко Стойков – основател на катедра

„Органична химия“ УХТ / към секцията „Земеделска техника и технология“ към АУ

Пловдив (1948 г.)/