2014 - Estudio de las relaciones del morfotipo Nosotocoida limicola con los parámetros operacionales y fisico-químicos en EDAR de la Comunidad Valenciana

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(PROYECTO FINAL DE MÁSTER INTERUNIVERSITARIO EN INGENIERÍA AMBIENTAL)

Autora:

SARA CALVO GARCÍA

Directores:

Dr. JOSÉ LUIS ALONSO MOLINA

Dr. LUIS BORRÁS FALOMIR

Valencia, JULIO de 2014.

MÁSTER EN INGENIERÍA AMBIENTAL.

Estudio de las relaciones del morfotipo “Nostocoida limicola” con los parámetros operacionales y físico-químicos en EDAR de la Comunidad Valenciana.

Sara Calvo García 2




AGRADECIMIENTOS

En primer lugar a José Luis Alonso y Luis Borrás, por el hecho de aceptar dirigir este proyecto,

por su dedicación y confianza a lo largo de todo el proceso, y ofrecerme esta oportunidad de aprender

junto a ellos y trabajar en este campo de investigación.

A Andrés Zornoza, por sus consejos y motivación y por otorgarme también parte de su tiempo.

A todo el Área de Química y Microbiología del Agua del Instituto de Ingeniería del Agua y

Medioambiente, por acogerme con una sonrisa cada día.

A Susana Romo, por su espíritu optimista y su franqueza, y por ser una gran consejera y amiga a

lo largo de mi formación universitaria.

A todos y cada uno de mis amigos, especialmente a José Flor, por su ánimo y apoyo inagotables

en muchos años.

A Carlos Román, por su eterna paciencia y por estar justo en el momento adecuado y permanecer

siempre ahí.

Por último a Mara y Eduardo, por su incondicional apoyo y su abnegado cariño y enorme

sabiduría.







ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN. 17

1.1. El proceso de fangos activos en la depuración de las aguas residuales. 17

1.2. El flóculo como unidad fundamental del fango activo. 18

1.3. Problemas de separación de sólidos en los fangos activos. 19

1.3.1. Formación de foaming y bulking. 20

1.3.2. Mecanismos de formación de foaming y bulking. 23

1.4. Bacterias filamentosas responsables de la formación de bulking y foaming. 23

1.4.1. Morfotipo “Nostocoida limicola”. 25

1.4.1.1. Nostocoida limicola I. 28

1.4.1.2. Nostocoida limicola II. 30

1.4.1.3. Nostocoida limicola III. 32

1.5. Identificación de microorganismos filamentosos. 34

1.5.1. Microscopía como método convencional de identificación. 34

1.5.2. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluoróforo (FISH), como

método molecular de identificación. 35

2. OBJETIVOS. 41

3. MATERIAL Y MÉTODOS. 42

3.1. Toma de muestras. 42

3.1.1. EDAR Cuenca del Carraixet. 43

3.1.2. EDAR Quart Benàger. 44

3.1.3. EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 44

3.2. Fijación y permeabilización de las muestras. 45

3.3. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA (FISH). 49




3.3.1. Tratamiento de portaobjetos FISH cubiertos con teflón. 49

3.3.2. Aplicación de las muestras a los portaobjetos FISH. 49

3.3.3. Sondas utilizadas en el estudio del morfotipo “Nostocoida limicola”. 50

3.3.4. Hibridación in situ. 50

3.4. Observación al microscopio de epifluorescencia. 52

3.5. Cuantificación de microorganismos filamentosos. 53

3.6. Parámetros físico-químicos y parámetros operacionales. 54

3.7. Análisis estadístico aplicado en el estudio. 56

3.7.1. Análisis bivariante. Coeficiente de correlación de Spearman. 56

3.7.1.1. Coeficiente de correlación de Spearman. 57

3.7.1.2. Tratamiento de los datos con el coeficiente de Spearman. 57

3.7.2. Análisis multivariante. Análisis de Redundancia (RDA). 58

3.7.2.1. Análisis canónico de Redundancia (RDA). 58

3.7.2.2. Postratamiento de los datos con la técnica multivariante RDA. 60

4. RESULTADOS. 62

4.1. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA (FISH). 62

4.1.1. Sonda Noli-644. 62

4.1.2. Sonda MC2-649. 62

4.1.3. Sonda AHW 183. 63

4.1.4. Sonda NLIMI 91. 63

4.1.5. Sonda NLIMII 192. 64

4.1.6. Sonda NLIMIII mix. 64

4.2. Cuantificación de las poblaciones del morfotipo “Nostocoida limicola”. 65




4.2.1. EDAR Cuenca del Carraixet (Línea A+B). 65

4.2.2. EDAR Cuenca del Carraixet (Línea C+D). 66

4.2.3. EDAR Quart Benàger. 67

4.2.4. EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 68

4.3. Parámetros físico-químicos y parámetros operacionales. 69

4.4. Análisis estadístico. 69

4.4.1. Análisis bivariante. Aplicación del Coeficiente de Correlación de Spearman.69

4.4.2. Análisis multivariante. Aplicación del Análisis canónico de Redundancia. 78

5. DISCUSIÓN. 90

6. CONCLUSIONES. 96

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 97

8. ANEXOS. 100




ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Nocardia amarae con tinción de Gram vista al microscopio óptico. 20

Figura 2. A) Decantador secundario con problemas de espumas biológicas causadas por la bacteria

filamentosa Microthrix parvicella. B) Salida de efluente clarificado del decantador anterior con sólidos que se

escapan en forma de macroflóculos. 21

Figura 3. Bulking filamentoso producido por la bacteria filamentosa Tipo 021N al microscopio óptico en

contraste de fases a 100x. Este fango es producto de un vertido de agua residual procedente de la industria

vinícola (Hydrolab Microbiologica). 22

Figura 4. Filogenia del morfotipo “Nostocoida limicola”. 27

Figura 5. Apariencia de “Nostocoida limicola” I, a escala de 5 µm, en cadenas de cocos en una muestra de

biomasa de fango activo (Liu y Seviour, 2000). 28

Figura 6. Árbol filogenético basado en las secuencias genéticas del 16S rRNA de los aislamientos de “N.

limicola” I (aislamientos Ben) dentro del phyllum Firmicutes (Liu y Seviour, 2000). 30

Figura 7. “Nostocoida limicola” II al microscopio óptico a 1000x con tinción Neisser positiva (Grupo

Microbiología FACSA, 2012). 30

Figura 8. Árbol filogenético basado en la secuenciación del 16S rRNA de “Nostocoida limicola” II

(aislamientos Ben y Ver) dentro del grupo de las Actinobacterias (Seviour et al., 2002). Se muestran los

últimos aislamientos identificados de este morfotipo como Tetrasphaera jenkinsii (cepas Ben 67, 68, 14, 17 y

74), Tetrasphaera veronensis (cepa Ben 70) y Tetrasphaera vanveenii (cepas Ver 1 y Ver 2) (McKenzie et al., 2006,

Seviour y Liu, 2006). 31

Figura 9. Cepa Ben 220 al microscopio óptico a 1000x. Se muestra la desigualdad en la tinción Gram del

morfotipo “Nostocoida limicola” III (Liu y Seviour, 2001). 32

Figura 10. Árbol filogenético basado en la secuenciación del gen 16S rRNA indicando la posición

filogenética de cincos aislamientos Ben (220, 222, 223, 224, 225) de “Nostocoida limicola” III. 33

Figura 11. Esquema del protocolo de hibridación in situ. 38

Figura 12. Situación actual de la taxonomía de los morfotipos filamentosos descritos por Jenkins et al.,

2004 y Eikelboom (1983) y las sondas FISH disponibles. 40

Figura 13. Vista aérea de la EDAR Cuenca del Carraixet. 43




Figura 14. Diagrama de proceso en bloques de la EDAR Cuenca del Carraixet con sistema de fangos

activos sin eliminación de nutrientes. 43

Figura 15. Vista en planta de la EDAR Quart Benàger. 44

Figura 16. Diagrama de proceso en bloques de la EDAR Quart Benàger con sistema de fangos activos y

con eliminación química de fósforo. 44

Figura 17. Vista en planta de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 45

Figura 18. Diagrama de bloques de proceso de EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer con sistema de fangos

activos, sin decantación primaria y con eliminación química de fósforo. 45

Figura 19. Esquema del paso de fijación de las muestras según el tipo de bacterias que se quieran analizar

(Gram positivas, Gram negativas o mycolata). 46

Figura 20. Objetivos APO de 60X y 100X de gran utilidad para visualizar con microscopio de

epifluorescencia. 52

Figura 21. Microscopio de epifluorescencia Olympus BX 50 del IIAMA. 53

Figura 22. Representación fotográfica de los criterios de valoración de abundancia de microorganismos

filamentosos. 53

Figura 23. Matriz de covarianzas RDA. 60

Figura 24. “Ca. Alysiosphaera europaea” a 600X. A) Muestra de EDAR Quart Benàger. B) Muestra de

EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 62

Figura 25. “Ca. Monilibacter batavus” a 600X. Muestra de EDAR Cuenca del Carraixet (línea A+B). 62

Figura 26. A) “Ca. Monilibacter batavus” a 600X perteneciente a la EDAR de Dénia-Ondara-Pedreguer.

B) La misma bacteria vista en contraste de fases, donde podemos observar que se ubica parcialmente

dentro del flóculo. 63

Figura 27. Nostocoida limicola II a 600X. Muestra de EDAR Cuenca del Carraixet (línea C+D). 63

Figura 28. Células individuales de Trichococcus sp. a 600X. Muestra de EDAR Quart Benàger. 63

Figura 29. Tetrasphaera japonica a 600X. Muestra de EDAR Quart Benàger. 64

Figura 30. Células individuales y agrupadas de Isosphaera sp. a 600X. Muestra de EDAR Dénia-Ondara-

Pedreguer. 64




Figura 31. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la línea A+B de la

EDAR Cuenca del Carraixet. 65

Figura 32. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la línea C+D de la

EDAR Cuenca del Carraixet. 66

Figura 33. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la EDAR Quart

Benàger. 67

Figura 34. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la EDAR Dénia-

Ondara-Pedreguer. 68

Figura 35. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola”

(sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR C. del Carraixet de la línea A+B. 78


(sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR C. del Carraixet de la línea C+D. 79


(sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR Quart-Benàger. 80


(sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 81


(sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet.

82


(sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet.

83


(sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la EDAR Quart Benàger. 83


(sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 84


(sondas FISH) y las variables operacionales de la línea de agua A+B, de la EDAR Cuenca del Carraixet.

85





(sondas FISH) y las variables operacionales de la línea de agua C+D, de la EDAR Cuenca del Carraixet.

85


(sondas FISH) y las variables operacionales de la EDAR Quart Benàger. 86


(sondas FISH) y las variables operacionales de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 87


(sondas FISH) y las variables físico-químicas del afluente. 87


(sondas FISH) y las variables físico-químicas del licor mezcla. 88


(sondas FISH) y las variables operacionales de las tres estudiadas. 89

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Causas y efectos de problemas de separación de sólidos del fango activado. 19

Tabla 2. Tamaños celulares de los morfotipos “Nostocoida limicola”. 26

Tabla 3. Relación del muestreo y procedencia de las muestras analizadas. 42

Tabla 4. Sondas empleadas para la identificación de los morfotipos I, II y III de “Nostocoida limicola”. 50

Tabla 5. Preparación del tampón de hibridación según el porcentaje de formamida. 51

Tabla 6. Preparación de la solución de lavado según el porcentaje de formamida. 52

Tabla 7. Criterios de valoración de Eikelboom y Jenkins (2002) para calificar la abundancia de bacterias

filamentosas. 53

Tabla 8. Parámetros físico-químicos analizados y empleados en el presente estudio. 54

Tabla 9. Parámetros operacionales de funcionamiento de las EDAR estudiadas. 55




Tabla 10. Variables físico-químicas y operacionales a introducir en el análisis de Redundancia. 59

Tabla 11. Coeficientes de correlación de Spearman de las variables físico-químicas del afluente de la

EDAR Cuenca del Carraixet (línea de agua A+B) con las sondas FISH empleadas. 69

Tabla 12. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del afluente de la línea

de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas. 70

Tabla 13. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del afluente de la

EDAR Quart Benàger con las sondas FISH utilizadas. 71

Tabla 14. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del afluente de la

EDAR Denia-Ondara-Pedreguer con las sondas FISH utilizadas. 71

Tabla 15. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del licor mezcla (LM)

de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas. 72


de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas. 72


de la EDAR Quart Benàger con las sondas FISH utilizadas. 73


de la EDAR Denia-Ondara-Pedreguer con las sondas FISH utilizadas. 73

Tabla 19. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la línea de agua

A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas. 74

Tabla 20. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la línea de agua

C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas. 74

Tabla 21. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la EDAR Quart

Benàger con las sondas FISH utilizadas. 75




Tabla 22. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la EDAR Dénia-

Ondara-Pedreguer con las sondas FISH utilizadas. 75

Tabla 23. Coeficientes de correlación de Spearman entre las variables ambientales de las tres EDAR

estudiadas y las variables respuesta (sondas FISH). 76

Tabla 24. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos

asociados al afluente de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet. 100


asociados al afluente de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet. 100


asociados al afluente de la EDAR Quart Benàger. 101


asociados al afluente de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 101


asociados al licor mezcla de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet. 102


asociados al licor mezcla de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet. 102


asociados al licor mezcla de la EDAR Quart Benàger. 102


asociados al licor mezcla de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 103

Tabla 32. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros operacionales de

funcionamiento de la EDAR Cuenca del Carraixet (línea A+B). 103


funcionamiento de la EDAR Cuenca del Carraixet (línea C+D). 103





funcionamiento de la EDAR Quart Benàger. 104


funcionamiento de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer. 104


que caracterizan el afluente de las tres EDAR estudiadas. 105


que caracterizan el licor mezcla de las tres EDAR estudiadas. 105


las tres EDAR estudiadas. 106




RESUMEN

El morfotipo “Nostocoida limicola” es uno de los morfotipos filamentosos causantes de problemas

de separación de sólidos de los fangos activos, como son el bulking y el foaming. Este grupo de

microorganismos ha sido observado en EDAR convencionales o con sistemas de eliminación de

nutrientes ubicadas en Australia, República Checa, Italia... En España también existen evidencias de su

presencia en diversas EDAR, donde son abundantes, si no dominantes.

“Nostocoida limicola” fue identificado y agrupado desde un principio en tres grupos diferenciados

por su morfología celular: “N. limicola” I, “N. limicola” II y “N. limicola” III, mediante la microscopía óptica

como método convencional. Sin embargo, pese a las similitudes morfológicas se ha evidenciado

posteriormente que los miembros de estos grupos no tienen relación filogenética, pero sí presentan

diferencias fisiológicas. De hecho, los microorganismos que constituyen estos tres grupos forman parte

de cinco grupos filogenéticos distintos: clase Alfaproteobacteria, phyllum Actinobacteria, phyllum Chloroflexi,

phyllum Firmicutes y phyllum Planctomycetes.

Dada esta ambigüedad y la escasa información actualmente ofrecida de estos grupos de

microorganismos filamentosos, el objetivo de este proyecto es estudiar las relaciones del morfotipo

“Nostocoida limicola” con los parámetros físico-químicos y los parámetros operacionales de las EDAR

Cuenca del Carraixet, Quart Benàger y Dénia-Ondara-Pedreguer, ubicadas en la Comunidad Valenciana.

Se ha empleado la técnica de hibridación in situ (FISH) con sondas marcadas con fluoróforo

(Noli-644, MC2-629, AHW 183, NLIMI 91, NLIMII 192 y NLIMIII mix), combinada con la microscopía

de epifluoresecencia y el criterio subjetivo de Eikelboom para identificar y determinar la abundancia de

“N. limicola” en las EDAR mencionadas. También se han aplicado análisis bivariante y análisis de

redundancia para poder establecer las relaciones de todos estos parámetros ambientales con el morfotipo

en cuestión.

Los resultados de todo el procedimiento han mostrado que “Ca. Molinibacter batavus”, “Ca.

Alysiosphaera europaea”, Tetrasphaera japonica, y el phyllum Chloroflexi (bacterias del denominado grupo “N.

limicola” II), son las que presentan mayor abundancia en las tres EDAR analizadas. Pese a que tienen

preferencias fisiológicas distintas, todos estos microorganismos son aerobios, aunque presentan cierta

actividad de captación de sustratos en condiciones anóxicas. Este grupo se relaciona con valores bajos de

DQO soluble en el afluente, edad del fango y temperatura. Por otro lado este grupo tiene relación positiva

con el nitrógeno y fósforo totales en el afluente, además de con el índice volumétrico de fangos. En

general, las bacterias del morfotipo “N. limicola” requieren hidratos de carbono, proteínas y ácidos grasos

volátiles para su crecimiento, aunque con distinta preferencia.




ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS

APHA

AF

BNR

CCA

American Public Health Association

Afluente

Eliminación biológica de nutrientes (en inglés)

Análisis Canónico de Correspondencias (en inglés)

DBO5 Demanda bioquímica de oxígeno a los 5 días

DNA Ácido desoxirribonucleico

DQO Demanda química de oxígeno

EDAR Estación Depuradora de Aguas Residuales

EDTA

EF

EPSAR

Ácido Etilenaminotetracétrico

Edad del fango

Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales

EtOH Etanol

IF Índice de filamentos (filament index, FI)

FISH Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluoróforos

G+C Guanina y Citosina

GALO Gordonia amarae like organisms

IIAMA Instituto de Ingeniería del Agua y Médio Ambiente

LCFA

LM

Ácidos grasos de cadena larga (long chain fat acids)

Licor mezcla

Mycolata

N

Actinomicetos nocardioformes que contienen ácidos micólicos

Tamaño de muestras

NALO Nocardia amarae-Like Organism

OD Oxígeno disuelto

PBS Tampón fosfato salino

PFA Paraformaldehído

PHA poli β-hidroxialcanoatos

PTLO

RDA

Pine-tree like organisms

Análisis de Redundancia Canónico (en inglés)

RNA Ácido Ribonucleico

rRNA

Tª

Ácido ribonucleico ribosómico

Temperatura




1. INTRODUCCIÓN.

1.1. El proceso de fangos activos en la depuración de las aguas residuales.

La depuración de las aguas residuales consiste principalmente en procesos biológicos de degradación

de compuestos orgánicos junto a procesos físico-químicos de separación y sedimentación de sólidos que

componen estas aguas. El objetivo de estos procesos es proteger el medio ambiente, a los seres vivos que

lo conforman y a la salud humana de la carga contaminante presente en las aguas residuales, tanto de

origen industrial como de origen urbano o doméstico, según la naturaleza de las actividades de la

población que las generan (Mujeriego, 1990).

Las Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDAR) son los sistemas de depuración y

saneamiento que van a cumplir tan importante objetivo, aplicando la normativa europea y española sobre

el control de vertidos y tratamiento de aguas residuales. Actualmente es el Real Decreto 11/1995 (que

incorpora la Directiva europea 91/271/CEE), la normativa base que estipula el tratamiento de las aguas

residuales urbanas (ARU) antes de su vertido en cualquier tipo de ecosistemas acuáticos naturales.

Por todo ello el tratamiento biológico de las aguas residuales de origen urbano ha de ser más eficaz, y

con este fin el proceso de fangos activos es actualmente el sistema de depuración biológica más

frecuentemente empleado en muchas EDAR que tratan este tipo de aguas residuales.

En el año 1914, los ingenieros Ardern y Lockett desarrollan en Inglaterra el proceso de fangos activos

al incorporar, en sus ensayos con cultivo biológico en suspensión en tanque aireado, la recirculación de la

biomasa suspendida producida durante el proceso de depuración en condiciones aerobias. A dicha

suspensión biológica se la denominó fangos activos, puesto que es la biomasa activa responsable de la

degradación de los contaminantes orgánicos del agua residual, con el oxígeno proporcionado durante la

aireación. Estos contaminantes son utilizados por los microorganismos que componen la biomasa como

fuentes de carbono y/o como fuentes de energía.

Inicialmente la depuración con fangos activos era realizada en reactores que operaban como sistemas

discontinuos, de llenado y vaciado, pero a lo largo de los años, ha surgido la necesidad de tratar elevados

caudales de aguas residuales, principalmente por el crecimiento poblacional y su sobreconsumo de agua,

por lo que estos caudales han tenido que ser tratados desde hace más de 50 años (Droste, 1997) en

reactores que operan en régimen continuo.

La configuración del proceso de fangos activos comprende un reactor aireado en continua agitación

para mantener la biomasa activa en suspensión, y un decantador secundario donde se separa el agua

clarificada tratada del fango biológico que ha sedimentado en él, y que es recirculado al reactor con la

nueva biomasa formada. De las reacciones de degradación de los componentes orgánicos por parte de los

microorganismos (catabolismo) que los utilizan, como fuente de energía y/o fuente de carbono para su




posterior crecimiento (anabolismo), resultan componentes más sencillos como el dióxido de carbono, el

agua y nueva biomasa activa.

En las EDAR se han ido desarrollando esquemas de proceso con objetivos como son la nitrificación,

la desnitrificación y la eliminación del fósforo, además de la eliminación biológica de la materia orgánica.

1.2. El flóculo como unidad fundamental del fango activo.

El flóculo es la unidad estructural y funcional del fango activo. Se trata de una estructura heterogénea

formada por agregados de partículas orgánicas e inorgánicas con bacterias filamentosas y bacterias

formadoras de flóculo, las cuales excretan sustancias poliméricas extracelulares (Jenkins et al., 2004) que

permiten esta agregación, también denominada biofloculación. Se ha estudiado que estas sustancias

poliméricas (Extracellular Polymeric Substances, EPS) constituyen una matriz extracelular compuesta de

polisacáridos, sustancias húmicas, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y carbohidratos (Found et al., 1996;

Urbain, 1993), todos ellos segregadas por las bacterias formadoras de flóculo. Además las EPS actúan

como fuertes ligamentos de unión dada su alta carga de densidad negativa (Zita y Hermansson, 1994),

adsorbiendo partículas suspendidas coloidales, dada la carga eléctrica de éstas últimas.

Adicionalmente a la comunidad bacteriana que compone el flóculo existen comunidades de

organismos superiores ligadas a esta estructura, como los protozoos (flagelados, ciliados y sarcodinos) y

los metazoos (por ejemplo, rotíferos), que son de gran importancia en el proceso de depuración. Aunque

constituyen aproximadamente un 5% de la biomasa del fango activo, respecto al 95% de las bacterias, son

organismos bioindicadores del funcionamiento de la depuración, ya que se alimentan de materia orgánica

y de bacterias dispersas que hay en el agua residual, permitiendo el crecimiento de las bacterias formadoras

del flóculo y por tanto, un aumento en la secreción de polímeros extracelulares a los que se adhieren los

sólidos suspendidos durante la sedimentación del fango activo en el decantador secundario (Jenkins,

2004). Estos organismos superiores contribuyen, de este modo, a la buena formación y sedimentación del

flóculo, indicando un buen el proceso de depuración.

Toda la biomasa celular del fango activo mencionada se organiza en el flóculo en dos niveles

estructurales (Sezgin et al., 1978):

- Microestructura: formada por la agregación de los microorganismos, gracias a su capacidad de

adherencia y al fenómeno de biofloculación. Se originan flóculos de pequeño tamaño, esféricos,

compactos y débiles.

- Macroestructura: es la red de bacterias filamentosas que sirve de “esqueleto” a las bacterias

formadoras de flóculo para su adherencia y formación de la microestructura. La integración de




ambas estructuras da lugar a flóculos consistentes de gran tamaño y resistentes a las turbulencias

ocasionadas durante la agitación en el reactor biológico.

El buen funcionamiento del proceso de depuración radica, fundamentalmente, en el equilibrio de

todos los microorganismos que crecen y estructuran el flóculo dando lugar al denominado flóculo ideal,

que es compacto, fuerte y con buena capacidad de sedimentación. En caso contrario, desequilibrios en el

crecimiento de las comunidades microbianas dan lugar a flóculos con dificultad para sedimentar, lo que

crea importantes problemas para la separación de los sólidos del fango activo.

1.3. Problemas de separación de sólidos en los fangos activos.

Muchos de los problemas de separación de los sólidos del fango activado pueden estar relacionados

con la naturaleza del flóculo.

En un fango activado típico hay un amplio margen de tamaños de partículas, desde bacterias

individuales cuyo rango de tamaño es de 0,5 a 5 μm, hasta grandes agregados con dimensiones superiores

a 1 mm. Esta característica está directamente relacionada con la condición de que los microorganismos

que configuran el flóculo en sus dos niveles estructurales estén en proporciones equilibradas o no. En

este caso se presentan seis problemas de separación de sólidos causados por fenómenos físicos y

microbiológicos, presentados en la tabla 1 (Jenkins et al., 2003).

Tabla 1. Causas y efectos de problemas de separación de sólidos del fango activado.

PROBLEMA CAUSA EFECTO

Crecimiento disperso

Fallo en la microestructura del flóculo. No se produce la biofloculación. Los microorganismos están dispersos en pequeños grupos o como células aisladas y no forman flóculos.

Efluente turbio. No hay zona de sedimentación del fango.

Bulking viscoso (no filamentoso)

Fallo en la microestructura del flóculo por exceso de polímeros extracelulares excretados. Las bacterias formadoras de flóculo no pueden agregarse. Zooglea ramigera suele ser el microorganismo causante de esta secreción de EPS.

Fango de consistencia viscosa. Problemas de compactación y sedimentación, de modo que en casos severos, no se separan los sólidos y se pierde fango por el efluente.

Flóculo “punta de alfiler” (“pin-point” floc)

Fallo en la macroestructura del flóculo por falta o baja presencia de bacterias filamentosas.

Flóculos muy esféricos bien pequeños y muy densos de rápida sedimentación, o bien grandes y de lenta decantación.

Bulking filamentoso Fallo en la macroestructura del flóculo por exceso de bacterias filamentosas que se extienden fuera del flóculo.

Compactación y sedimentación del fango activo muy deficiente. En casos severos puede escapar con el efluente.

Manto ascendente (flotación de fangos)

Liberación de nitrógeno gas por la desnitrificación dada en el decantador secundario. Este gas se adhiere a los flóculos y los arrastra hasta la superficie del decantador.

Formación de una espuma de fango activo en la superficie del decantador. En casos severos, el fango puede sobresalirse del decantador arrastrando el agua tratada.

Foaming (espumas biológicas)

Agregación de bacterias filamentosas con superficie celular hidrofóbica en la que se asocian burbujas de aire y partículas del flóculo. Mycolata y Nocardioformes son los grupos filamentosos mayoritariamente responsables.

Formación de espumas con aspecto céreo y de color marrón en la superficie del decantador secundario, que no permite la compactación ni sedimentación completa del fango activo al quedar flotando. Puede perderse biomasa activa con el efluente tratado que no puede recircularse.




De todos ellos, los episodios de foaming (espumación) y de bulking (esponjamiento), son los más

comunes en las EDAR con fangos activos, producidos por un fallo en la macroestructura del flóculo, es

decir, por desequilibrios en las proporciones de bacterias filamentosas.

1.3.1. Formación de foaming y bulking.

La primera vez que se describió el problema de las espumas biológicas o foaming fue en Estados

Unidos en el año 1969 tras el suceso del “Misterio de Milwaukee” en la localidad de Milwaukee. Se estudió

la creciente masa flotante de sólidos y de microorganismos surgida en la depuradora de fangos activos y se

observó que la masa espumosa contenía gran cantidad de microorganismos Actinomicetos ramificados

Gram positivos. Posteriormente estas bacterias fueron identificadas como pertenecientes al género

Nocardia, concretamente N. amarae y N. rhodochrous (Lechevalier y Lechevalier, 1974), y por ello a estas

espumas se las empezó a conocer como “Nocardia foams” (Jenkins et al., 1993).

Sin embargo este término no resulta correcto debido a que otros microorganismos también

pueden causar dicho problema, entre ellos los Rhodococcus y Tsukamurella (Nam et al., 2003) que se

encuentran lejos de ser clasificados como especies de Nocardia.

Años más tarde, Nocardia amarae ha sido reclasificada como Gordonia amarae (Goodfellow et al.,

1994), pero a fin de que no exista confusión actualmente se utiliza el término “Nocardia foams” para

hacer referencia al problema de espumas biológicas producidas por actinomicetos nocardioforrnes que

contienen ácidos micólicos, es decir los microorganismos denominados como Mycolata.

Figura 1. Nocardia amarae con tinción de Gram vista al microscopio óptico.

Ya se ha comentado que el foaming es un problema muy extendido y hasta ahora en estudios

realizados han dado como resultado que algunas de las plantas depuradoras con sistema de fangos

activados registradas han sufrido algún caso foaming: 66% en América (Seviour y Blackall, 1998), 68% en

Australia y un 19,8% en Francia (Seviour et al., 1994).




Este problema de espumas biológicas produce una serie de consecuencias (Seviour y Blackall,

1998):

Las espumas pueden alcanzar cierto nivel de espesor y desbordarse en las áreas circundantes al

reactor de fangos activados, originando zonas altamente resbaladizas e incluso inaccesibles.

Pueden alcanzar los clarificadores secundarios, de modo que reducen la calidad del efluente al

escapar con el clarificado porque no sedimentan. Incluso existe la posibilidad de que las espumas

lleguen a los digestores anaerobios, ocasionando más espumas biológicas (figura 2).

Pueden llegar a retenerse entre las espumas hasta un 40% de sólidos suspendidos, lo que implica

que no serán adecuadamente tratados.

Se origina una capa superficial de espumas que no permite la transmisión del oxígeno entre el

agua y la atmósfera, lo que disminuye el oxígeno en los tanques. Esto puede llegar a crear

situaciones de anoxia, sobre todo si la capa es muy espesa y de naturaleza hidrofóbica.

En localidades con bajas temperaturas la capa de espumas puede llegar a congelarse.

Contrariamente, en climas cálidos, las espumas pueden dar lugar a problemas de septicidad.

Ciertos microorganismos descritos como formadores de espumas como Nocardia asteroides y

Rhodococcus equi, son patógenos oportunistas (Prescott, 1991), por lo que los aerosoles de estos

organismos son potencialmente peligrosos para la salud.

Las espumas son claramente un problema estético, además de que pueden causar malos olores.

Figura 2. A) Decantador secundario con problemas de espumas biológicas causadas por la bacteria filamentosa Microthrix parvicella. B) Salida de efluente clarificado del decantador anterior con sólidos que

se escapan en forma de macroflóculos.

El fenómeno de esponjamiento o bulking (Seviour y Blackall, 1999) se produce cuando las

bacterias filamentosas dominan los fangos activos, de manera que crecen dentro y fuera de los flóculos,

provocando que éstos, pese a ser fuertes y grandes, no puedan aproximarse, compactar y sedimentar

A B




finalmente. El resultado es que el clarificado o sobrenadante producido en el decantador secundario

presenta sólidos perdidos, ya que las partículas pequeñas se filtran y se fijan a la estructura filamentosa.

Existen dos tipos de esponjamiento (tabla 1), el bulking viscoso y el bulking filamentoso. Este

último es causado por un fallo en la macroestructura del flóculo, que viene dado por un excesivo

crecimiento longitudinal de bacterias filamentosas, las cuales se extienden fuera del flóculo y generan

puentes interfloculares. También es el resultado de la presencia de bacterias que tienden a generar

estructuras floculares abiertas. En ambos casos los flóculos no pueden agregarse, dando como resultado

un aspecto esponjado del licor mezcla y una deficiente sedimentación en el decantador secundario.

Figura 3. Bulking filamentoso producido por la bacteria filamentosa Tipo 021N al microscopio óptico en contraste de fases a 100x. Este fango es producto de un vertido de agua residual procedente de la industria vinícola (Hydrolab Microbiologica).

Una de las condiciones que favorecen el crecimiento de este tipo de microorganismos es la

calidad del agua residual afluente, sobre todo si conlleva ciertos vertidos industriales. Este tipo de aguas se

caracteriza por contener bajos niveles en los nutrientes nitrógeno y fósforo, de ahí que los

microorganismos filamentosos del bulking crezcan con mayor frecuencia en EDAR de fangos activos con

sistema de eliminación de nutrientes. De hecho, los estudios sobre microorganismos filamentosos

causantes de este problema han sido determinados sobre muestras de EDAR industriales (Eikelboom et

al., 1998; Seviour y Blackall, 1999; Liu et al., 2000; Levantesi et al, 2004 y Kragelund y Kong, 2005), o

cuyas aguas residuales contenían vertidos industriales.

Además de la falta de nutrientes, las condiciones de bajo oxígeno disuelto y baja carga másica

también son favorecedoras del crecimiento de estos microorganismos filamentosos.

Los miembros de la comunidad microbiana más reconocidos como causantes del bulking

filamentoso son Thiotrix sp., Sphaerotilus sp., por los tipos filamentosos 021N, 0803 y también por

“Nostocoida limicola”.




1.3.2. Mecanismos de formación de foaming y bulking.

Existen dos grupos de factores que afectan en la formación de espumas biológicas:

- Factores físico-químicos: son los que estabilizan las espumas. Por una parte están los sistemas de

agitación, que fomentan la producción de burbujas de aire que quedan adheridas a la matriz de

microorganismos filamentosos. Por otra se encuentran los tensioactivos, sustancias que fortalecen

la película formada en la interfase aire-agua y que permite que esta película pueda ser más fina

antes de romperse.

- Factores de crecimiento microbiológico: son los parámetros operacionales comunes en el

funcionamiento de las EDAR y fomentan el crecimiento de los microorganismos formadores de

espumas (Nocardioformes, M. parvicella, Tipo 021N, etc.). Estos factores o parámetros son:

Oxígeno disuelto: microorganismos como “N. limicola” o H.hydrossis son capaces de crecer

utilizando los nitratos como aceptor de electrones, incluso en condiciones anaerobias

como M. parvicella y “N. limicola”, (Eikelboom, 2002; Warner 1994), aunque crecen mejor

en condiciones aerobias.

Temperatura: el foaming se asocia más a temperaturas elevadas (Eikelboom, 1994), aunque

también se han dado casos en climas fríos, por ejemplo, actinomicetos nocardioformes

como M. parvicella.

Requerimientos nutricionales: muchos microorganismos formadores de espumas pueden

metabolizar distintos sustratos, aunque otros como Thiotrix sp. o Sphaerotilus natans crecen

cuando hay déficit de algún nutriente (nitrógeno y/o fósforo).

pH: imprescindible un rango de 6 a 8 para el crecimiento de los microorganismos

filamentosos. Rangos de pH entre 7,2 y 7,6 ayudan a incrementar la tasa de crecimiento

de estas bacterias del bulking y del foaming.

Concentración de sulfuros: en aguas sépticas que fomentan el crecimiento de bacterias

del azufre como Thiotrix sp. o Beggiatoa sp.

Carga másica: valores bajos inducen principalmente al crecimiento de bacterias como “N.

limicola”, Thiotrix sp.

1.4. Bacterias filamentosas responsables de la formación de bulking y foaming.

Las bacterias filamentosas están presentes en todas las EDAR con sistema de fangos activos,

puesto que son esenciales en la formación del flóculo y su sedimentación, y las principales causantes de los

problemas de bulking y foaming (Jenkins et al., 2004; Seviour and Nielsen, 2010). Sin embargo, no existe una




estrategia universal para limitar o prevenir este tipo de problemas (Eikelboom et al., 2000; Jenkins et al.,

2004; Kragelund et al., 2010).

Bien es cierto que existen distintas estrategias generales para el control del bulking y mejorar la

decantación del licor mezcla. Por ejemplo, está la aplicación de cloro o peróxido de hidrógeno como

método químico (Eikelboom et al., 2006), que actúan como agentes biocidas. El cloro es el más

ampliamente empleado en países como Estados Unidos, Alemania, Australia, Gran Bretaña, etc,

principalmente por su disponibilidad, su poder desinfectante y su bajo coste. Los puntos más

recomendados para la aplicación del cloro en las EDAR son directamente en el reactor de aireación y, el

más utilizado, en la corriente de recirculación (Jenkins et al., 2004), de manera que se mantenga una buena

mezcla de los compuestos orgánicos e inorgánicos con el fango activo.

De todos los microorganismos filamentosos presentes en los fangos activos el 40% son

Actinomicetos aerobios, y de éstos 18 géneros parecen tener importancia como patógenos humanos. De

estos últimos, los géneros Nocardia, Gordonia, Rhodococcus, Skermania, Mycobacterium, Corynebacterium y

Tsukamurella pertenecen al grupo conocido como Actinomicetos Nocardioformes, que contienen ácidos

micólicos (grupo mycolata).

El grupo mycolata son las bacterias filamentosas productoras de espumas biológicas muy estables

que perjudican el proceso de depuración de las aguas residuales debido a su carácter hidrofóbico (con

pared celular hidrofóbica) (Minnikin, 1982), conferido por sus ácidos micólicos (Seviour y Blackall, 1998)

y unido a su capacidad de formar filamentos que atrapan las burbujas de aire.

Hasta el año 1980 los únicos microorganismos reconocidos como formadores de espumas y de

bulking eran los Actinomicetos nocardioformes. Sin embargo, recientes trabajos han implicado ciertos

tipos de microorganismos filamentosos asociados previamente con el aumento de volumen, especialmente

Microthrix parvicella (Blackall et al., 1994; Blackall et al., 1996).

En la actualidad solamente ciertos morfotipos filamentosos pueden ser identificados de forma

fiable empleando la microscopía y manuales basados únicamente en la morfología del organismo. Los

principales morfotipos registrados en esta condición hasta el momento son “Candidatus M. parvicella”,

Thiothrix, algunos mycolata y Sphaerotilus natans.

Además, algunos de los morfotipos filamentosos de los fangos activos no han podido ser

clasificados debido a la imposibilidad de ser aislados en cultivo puro, como Nostocoida limicola, el género

Thiothrix o algunos morfotipos de Eikelboom que son referidos como tipos numéricos tales como Tipo

0092 y Tipo 0675. La problemática con este tipo de identificación es que una misma especie puede exhibir

polimorfismos o diferentes especies pueden parecer la misma (Seviour y Nielsen, 2010).




A nivel de inclusión taxonómica, sólo los morfotipos filamentosos Beggiatoa sp., Sphaerotilus natans,

Haliscomenobacter hydrossis, Nocardia (Gordonia) amarae, Skermania piniformis y Rhodococcus sp. están registrados

en el Bergey‟s manual of Systematic Bacteriology (Holt, 1984-1989). Ni siquiera los morfotipos de

Eikelboom han sido nombrados siguiendo las reglas del Código Internacional de Nomenclatura y por ello

están referidos como tipos numéricos.

Esta situación va cambiando poco a poco gracias al empleo de técnicas moleculares utilizadas para

caracterizar y secuenciar el gen 16s del rRNA, y con ello obtener la posición taxonómica de los morfotipos

de las bacterias filamentosas. Aunque ciertos morfotipos filamentosos clasificados numéricamente no han

podido tampoco ser situados taxonómicamente (Jenkins et al., 2004; Seviour et al., 1999): Tipo 0914, Tipo

0961, Tipo 0211, Tipo 1852 y Tipo 0581, recientemente el morfotipo 0581 ha sido identificado dentro del

género Chloroflexi (Zornoza et al., 2006), que no guarda relación con los Actinomicetos clásicos formadores

de natas (phyllum Actinobacteria), a pesar de presentar características morfológicas similares con M.

parvicella.

Un problema general con la interpretación de los datos obtenidos, antes de la aplicación de las

técnicas moleculares, es que los datos fisiológicos determinados para los morfotipos filamentosos deben

ser interpretados muy cuidadosamente. Esto es importante puesto que las interpretaciones de los datos

pueden resultar en identificaciones engañosas. Un ejemplo de esto es el caso de los grupos filamentosos

que conforman el morfotipo “N. limicola”. Con la identificación convencional mediante microscopía,

muchas bacterias filamentosas que se han ido identificando como “Nostocoida limicola” presentan

básicamente diferencias morfológicas que las dividen en tres grupos: N. limicola I, N. limicola II y N. limicola

III. Sin embargo, estos grupos probablemente no tienen relación filogenética y sí presentan, por tanto,

diferencias fisiológicas (Liu et al., 2001; Kragelund et al., 2006;).

A continuación se describe el morfotipo filamentoso “Nostocoida limicola” a partir del cual se

desarrolla este trabajo de investigación.

1.4.1. Morfotipo “Nostocoida limicola”.

A pesar de que la aplicación de los métodos moleculares ha ido incrementando la comprensión

filogenética de algunas bacterias filamentosas causantes de bulking y foaming en EDAR con fangos activos,

otras siguen siendo bastante desconocidas, como “Nostocoida limicola” (Seviour y Blackall, 1999).

Las bacterias hidrofóbicas como Microthrix parvicella y los actinomicetos nocardioformes que contienen

ácidos micólicos tradicionalmente han sido consideradas como las principales causantes de problemas de

foaming, en especial en EDAR con eliminación de nutrientes (Wanner, 1994; Seviour et al., 1994;

Eikelboom et al., 1998; Jenkins et al., 2004). No obstante, las espumas biológicas constan de muchos más




microorganismos además del anterior, aunque son menos conocidos. Actualmente estos microorganismos

necesitan de detección e identificación por métodos más específicos y más si, como es el caso del

morfotipo “N. limicola”, son capaces de aparecer y crecer junto a M. parvicella, llegando a dominar la

biocenosis de las espumas e incluso de pasar, a pesar de ello, desapercibidas.

Descrita por primera vez por Van Veen en 1973, la bacteria filamentosa N. limicola se aisló por

primera vez de fangos activos, y se describió como Gram-positiva, con forma de cocos en cadenas, con

crecimiento lento y no móvil. Años más tarde se consideró que esta bacteria se constituye en tres

morfotipos diferenciados: “Nostocoida limicola” I, “Nostocoida limicola” II y Nostocoida limicola” III (Eikelboom

y Van Buijsen, 1983).

Los tres morfotipos consisten en células esféricas-discoidales en cadena cuyas distinciones

principales son el tamaño celular (tabla 2) y la apariencia del filamento. Ambas características se muestran

mediante técnicas de clasificación morfológica como son la tinción Gram y la tinción Neisser. Con la

primera se ha observado que los resultados son variables, pese a que se identificó previamente como

Gram-positiva. La tinción Neisser resulta positiva e indica la presencia de gránulos de polifosfato

intracelulares.

Tabla 2. Tamaños celulares de los morfotipos “Nostocoida limicola”.

Grupos morfológicos Tamaño celular (diámetro, µm)

“Nostocoida limicola” I 0,6 – 0,8

“Nostocoida limicola” II 1,2 – 1,4

“Nostocoida limicola” III 1,6 – 2,0

A pesar de que algunos estudios llevados a cabo en gran número de EDAR en Europa muestran

que “N. limicola” está muy extendida (Wanner, 1998; Seviour y Blackall, 1999), no se han dado muchos

intentos para distinguir entre los tres morfotipos, creyéndose hasta no hace demasiados años que la

bacteria era una especie distribuida en tres variantes diferenciadas sólo en el tamaño molecular.

Dicha conclusión fue errónea puesto que los tres morfotipos comprenden bacterias no

relacionadas y con propiedades diferentes en lo que respecta a sus relaciones con los parámetros

operacionales de las EDAR.

El desarrollo de estudios moleculares y técnicas como la micromanipulación y FISH han resuelto

esta problemática de ubicación filogenética de los morfotipos de “Nostocoida limicola”, dando como

resultado que cada uno de los tres morfotipos pertenece a cinco grupos filogenéticos bacterianos distintos

(Blackall et al., 2000; Liu et al., 2000; Seviour et al., 2000 y Levantesi et al., 2004). Así pues, el término

utilizado por los científicos microbianos de “Nostocoida limicola” en estudios de fangos activos para

controlar procesos de bulking y foaming es confuso y evidentemente engañoso.




Gran parte de los microorganismos que componen los fangos activos son en general difíciles de

cultivar en medios artificiales, y no se puede obtener información de sus requerimientos nutricionales.

Solamente en cultivo puro es donde se puede utilizar su secuencia genética del gen 16s rRNA para

dilucidar su filogenia y diseñar métodos que sirvan de herramientas que permitan conocer su identificación

in situ y su dinámica poblacional.

Bien es cierto que a lo largo de los estudios realizados de las espumas biológicas y la visualización

morfológica de los microorganismos causantes, “N. limicola” presenta parecido fisiológico a M. parvicella

respecto a la capacidad de asimilar ácidos grasos de cadena larga y almacenar y acumular lípidos

intracelulares (Seviour et al., 2006). La aparición de estas bacterias filamentosas se ha relacionado con

condiciones de baja carga másica, poco oxígeno disuelto y condiciones de septicidad, principalmente.

En todo caso, es bastante arriesgado generalizar con los factores que afectan al crecimiento de

estos microorganismos cuando ya se sabe que no se trata de una especie de bacteria diferenciada en tres

grupos por su tamaño celular, sino que son morfotipos diferenciados por contener diversas especies

pertenecientes a cinco phyla distintos (Levantesi et al., 2004; Kragelund et al., 2006). Los representantes de

los morfotipos de “Nostocoida limicola” I, II y III pertenecen a la clase Alfaproteobacteria (dentro del

phyllum Proteobacteria), y a los phyllum Actinobacteria, Firmicutes, Chloroflexi y Planctomycetes

(figura 4).

Phyllum Proteobacteria:

Clase Alfa (Morfotipos “Nostocoida limicola” I,II y III) (Kragelund et al., 2005,2006; Levantesi et al., 2004):

Candidatus “Alysiomicrobium bavarium”

Candidatus “Alysiosphaera europea”

Candidatus “Monilibacter batavus”

Candidatus “Sphaeronema italicum”

Candidatus “Combotrhix itálica”

Candidatus “Catenimonas itálica”

Candidatus “Meganema perideroedes”

Phyllum Chloroflexi (Schade et al., 2002):

Tipo Nostocoida limicola II

Phyllum Actinobacteria (Blackall et al., 2000): “Nostocoida limicola” II

Phyllum Firmicutes (Liu et al., 2000):

Trichoccus flocculiformes (Nostocoida limicola I)

Phyllum Planctomycetes (Liu et al., 2001):

Isosphaera sp. (“Nostocoida limicola” III) Figura 4. Filogenia del morfotipo “Nostocoida limicola”.




El morfotipo “N. limicola” perteneciente a la clase α-Proteobacteria se mostró previamente

predominante en EDAR con agua residual de origen industrial (Kragelund et al., 2006; Levantesi et al.,

2004 y Snaidr et al., 2002) y poco común en las EDAR que tratan aguas de origen urbano (Seviour et al.,

2002).

Los morfotipos “Nostocoida limicola” se han encontrado de forma abundante en Australia, Italia y

en la República Checa. En las EDAR con fangos activos de la Comunidad Valenciana estos

microorganismos también aparecen con frecuencia, si bien no lo hacen como especie dominante.

1.4.1.1. Nostocoida limicola I

Bacteria filamentosa descrita con filamentos curvados enrollados irregularmente, relativamente

finos (0,6 – 0,8 µm) y largos (100 – 300 µm). Suele ubicarse en el interior de flóculos, pero también puede

aparecer en espacios interfloculares como bacteria libre. Los filamentos carecen de motilidad, vaina,

ramificaciones y crecimiento epifítico. Inicialmente se describió como Gram y Neisser positivos (Jenkins,

2003).

En estudios realizados en la República Checa y al este de Australia (Liu et al., 2000) se

caracterizaron ocho bacterias que se habían aislado por micromanipulación, “identificándolas”

inequívocamente como “N. limicola” I de acuerdo con su morfología y su respuesta a las tinciones

siguiendo la bibliografía (Van Veen, 1973; Jenkins, 1993).

Figura 5. Apariencia de “Nostocoida limicola” I, a escala de 5 µm, en cadenas de cocos en una muestra de biomasa de fango activo (Liu y Seviour, 2000).




Se obtuvieron ocho cepas, seis en Australia y dos en la República Checa, en cultivo axénico, y se

nombraron cepas “Ben”, todas Gram positivas y en su mayoría con una morfología de cocos regulares en

cadena que coincidía con “N. limicola” I (figura 5). En algunos aislamientos la disposición y forma celular

variaba dependiendo de las condiciones y el medio de cultivo.

Este organismo fue inicialmente descrito e inválidamente nombrado por Eikelboom y Van

Buijsen en 1983, en base a su apariencia al microscopio óptico, respuesta a las tinciones y similaridad

superficial a los morfotipos “Nostocoida limicola” II y III (Liu et al., 2000). “N. limicola” I es un miembro de

las bacterias Gram positivas con bajo contenido en guanina y citosina, que corresponde al phyllum

Firmicutes.

Las secuencias 16S del rRNA de las cepas aisladas demostraron que los aislamientos de este

morfotipo, algunos de ellos indistinguibles al microscopio, de diferentes depuradoras ubicadas en distintas

partes del mundo contenían más de un género conocido. Estos resultados del estudio muestran

definitivamente que son bacterias diferentes, probablemente con diferentes propiedades ecológicas y

fisiológicas (Liu et al., 2000). Además, experiencias con otras bacterias filamentosas (Erhardt et al., 1997;

Howarth et al., 1999) sugieren que pueden existir pequeñas diferencias biogeográficas en la misma especie.

En el estudio se compararon las secuencias 16S rRNA de algunas de las cepas Ben: 77,78, 200,

201, 202 y 205, agrupándose cercanamente al microorganismo Lactospharea pasteurii, un coco aerotolerante

cuyo crecimiento en cadena nunca había sido descrito y que fue aislado del fango de digestores anóxicos

(Janssen et al., 1995). Posteriormente se demostró que L. pasteurii era a su vez, en términos de sus

secuencias, 16S rRNA más del 99% similar a la bacteria filamentosa Trichococcus flocculiformi (Stackebrand et

al., 1999), que fue descrita como cocos que crecían en largas cadenas y nombrada válidamente por Scheff

en 1984. Se describió esta bacteria como una importante formadora de bulking en Alemania y no había

sido identificada en otros países anteriormente, por lo que no aparece en manuales comunes de

identificación de bacterias filamentosas formadoras de bulking como puede ser el de Jenkins et al., 1983;

Wanner, 1994 y Eikelboom, 2000.

De hecho, Scheff en 1984 opinó que T. flocculiformis no estaba relacionada con “N.limicola” I,

basándose en la comparación de la forma y dimensiones celulares, decisión rechazada a la vista de los

resultados obtenidos en el estudio posterior (Liu et al., 2000) con los aislamientos Ben y su flexibilidad

morfológica, del que se obtuvo un árbol filogenético como el mostrado en la siguiente figura.




Figura 6. Árbol filogenético basado en las secuencias genéticas del 16S rRNA de los aislamientos de “N. limicola” I (aislamientos Ben) dentro del phyllum Firmicutes (Liu

y Seviour, 2000).

1.4.1.2. Nostocoida limicola II.

Inicialmente fue descrita como bacteria con filamentos curvados y enrollados irregularmente

semejantes a “N.limicola” I, con un diámetro de 1,2 a 1,4 µm y una longitud de 100 a 200 µm, localizadas

mayoritariamente en el interior del flóculo. Contiene septos celulares con muescas muy visibles al

microscopio óptico (figura 7), carecen de motilidad, vaina y crecimiento epifítico y se describieron

anteriormente ramificaciones verdaderas. Las tinciones Gram y Neisser son variables, dando como

resultado que las bacterias son normalmente Gram negativas y Neisser positivos. También suele presentar

gránulos de polihidroxibutirato (PHB) (Jenkins, 2003).

Figura 7. “Nostocoida limicola” II al microscopio óptico a 1000x con tinción Neisser positiva (Grupo Microbiología FACSA, 2012).

La diversidad filogenética de este morfotipo es muy compleja y además, es el que ha sido

encontrado con más frecuencia en las EDAR con sistemas de fangos activos.

La secuenciación del 16S rRNA de los aislamientos Ben, cuyo origen se sitúa en Australia e Italia,

muestra que forman un clúster definido dentro del grupo de las bacterias Gram positivas con alto




contenido en guanina y citosina, es decir, dentro de las Actinobacterias (Blackall et al., 2000). Actualmente

se conoce que estos aislados comparten propiedades morfológicas con los cocos no filamentosos del

género Tetrasphaera, también aislados de los fangos activos (Maszenan et al., 2000), pudiendo nombrarse

ahora de manera válida y ubicarlos como al menos cinco especies distintas dentro de éste género. Esto se

puede observar en el árbol filogenético de la figura 8.

Figura 8. Árbol filogenético basado en la secuenciación del 16S rRNA de “Nostocoida limicola” II (aislamientos Ben y Ver) dentro del grupo de las Actinobacterias (Seviour et al., 2002). Se muestran los últimos aislamientos identificados de este morfotipo como Tetrasphaera jenkinsii (cepas Ben 67, 68, 14, 17 y 74), Tetrasphaera veronensis (cepa Ben 70) y Tetrasphaera vanveenii (cepas Ver 1 y Ver 2) (McKenzie et al., 2006, Seviour y Liu, 2006).

Por otra parte, cultivos del mismo morfotipo, indistinguibles al microscopio, han resultado

pertenecer al phyllum Chloroflexi (Schade et al., 2002) y a las α-Proteobacterias (Snaidr et al., 2002).

“Nostocoida limicola” tiene parecido fisiológico con Microthrix parvicella en lo que respecta a la

capacidad de asimilar ácidos grasos de cadena larga y almacenar y acumular lípidos intracelulares. Sin

embargo, también se ha descrito que las bacterias “N. limicola” II pertenecientes al grupo Actinobacteria

asimilan glicerol y palmitato más débilmente. Esto sucede bajo condiciones de cultivo anóxicas (con

nitrito y nitrato) y en condiciones anaerobias, pero no en condiciones aerobias, aunque se desconoce el

motivo. Parece ser que estas bacterias no asimilan colesterol o estradiol, aunque sí levemente glicina bajo

los tres tipos de condiciones, siendo más activo bajo condiciones aerobias. También suelen tomar ácido

benzoico sólo en condiciones anaerobias, y aunque no se sabe porqué, este ácido parece presentar

propiedades antimicrobianas que pueden expresarse sólo cuando estas bacterias respiran (Seviour et al.,

2006).




Los datos sugieren que la fisiología in situ de este “filotipo” puede variar entre EDAR y también

diferir en cultivo puro para el mismo “filotipo”.

1.4.1.3. Nostocoida limicola III.

Este morfotipo se describe con filamentos curvados y enrollados irregularmente, semejantes a los

anteriores, pero de mayor grosor (1,6 a 2,0 µm) y una longitud de 200 a 300 µm (Jenkins, 2003). Como los

otros morfotipos carece de motilidad, ramificaciones, vaina y crecimiento epífito. También contiene

septos celulares con muescas claramente visibles al microscopio óptico (figura 9), siendo sus células

esféricas, ovaladas o discoidales. Comúnmente se detectan gránulos de PHB y son Gram y Neisser

positivos.

Figura 9. Cepa Ben 220 al microscopio óptico a 1000x. Se muestra la desigualdad en la tinción Gram del morfotipo “Nostocoida limicola” III (Liu y Seviour, 2001).

Aunque este morfotipo es difícil de crecer en cultivo axénico, se han conseguido secuenciar los

genes del 16S rRNA de algunos aislamientos o cepas Ben (Seviour et al., 2002), observándose que hasta el

momento su situación filogenética los incluye como miembros del phyllum Planctomycetes, siendo cercanos

a Isosphaera pallida (Giovanni et al., 1987), pero diferentes fenotípicamente a ella. Su ultraestructura es

congruente con que sean Planctomycetes (Fuerst, 1995) ya que poseen un extenso sistema de membranas

intracelular distintivo de este grupo, además de que hibridan con la sonda PLA-46 correspondiente a los

Planctomycetes (De Neef et al., 1998).

Otros estudios de secuenciación señalan que estas bacterias no están relacionadas con el grupo de

“Nostocoida limicola” III, y que pueden aparecer en fangos activos como cocos aislados o agregados en

filamentos, haciendo que su identificación mediante microscopía convencional sea prácticamente

imposible y se llegue a subestimar su frecuencia de aparición (Liu et al., 2002).




Así pues la posición de los cincos aislamientos o cepas Ben del grupo de “N. limicola” III queda

establecida en el siguiente árbol filogenético (Liu et al., 2001).

Figura 10. Árbol filogenético basado en la secuenciación del gen 16S rRNA indicando la posición filogenética de cincos aislamientos Ben (220, 222, 223, 224, 225) de “Nostocoida limicola” III.

En el gen 16S rRNA existe un alto contenido en guanina y citosina característico del género

Isosphaera del phyllum Planctomycetes, lo cual también ha sido encontrado en aislamientos de este morfotipo,

evidenciando su pertenencia al grupo. Los datos de secuenciación del gen 16S rRNA y la limitada

caracterización fenotípica, incluyendo la información ultraestructural, parece apoyar la teoría de que

algunos de estos aislamientos Ben son cepas de Isosphaera no descritas previamente (Liu et al., 2001).

Además, los análisis de la secuencia 16S rRNA de los clones en estudios cultivo-dependientes de Ward et

al. (1995), y algunos de los nuevos aislamientos de Planctomycetes obtenidos y caracterizados (Griepenburg et

al., 1999) demuestran que los miembros de este género son más diversos de lo que en principio se creía.

Algunos de los aislamientos de “N. limicola” III muestran secuencias similares a secuencias de

genes previamente descritas. Ben 22 y Ben 25 se agrupan de manera cercana con el clon MC25 de Liesack

y Stackebrandt (1992) del suelo, y Ben 223 y 224 son muy similares al gen 16S rRNA obtenida por Bond et

al. (1995) de fangos activos. La información de bibliotecas de clones sugiere que el phyllum

Planctomycetes es una población prominente en las comunidades microbiológicas de los fangos activos

(Bond et al., 1995). Neef et al. (1998) pudo detectar cocos de tamaño mayor a 2,5 µm de diámetro, siendo

células de la talla y forma de “N. limicola” III, con sus pruebas para Planctomycetes en muchas de las muestras

que examinaron mediante la técnica FISH. Pese a que ninguno de estos cocos aparecía en cadena cabe la

posibilidad de que fueran formas no filamentosas de “Nostocoida limicola” III, y de ser así podría explicar

porqué estos organismos no se “identifican” más a menudo en análisis microscópicos en estudios de

fangos activos (Seviour y Blackall, 1999).




1.5. Identificación de microorganismos filamentosos.

Es de vital importancia conocer los microorganismos de los fangos activos que generan problemas

en estos sistemas y así poder desarrollar estrategias de control y soluciones prácticas. Para ello, existen dos

metodologías de identificación que poco a poco van ayudando a superar el desconocimiento sobre

microorganismos filamentosos formadores de foaming y bulking.

Los métodos clásicos o convencionales son los que se basan en la observación de la apariencia

microscópica de los microorganismos para determinar sus características morfológicas, así como el uso de

tinciones que ponen de manifiesto algunas de las características identificativas de los microorganismos.

Los métodos moleculares detectan e identifican microorganismos generalmente de forma más

rápida y eficaz, por lo que se emplean cada vez más de manera que van sustituyendo a los métodos

convencionales.

1.5.1. Microscopía como método convencional de identificación.

La microscopía convencional es normalmente utilizada para observaciones a 1000x y con óptica

de contraste de fases que muestra las características morfológicas y estructurales de los microorganismos.

En algunas ocasiones este método es suficiente para la identificación con seguridad del microorganismo

de interés, pero en otras es necesario aplicar una técnica adicional, como las tinciones, para lograr este

objetivo.

La nomenclatura basada en la observación microscópica de las características morfológicas fue

establecida por Eikelboom (1975) y otros autores la actualizaron posteriormente (Jenkins et al., 2004).

La clasificación de Eikelboom (1975) y de Jenkins et al. (2004) se basa en los siguientes caracteres

morfológicos: presencia o ausencia de ramificaciones, movilidad, forma del filamento (irregular, curvo,

enrollado, etc.), color, ubicación respecto al flóculo, existencia de crecimiento epifítico, vaina, septos,

constricciones celulares, dimensiones celulares, dimensiones del filamento, forma celular (cuadrada,

rectangular, ovalada, etc.), presencia de biopolímeros de azufre y gránulos de polifosfato, reacciones de

tinción (Gram y Neisser) y formación de rosetas y gonidios.

Los métodos convencionales son de gran ayuda para la observación de microorganismos en

EDAR de aguas residuales, sin embargo la información que aportan sobre la identidad exacta de los

filamentos observados no es fiable, razón por la cual se designa a los filamentos bajo los términos “tipo” o

“morfotipo” en vez de especie.




El uso de técnicas convencionales para la identificación y cuantificación conlleva algunas

dificultades:

- Una misma especie puede mostrar polimorfismos o diferentes especies parecer iguales (como es el caso

del morfotipo “Nostocoida limicola”).

- Aquellos filamentos ubicados en el interior del flóculo son difíciles de identificar y cuantificar.

- Estructura abierta de los flóculos proporcionadas, por ejemplo por un excesivo crecimiento de

filamentos robustos y largos.

- Puede existir una elevada población de filamentos que no permita distinguir unas especies de otras.

- Esta metodología es subjetiva y depende del nivel de entrenamiento y experiencia del que la lleva a

término.

Los métodos clásicos son un complemento de las técnicas moleculares, proporcionando a éstas

datos de interés sobre las características del flóculo y la presencia de protozoos y otros microorganismos

asociados. A pesar de considerar la microscopía convencional como una herramienta imprescindible en el

control del proceso de depuración, a nivel microbiológico tan sólo un número reducido de bacterias

filamentosas han podido ser identificadas según sus características morfológicas. Así, en la actualidad la

identificación de las bacterias del fango activo no se puede limitar únicamente al método convencional

(Nielsen et al., 2009).

1.5.2. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA marcadas con fluoróforo (FISH),

como método molecular de identificación.

Los métodos de identificación moleculares se basan en nuevas herramientas moleculares que hacen

posible la determinación de la composición de comunidades microbianas, y la detección y cuantificación

de especies dentro de estas comunidades. Las técnicas moleculares más utilizadas en estos estudios de

diversidad microbiana a nivel genético son aquellas basadas en la amplificación y secuenciación del gen

16S, que codifica para la subunidad ribosómica bacteriana (siendo su equivalente en eucariotas la

subunidad 18S rRNA).

El gen que codifica para el RNA ribosómico 16S es el más ampliamente utilizado en estudios de

filogenia y taxonomía bacterianas. Su aplicación como “cronómetro molecular” fue propuesta por Carl

Woese a principios de la década de 1970. Aunque existen cronómetros moleculares alternativos al rRNA

16S, hasta el momento ninguno ha conseguido desplazarle, pues éste presenta una serie de características

en base a las cuales fue considerado como cronómetro molecular definitivo (Woese, 1987):




1. Se trata de una molécula presente en todas las bacterias actuales. Constituye, por tanto, una diana

universal para su identificación.

2. Su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo muy prolongado, de modo que

las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios

3. Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta como para aportar información acerca de todos

los procariotas y, junto con las variaciones en los 16S rRNA, a lo largo de toda la escala evolutiva. Los

rRNA con esta subunidad (que es la pequeña entre los procariotas, siendo las subunidades 23S y 5S las

que conforman la subunidad mayor) contienen, sin embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no

sólo los organismos más alejados, sino también los más próximos.

4. El tamaño del 16S rRNA es de aproximadamente 1.500 nucleótidos, lo cual minimiza las fluctuaciones

estadísticas en lo que respecta a las identificaciones filogenéticas, por lo que es un tamaño adecuado como

para proporcionar información suficiente.

5. La conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las comparaciones, aportando una

base para el alineamiento preciso.

6. Dado la relativa facilidad de secuenciar el gen 16S rRNA se han creado bases de datos amplias, todavía

en continuo crecimiento.

La hibridación in situ con sondas u oligonucleótidos 16S rRNA/23SrRNA marcadas con

fluorocromos (FISH) ha sido una técnica común para la detección e identificación de microorganismos

en diferentes ambientes microbianos, incluyendo comunidades mixtas (Amann et al., 1995). Esta técnica

resulta interesante ya que no sólo determina la filogenia de los microorganismos sino también su

morfología, localización, abundancia y actividad.

La técnica FISH se basa en la hibridación directa de la bacteria diana con una sonda

complementaria de una región del gen 16S rRNA o 23S rRNA. El elevado número de copias de moléculas

de rRNA (103-10

5) es una ventaja en la aplicación de la técnica de hibridación al aumentar su sensibilidad

(Amann, 1994).

Este método molecular consiste en preparar cortas secuencias de DNA de una sola hebra,

llamadas sondas, que son complementarias de las secuencias de RNA que se quieren identificar. Estas

sondas pueden unirse con una secuencia de RNA complementaria (16S rRNA o 23S rRNA) y se produce

un híbrido DNA: RNA. La sonda está marcada con moléculas fluorescentes (por ejemplo fluoresceína o

rodamina) de forma que los híbridos formados sean fácilmente detectables con un microscopio de

epifluorescencia. La accesibilidad de la sonda rRNA es distinta según el gen rRNA que se trate y que la

zona del mismo sea la complementaria, lo que hay que tener en cuenta a la hora de diseñar la sonda.

Además, la especificidad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles taxonómicos, como son




dominio, phylum, clase, familia, género y especie, para la identificación de las bacterias en sus diferentes

comunidades naturales (Amann et al., 1995).

El microscopio de epifluorescencia es una variación del microscopio óptico en el que la luz

emitida (tanto visible como ultravioleta) no atraviesa la muestra estudiada, sino que incide sobre ella de

modo que la misma lente ilumina y recibe la luz emitida por la muestra. La imagen observada es el

resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación

primaria y la vuelven a emitir con mayor longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria

deseada se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo (Haugland,

2005). Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con

fluorocromos.

La selección de un adecuado conjunto de filtros para la observación es de vital importancia.

Existen un gran número de juegos de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos,

inclusive conjuntos que permiten la observación simultánea de dos fluorocromos. Los juegos de filtros

están divididos en tres grupos y se designan según la forma de excitación: vidrios coloreados, filtros

interferenciales de banda estrecha para líneas Hg y filtros intercalares de banda ancha. Dentro de cada

grupo están ordenados según los márgenes espectrales de utilización (ultravioleta, violeta, azul-violeta,

azul, verde) con el fin de garantizar una clasificación clara de todos los filtros actuales y futuros (Holz et al.,

1998).

En la técnica de FISH la fluorescencia de las moléculas se consigue mediante la utilización de

fluorocromos. Los fluorocromos son sustancias “colorantes” que tienen la propiedad de emitir un fotón

de una longitud de onda determinada cuando son excitados por un fotón incidente de una longitud de

onda característica. La parte de la molécula que emite la fluorescencia es el fluorocromo o fluoróforo. Las

moléculas de fluorocromo se utilizan para marcar ciertas estructuras celulares destacándolas del resto de

los elementos que componen la célula. Esto permite identificar distintas moléculas o conjuntos de

moléculas. El fluorocromo puede tener afinidad por distintos elementos celulares o puede ser acoplado

químicamente a otras moléculas como anticuerpos que reconocen específicamente cierto componente

celular.

La parte más crítica de la técnica FISH es el diseño de las sondas, que deben ser lo

suficientemente específicas para unirse únicamente a la bacteria diana en presencia de otras bacterias, en

muchos casos con moléculas de rRNA muy homólogas. La sonda que se utiliza está formada por una

pequeña secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, en cuyo extremo, normalmente el 5‟, añade un

fluorocromo. El tamaño de las sondas oscila entre 15 y 30 nucleótidos. Para asegurar la especificidad de

las sondas los tres parámetros determinantes son la temperatura, la concentración de NaCl y la concentración de

formamida en el tampón de hibridación.

http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_luz_ultravioleta



http://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3n_electromagn%C3%A9tica

http://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula

http://es.wikipedia.org/wiki/Vitamina_A




Figura 11. Esquema del protocolo de hibridación in situ.

En la mayoría de los protocolos la temperatura de hibridación se mantiene constante y es la

concentración de formamida la que favorecerá las condiciones de especificidad de la sonda. La hibridación

a diversas temperaturas no es recomendable debido a los efectos negativos de las altas temperaturas en las

muestras y a su dificultad técnica en el experimento (Alonso et al., 2009). La concentración de formamida

hace que disminuya la temperatura de unión de las sondas mediante el debilitamiento de los puentes de

hidrógeno. Este compuesto disminuye la temperatura de fusión de los híbridos DNA: RNA en 0,72 ºC

por cada 1% de formamida utilizada, y permite realizar la hibridación entre 30 y 50 ºC, lo que hace que a

mayor concentración de formamida aumente la intensidad de fluorescencia (Kubota et al., 2006).

Para poder poner en práctica la técnica es necesario primero fijar las bacterias, de forma que

conserven su morfología y se favorezca el acceso de las sondas a la zona de hibridación. Las células deben

ser permeabilizadas y para ello se utilizan detergentes como el SDS (sodio dodecil sulfato). En función del

tipo de la pared celular de la bacteria se utiliza un reactivo para la fijación. Para las bacterias Gram

negativas se emplea el paraformaldehído (PFA) y el etanol para las Gram positivas. En el caso de los

mycolata, la dificultad para la permeabilización reside en el elevado contenido en ácidos micólicos. La

morfología celular debe estabilizarse y las paredes y membranas celulares han de ser permeabilizadas para

que la sonda penetre, por lo que es necesario un tratamiento adicional con enzimas. Se han propuesto los

siguientes tratamientos enzimáticos para facilitar la permeabilización del grupo mycolata: lisozima

(Schuppler et al., 1998), mutanolisina (Schuppler et al., 1998, De los Reyes y Raskin 2002), lipasa y

proteinasa (Davenport et al., 2000).

El exceso de sonda que no ha hibridado tras el proceso debe ser eliminado mediante un lavado.

Después de la hibridación se puede realizar una tinción con un fluorocromo específico del DNA, 4',6-

Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato o DAPI, que permitirá teñir todas las células presentes en la muestra,

tanto las hibridadas como las no hibridadas, lo cual es posible ver a través del microscopio de

epifluorescencia.

Gracias al elevado número de fluorocromos y a las distintas técnicas de marcaje, es posible

detectar varias especies o géneros en una misma muestra con una única hibridación, así como utilizar una

sonda para cada especie, género o grupo marcada con fluorocromos distintos. Los fluorocromos de última




generación emiten una señal fluorescente más intensa y son mucho más fotoestables. El marcaje directo

resulta el más rápido, sencillo y barato.

Hoy en día se ha identificado la posición taxonómica de muchos morfotipos de bacterias

filamentosas y además se han diseñado sondas para muchas de ellas (Wagner et al., 1994; Mussmann et al.,

2003; Martins et al., 2004; Jenkins et al., 2004; Rossetti et al., 2006; Eikelboom, 2006). En la figura 11 se

describe la situación taxonómica actual de los morfotipos filamentosos descritos por Jenkins et al. (2004) y

Eikelboom (1983) y las sondas FISH disponibles.

La técnica de hibridación con sondas marcadas con fluorocromos in situ (FISH), presenta

ventajas en comparación con otras técnicas. Éstas son:

No necesita el cultivo previo de la bacteria ni la extracción de los ácidos nucleicos.

La hibridación inespecífica con otros microorganismos presentes en la muestra no es habitual, por

lo que no se dan falsos positivos.

No parecen existir sustancias inhibidoras que interfieren en la reacción de hibridación.

Puede determinar directamente la abundancia de los microorganismos detectados.

La especificidad de las sondas puede ser ajustada a diferentes niveles taxonómicos, como son

dominio, phylum, clase, familia, género, especie para la identificación de las bacterias en sus

diferentes comunidades naturales.

Las preparaciones pueden conservarse durante mucho tiempo (años).

Puede utilizarse junto con la tinción DAPI para determinar si las células estudiadas están vivas o

no, muy útil para la monitorización del estado de la comunidad microbiana durante la adición de

tóxicos para el control del bulking y el foaming.

Su mayor limitación reside en la sensibilidad, que depende del número de ribosomas existentes,

de la penetración de la propia sonda, y de la matriz donde estemos hibridando, ya que en muchos casos es

necesario un tratamiento previo.

Otra limitación es que el medio utilizado para el crecimiento bacteriano (en caso de que se utilicen

cultivos de microorganismos), los métodos de fijación de la bacteria y los agentes utilizados para embeber

la muestra antes de visualizarla, ejercen una importante influencia en la intensidad de la señal.

DOMINIO BACTERIA (sondas EUB338 I, II, III y IV): Phyllum Proteobacteria:

Clase alfa (sonda ALF1B) Morfotipos Nostocoida limicola I, II y III: Candidatus “Alysiomicrobium bavaricum” (sonda PPX3-1428) Candidatus “Alysiosphaera europaea” (sonda Noli-644) Candidatus “Molinibacter batavus” (sonda MC2-649) Candidatus “Sphaeronema italicum” (sonda Sita-649) Candidatus “Combothrix italica” (sonda combo-1031, en revisión) Candidatus “Catenimonas itálica” (sonda Cate-1013) Candidatus “Meganema perideroedes” (sondas 983 y 1028)




Morfotipo 021N (No acumula azufre): Candidatus “Meganema perideroedes” (sondas EU12-645, EU26-653)

Clase beta (sonda BET42a) Sphaerotilus natans (tipo 1701) (sonda SNA) Leptothrix discophora (sonda LDI) Tipo 0803 subgrupo Rubrivivax (sin sonda)

Clase gamma (sonda GAM42a) Acinetobacter, Tipo 1863 (sonda ACA23a) Moraxella, Tipo 1863 (sin sonda) Thiothrix (sonda G123) T. disciformis (sonda G1B) T. eikelbomii (sonda G2M) T. flexilis (sonda G3M) T. nivea, T. unzii (sonda TNI) T. fructosivorans, T. ramosa (sonda TFR) Leucothrix mucor (sonda LMU) Beggiatoa (sin sonda)

Clase delta Desulfobacteriaceae (sulfatoreductoras) (sonda SRB 385Dd)

Phyllum Bacteroidetes (sonda CF319): Haliscomenobacter spp. (sonda HHY) Flexibacter (sin sonda) Tipo 1863 (sin sonda) Tipo 0092 (sin sonda) Tipo 0411 subgrupo Flexibacter (sin sonda)

Phyllum Chloroflexi (bacterias verdes no sulfúreas) (sondas GNSB 941 y CFX 1223): Subdivisión 1 (sondas GNSB653 y CFX 784) Subdivisión 2 (sonda CFX 109) Roseiflexus sp. Tipo 1851 (sonda CHL 18519) Tipo Nostocoida limicola II (sonda AHW 183)

Phyllum Actinobacteria (sonda HGC69a): Corynebacterineae “Mycolata” (sonda Myc 657) Gordonia (sonda Gor 0596) G. amarae (sondas 0192, 0205) Nostocoida limícola II (sondas NlimII175, NlimII192) Dietzia spp. (DIE 993) Rhodococcus cluster B (RHOb183) Skermania piniformis (Spin 1449) Microthrix (sonda Mpa-all-1410) Candidatus “Microthrix parvicella” (sondas MPA60, MPA650, MPA223, MPA645) Candidatus “Microthrix callida” (sondas Mpa-T1-1260)

Phyllum Firmicutes (sondas LGC354A, LGC354B, LGC354C):

Trichoccus flocculiformis (“Nostocoida limicola” I) (sonda NlimI91)

Phyllum Planctomycetes (sondas EUB 338II y EUB 338IV):

Isosphaera sp. (“Nostocoida limicola” III) (sondas NlimIII301, NlimIII792, NlimIII830)

Phyllum TM7 del dominio Bacteria (sondas EUB 338II y EUB 338IV):

Isosphaera sp. (“Nostocoida limicola” III) (sondas NlimIII301, NlimIII792, NlimIII830)

Figura 12. Situación actual de la taxonomía de los morfotipos filamentosos descritos por Jenkins et al., 2004 y Eikelboom (1983) y las sondas FISH disponibles.




2. OBJETIVOS.

Se ha demostrado que diferentes bacterias filamentosas pueden ser dominantes en la biocenosis

de las espumas biológicas, como es el caso Microthrix parvicella y el grupo mycolata. En los últimos añosse

han identificado otros morfotipos como “Nostocoida limicola” asociados a las espumas biológicas. Debido a

este hecho, muchos de estos microorganismos filamentosos no habían podido ser detectados o

identificados ni tampoco se les había dado demasiada relevancia.

En la actualidad los estudios de investigación sobre las comunidades microbianas constituyentes

de los fangos activos y de los problemas de separación de sólidos en estos sistemas, ya hacen uso de

métodos moleculares como la técnica FISH que permiten la identificación de estos microorganismos a

distintos niveles, lo que facilita la aplicación de estrategias y medidas de control específicas para cada

microorganismo.

En este trabajo de investigación el principal objetivo es estudiar las relaciones del morfotipo

filamentoso “Nostocoida limicola” con los parámetros físico-químicos y los parámetros operacionales en

diversas EDAR de la Comunidad Valenciana. Para lograrlo, se plantean los siguientes objetivos:

1. Aplicación de la técnica FISH para la identificación de los morfotipos “N. limicola” en muestras

de fango activo de las EDAR de interés.

2. Aplicación del método del Índice de Filamentosas de Jenkins et al., (2004) para la cuantificación

de filamentos de “N. limicola” presentes en las muestras de fango activo a estudiar.

3. Estudiar, relacionar y comparar la abundancia y en su caso, la dominancia, de este

morfotipo formador de espumas biológicas con parámetros tales como el pH, la temperatura, la

carga másica, la edad del fango, etc. que permiten el funcionamiento y seguimiento de las EDAR

a estudiar, para determinar la ecofisiología de “Nostocoida limicola” en plantas depuradoras a

escala real.




3. MATERIAL Y MÉTODOS.

3.1. Toma de muestras.

Las muestras fueron recogidas del licor mezcla a la salida del reactor biológico utilizando botes de

plástico de 100 mL de volumen, pero llenándolo sólo hasta la mitad del volumen para mantener las

condiciones aerobias de las muestras durante el transporte. En el caso de que las plantas depuradoras

seleccionadas tuvieran en ese momento problemas de espumas, se recogieron muestras del licor mezcla y

por otro lado de las espumas, para caracterizar cada grupo de muestras por separado.

Las muestras fueron fijadas y permeabilizadas antes de las 24 horas tras su recogida para la

conservación de las bacterias filamentosas, y almacenadas en el Instituto de Ingeniería del Agua y Medio

Ambiente donde se ha procedido al análisis de las mismas para este proyecto.

Tabla 3. Relación del muestreo y procedencia de las muestras analizadas.

QUART BENÀGER CUENCA del CARRAIXET DENIA-ONDARA-

PEDREGUER Línea A+B Línea C+D

04/12/2008 10/12/2008 10/12/2008 10/12/2008

17/12/2008 23/12/2008 23/12/2008 22/12/2008

14/01/2009 07/01/2009 07/01/2009 08/01/2009

28/01/2009 21/01/2009 21/01/2009 21/01/2009

11/02/2009 04/02/2009 04/02/2009 04/02/2009

25/02/2009 18/02/2009 18/02/2009 18/02/2009

11/03/2009 04/03/2009 04/03/2009 04/03/2009

25/03/2009 01/04/2009 01/04/2009 16/03/2009

07/04/2009 29/04/2009 29/04/2009 01/04/2009

22/04/2009 13/05/2009 13/05/2009 29/04/2009

06/05/2009 27/05/2009 27/05/2009 13/05/2009

20/05/2009 10/06/2009 10/06/2009 27/05/2009

03/06/2009 24/06/2009 24/06/2009 10/06/2009

17/06/2009 08/07/2009 08/07/2009 24/06/2009

01/07/2009 22/07/2009 22/07/2009 08/07/2009

15/07/2009 16/09/2009 16/09/2009 22/07/2009

09/09/2009 30/09/2009 30/09/2009 16/09/2009

23/09/2009 14/10/2009 14/10/2009 30/09/2009

07/10/2009 27/10/2009 27/10/2009 14/10/2009

21/10/2009 11/11/2009 11/11/2009 11/11/2009

04/11/2009 25/11/2009 25/11/2009 25/11/2009

18/11/2009 09/12/2009 09/12/2009 15/12/2009

16/12/2009 21/12/2009 21/12/2009 21/12/2009

29/12/2009




El muestreo fue realizado a lo largo de un año, desde diciembre de 2008 hasta diciembre de 2009

y en la tabla 3 se pueden consultar las fechas de muestreo de las muestras recogidas, siendo éstas un total

de 93 muestras de fangos activos (23 por depuradora) hibridadas y cuantificadas procedentes de tres

EDAR diferentes: Cuenca del Carraixet, Quart Benàger y Denia-Ondara-Pedreguer.

En cuanto a las EDAR de donde proceden las muestras, a continuación se presentan sus

características.

3.1.1. EDAR Cuenca del Carraixet.

Situada en la comarca de L‟Horta Nord en la provincia de Valencia, esta planta depuradora posee

un caudal de proyecto de 40.000 m3/día, dando servicio a los municipios de Albalat dels Sorells, Alboraya,

Alfara del Patriarca, Almàssera, Bonrepòs y Mirambell, Foios, Godella, Meliana, Moncada, Rocafort,

Tavernes Blanques, Valencia y Vinalesa. Presenta rendimientos del 99% de SS, 97% de DBO5 y 96% de

DQO, según los datos de funcionamiento proporcionados por la EPSAR en el año 2012.

Figura 13. Vista aérea de la EDAR Cuenca del Carraixet.

Esta depuradora consta de dos líneas de depuración iguales en las que se distribuyen el caudal

entrante a los subsecuentes elementos. Estas líneas se denominan línea A+B y línea C+D, y de ambas han

sido tomadas las muestras como se puede observar en la tabla 3.

Figura 14. Diagrama de proceso en bloques de la EDAR Cuenca del Carraixet con sistema de fangos activos sin eliminación de nutrientes.




3.1.2. EDAR Quart Benàger.

Esta depuradora se ubica en la comarca de L‟Horta Oest en la provincia de Valencia. Con un

caudal de proyecto de 60.000 m3/día da servicio a los municipios de Alaquàs, Aldaia, Manises, Mislata,

Quart de Poblet, Valencia y Xirivella. Presenta rendimientos de 98% de SS, 98% de DBO5 y 95% de

DQO según los datos actualizados por la EPSAR en 2013.

Figura 15. Vista en planta de la EDAR Quart Benàger.

Figura 16. Diagrama de proceso en bloques de la EDAR Quart Benàger con sistema de fangos activos y con eliminación química de fósforo.

3.1.3. EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

Esta planta depuradora está ubicada en la comarca de la Marina Alta en la provincia de Alicante.

Posee un caudal de proyecto de 15.400 m3/día y sirve únicamente a los municipios de Dénia, Ondara y

Pedreguer. Presenta rendimientos de 97% de SS, 95% de DBO5 y 93% de DQO según los datos

proporcionados por la EPSAR de 2013.




Figura 17. Vista en planta de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

Figura 18. Diagrama de bloques de proceso de EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer con sistema de fangos activos, sin decantación primaria y con eliminación química de

fósforo.

3.2. Fijación y permeabilización de las muestras.

La fijación y permeabilización de las muestras es el primer paso a realizar tras la recolección de las

mismas, de manera que los microorganismos que hay en ellas queden estáticos y conserven lo más intacto

posible su estructura celular. Con ello se facilita su futura identificación y el manejo de muestras donde se

encuentran.

Puesto que los microorganismos pertenecen tanto al grupo de Gram positivos como a los Gram

negativos, se ha de seguir unos pasos parcialmente distintos para cada uno de ellos. Las bacterias Gram

negativas se fijan con paraformaldehído (PFA) y las Gram-positivas con etanol (EtOH).

Como se puede observar en el esquema de fijación siguiente queda también incluido el grupo

mycolata, aunque no ha sido objeto de estudio en este proyecto..




FIJACIÓN

Figura 19. Esquema del paso de fijación de las muestras según el tipo de bacterias que se quieran analizar (Gram positivas, Gram negativas o mycolata).

Tras este paso hay que preparar los portaobjetos de manera que se asegure la adherencia y permanencia de

las muestras a depositar.




Se presentan a continuación los protocolos de preparación de los reactivos para la técnica FISH

necesarios para cada una de las fases de la técnica (lavado e hibridación), incluyendo los de la fase previa

de fijación y permeabilización.

Preparación de los reactivos empleados en el método molecular FISH:

Tampón fosfato salino:

1. Concentración PBS 1X

NaCl.............…..…..7,60 g

NaH2PO

4∙H

2O....... 1,38 g

NaH2PO

4∙H

2O....... 1,78 g

Agua destilada.......1000 mL

pH 7,2

2. Concentración PBS 3X

NaCl............ 22,8 g

NaH2PO4.... 3 g

Na2HPO4.... 2,88 g

Agua destilada .... 1000 ml

pH 7,4

Preparación: primero disolver los fosfatos y luego el cloruro sódico. Esterilizar por filtración 0,45 μm ó 0,2 μm y

conservar a 4ºC.

Paraformaldehído:

1. Calentar 65 ml de agua bidestilada hasta 60ºC.

2. Añadir 4 g de paraformaldehido (PFA).

3. Añadir 1 gota de una solución de NaOH 2M y agitar rápidamente hasta que la solución se haya clarificado.

4. Quitar de la fuente de calor y añadir 33 ml de PBS 3X.

5. Ajustar el pH a 7,2 con HCl.

6. Eliminar cualquier resto de cristales por filtración a través de 0,2 μm.

7. Enfriar rápidamente a 4ºC y conservar a esta temperatura.

Solución de gelatina (preparación portaobjetos):

- Gelatina............... 0,1%

- Sulfato potásico cromato ........ 0,01% (Sigma ref. C-5926, 12H20)

1. Calentar previamente el agua destilada hasta 60ºC.

2. Fundir la gelatina (100 mg 0,1% + 10 mg sal de cromato. 12H20, 0,01%) en 100 ml de agua destilada.

3. Enfriar a 50ºC para sumergir los portas.

Solución de limpieza de portaobjetos FISH:

- Reactivo de limpieza: Etanol con 10% KOH.

Etanol 100% (Fijación y lavado):

- Reactivo etanol absoluto grado PRS. Guardar a temperatura ambiente para lavados y a 4ºC para fijación.




Etanol 80% (Lavado):

- Etanol absoluto.......... 400 ml

- Agua destilada............ 100 ml

Guardar a temperatura ambiente.

Etanol 50% (Lavado):

- Etanol absoluto.......... 250 ml

- Agua destilada............ 250 ml

Guardar a temperatura ambiente.

Cloruro sódico 5M (tampón de hibridación y tampón de lavado):

- Cloruro sódico (NaCl) …….292,2 g

- Agua destilada……………..1000 mL

Preparación: disolver el NaCl en 800 mL de agua destilada y ajustar el volumen hasta 1 litro. Distribuir en alícuotas. Esterilizar en

autoclave a 121ºC durante 15 minutos y por filtración.

EDTA 0.5M (cuando la concentración de formamida es > o igual a20%)

- EDTA 2H2O.....................186,1 g

- Agua destilada................ hasta 1000 mL

Preparación: pesar el EDTA y añadir a 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8,0 con NaOH (el reactivo no se disuelve

hasta ajustar el pH a 8,0). Completar hasta 1000 mL con agua destilada. Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y por

filtración.

Tris-HCl 1M pH 8.0 (tampón de hibridación y tampón de lavado):

- Tris Base ............. 121,1 g

- HCl.................... 42 ml de HCl concentrado

- Agua destilada................ hasta 1000 ml

Preparación: pesar el Tris y añadir a 800 ml de agua destilada. Añadir 42 ml de HCl concentrado y completar hasta 1000 ml

con agua destilada. Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y filtración.

Agua Mili-Q (tampón de hibridación y tampón de lavado):

- Agua Milli-Q ...........200 ml

Esterilizar en autoclave 121ºC durante 15 minutos y por filtración.

SDS 10% (tampón de hibridación y tampón de lavado):

- SDS ........... 10 g

- Agua destilada....... Hasta 100 ml

Esterilizar en autoclave y por filtración

FORMAMIDA (tampón de hibridación y tampón de lavado):

Volúmenes de formamida y % en función de la sonda. Formamida ultrapura (Sigma). Guardar a temperatura ambiente.

Sondas marcadas con fluoróforo TAMRA:

- Entre 25-50 ng/µL de concentración de trabajo.

Reactivo para evitar pérdida de fluorescencia.

- Reactivo Vectashield. Conservar a temperatura de 4ºC.




Reactivo lisozima:

- Lisozima 183.000 U/mL

- 31,5 mg lisozima sigma para 1 mL de tampón.

- Tampón lisozima:

pH 8

Tris/HCl…100 mM

EDTA……50 mM.

3.3. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA (FISH).

3.3.1. Tratamiento de portaobjetos FISH cubiertos con teflón.

1. Lavar con solución salina.

2. Enjuagar con agua destilada.

3. Secar al aire (dejar escurrir 24 horas, cubriendo los portas para protegerlos del polvo

ambiental).

4. Cubrir por inmersión con gelatina en la solución de gelatina 0,1% con cromato sulfato

potásico 0,01% (preparada en el momento a 60ºC de temperatura).

5. Secar al aire.

3.3.2. Aplicación de las muestras a los portaobjetos FISH.

1. Poner un volumen entre 3 y 5 µl de muestra fijada en los pocillos pertinentes del

portaobjetos FISH.

2. Secar el portaobjetos al aire.

3. Tratamiento con lisozima (para las Gram-positivas: sondas NLIMI 91, NLIMII 192 y la

sonda mixta NLIMIII):

3.1. Aplicar 20µl de solución de lisozima (183.000 U/mg) a cada pocillo.

3.2. Incubar los portaobjetos a 37ºC durante 30 minutos.

3.3. Lavar los portaobjetos con agua MiliQ, por inmersión apenas 5 segundos.

4. Tratamiento de deshidratación (tras secado para las Gram-negativas: sondas Noli-644,

AHW 183 y MC2-649; tras el tratamiento con lisozima para las Gram-positivas):

4.1. Lavar con agua MiliQ y secar al aire.

4.2. Deshidratar en etanol al 50% por inmersión, durante 3 minutos.



5. Secar los portaobjetos al aire.




3.3.3. Sondas utilizadas en el estudio del morfotipo “Nostocoida limicola”.

Para la detección e identificación de las bacterias filamentosas “Nostocoida limicola” se utilizaron en

este proyecto las sondas presentadas en la tabla 4.

Las sondas empleadas están marcadas con el fluoróforo TAMRA, es decir, una rodamina de

formulación 5-6-carboxy-tretrametilrodamina, cuya longitud de onda de absorción es de 546 nm (luz

verde) y que emite a longitud de onda mayor de 574 nm (luz roja).

Tabla 4. Sondas empleadas para la identificación de los morfotipos I, II y III de “Nostocoida limicola”.

Sonda Secuencia (5’- 3’) Morfotipo/

Gram Especificidad/ Clasificación

Referencia bibliográfica

Noli-644 TCCGGTCTCCAGCCACA II / Negativo

Ca*. “Alysiosphaera europaea”/ α-Proteobacteria

Snaidr et al. (2002)

MC2-649 CTCTCCCGGACTCGAGCC II / Negativo

Ca*. “Molinibacter batavus” / α-Proteobacteria

Snaidr et al. (2002)

AHW 183 CCGACACTACCCACTCGT II / Negativo

Nostocoida limicola II / Phyllum Chloroflexi

Schade et al. (2002)

NLIMI 91 CGCCACTATCTTCTCAGT I / Positivo Trichococcus sp. / Phyllum Firmicutes

Liu y Seviour (2001)

NLIMII 192

AGACTTTCCAGACAGGAG II/ Positivo

Tetrasphaera japonica / Phyllum Actinobacteria


NLIMIII* 301

CCCAGTGTGCCGGGCCAC III/ Positivo

Isosphaera sp. / Phyllum Planctomycetes


NLIMIII * 729

AGCATCCAGAACCTCGCT III/ Positivo



NLIMIII * 830

CCATCGGCGAGCCCCCTA III/ Positivo



Ca.* Simplificación de Candidatus. NLIMIII*: en el estudio se emplean estas tres sondas en una, denominada NLIMIII mix.

3.3.4. Hibridación in situ.

Tras la fijación de las muestras y su aplicación en los portaobjetos FISH, se comienza el protocolo

de hibridación que consiste principalmente en la preparación de dos tampones, el tampón o solución de

lavado y el tampón de hibridación, que difiere principalmente en que el tampón de hibridación contiene

formamida y en el de lavado se varía la concentración de NaCl en función del porcentaje de formamida

del tampón de hibridación.

El porcentaje de formamida (FA) es la concentración óptima de formamida que viene definida por la

especificidad de la sonda de identificación del microorganismo. Para “Nostocoida limicola” se requiere un

35% de FA para las sondas Noli-644, MC2-649 y AHW 183, y un 20% de FA para todas las demás

presentadas en la tabla 4.




El procedimiento de hibridación es el siguiente:

1. Preparar la solución de hibridación según el porcentaje de FA necesario en un microtubo o

tubo Korning de 2 mL. (ver tabla 5).

2. Aplicar 9 µL de la solución de hibridación + 1 µL de sonda en cada pocillo y repartir

homogéneamente por todo el campo, con cuidado de no tocar la muestra para no estropearla

o eliminarla del pocillo.

3. En un tubo de 50 mL posicionado horizontalmente introducir papel de celulosa y verter

sobre su superficie 1,5 mL de la solución de hibridación, para crear una atmósfera húmeda.

4. Introducir el porta FISH en el tubo manteniéndolo en posición horizontal e incubar a 46ºC

durante 2 horas, como mínimo.

Es necesario a partir de ese momento mantener condiciones de oscuridad (evitar el contacto de

las preparaciones con la luz), de este modo se evitará la pérdida de fluorescencia del fluoróforo.

Tabla 5. Preparación del tampón de hibridación según el porcentaje de formamida.

Reactivo % de Formamida

10% 20% 25% 30% 35% 40% 45%

NaCl 5M 360 µL 360 µL 360 µL 360 µL 360 µL 360 µL 360 µL

HCl-Tris 1M 40 µL 40 µL 40 µL 40 µL 40 µL 40 µL 40 µL

Formamida 200 µL 400 µL 500 µL 600 µL 700 µL 800 µL 900 µL

Agua MiliQ 1398 µL 1198 µL 1098 µL 998 µL 898 µL 798 µL 698 µL

SDS 10% 2 µL 2 µL 2 µL 2 µL 2 µL 2 µL 2 µL

Volumen final 2000 µL 2000 µL 2000 µL 2000 µL 2000 µL 2000 µL 2000 µL

5. Precalentar a 48ºC tubos de 50 mL estériles previamente a la preparación de la solución de

lavado (ver tabla 6).

6. Sacar de la estufa los portaobjetos y rápidamente lavarlos con un ligero chorro de la solución

de lavado.

7. Sumergir los portaobjetos en la de solución de lavado y envolver los tubos de lavado con

papel de aluminio para evitar el contacto con la luz.

8. Incubar a 48ºC en baño durante 15-20 minutos los tubos.

9. Lavar con agua destilada y secar al aire en oscuridad.

10. Observar las muestras al microscopio o bien guardar los portaobjetos a -20ºC si no se realiza

la observación inmediatamente.




Tabla 6. Preparación de la solución de lavado según el porcentaje de formamida.

Reactivo % de Formamida

10% 20% 25% 30% 35% 40% 45%

NaCl 5M 4500 µL 2150 µL 1490 µL 1020 µL 700 µL 460 µL 300 µL

EDTA 0,5 M - 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL

HCl-Tris 1M 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL

Agua MiliQ 44,45 mL 46,3 mL 47,94 mL 47,43 mL 47,75 mL 47,06 mL 48,15 mL

SDS 10% 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL

Volumen final 50 mL 50 mL 50 mL 50 mL 50 mL 50 mL 50 mL

Se recomienda preparar primero la solución de lavado ya que requiere mayor tiempo de

preparación (previa incubación a 48ºC) que la del tampón de hibridación.

3.4. Observación al microscopio de epifluorescencia.

Para la observación de la muestra al microscopio de epifluorescencia se coloca, entre los pocillos

del portaobjetos, una gota de Vectashield (Vector Laboratories Inc., Bulgaria, (CA9400)), un reactivo que

evita el deterioro y pérdida de fluorescencia de la muestra hibridada.

Se coloca un cubreobjetos sobre la muestra y se observa con los objetivos de 60X o a 100X, en

este último caso hay que añadir aceite de inmersión. Normalmente a 60X es suficiente para la detección y

visualización de los microorganismos filamentosos en la muestra. Es recomendable que los objetivos estén

etiquetados con las siglas APO, ya que dan lugar a una mejor visualización de la muestra, sin aberraciones

y mejoran la reflexión de la fluorescencia.

Figura 20. Objetivos APO de 60X y 100X de gran utilidad para visualizar con microscopio de epifluorescencia.

El microscopio utilizado para la observación de las muestras ha sido OLYMPUS BX 50. Las

fotografías en color se realizaron con una cámara digital Olympus DP 10 acoplada al microscopio con los

filtros: U-MWIB (Fluoresceína, FAM) y U-MWIG (Rodamina, TAMRA).




Figura 21. Microscopio de epifluorescencia Olympus BX 50 del IIAMA.

3.5. Cuantificación de microorganismos filamentosos.

Durante la observación al microscopio de epifluorescencia se realizó la cuantificación de

“Nostocoida limicola” mediante la herramienta elaborada por Eikelboom y Jenkins (2004) que consiste en

una escala subjetiva de abundancia de microorganismos filamentosos como se observa en la tabla y figura

siguientes.

Tabla 7. Criterios de valoración de Eikelboom y Jenkins (2002) para calificar la abundancia de bacterias

filamentosas.

Índice de Filamentos (IF) Criterio de Abundancia Descripción

0 “Ninguno” Ningún filamento presente

1 “Pocos” Pocos filamentos y de forma casual en el flóculo.

2 “Algunos” Filamentos aproximadamente en la mitad de los flóculos.

3 “Comunes” Filamentos en todos los flóculos con baja densidad (1-5/flóculo)

4 “Muy comunes” Filamentos en todos los flóculos con densidad media (5-20/flóculo)

5 “Abundantes” Filamentos en todos los flóculos con alta densidad (>20/flóculo)

Figura 22. Representación fotográfica de los criterios de valoración de abundancia de

microorganismos filamentosos.




Se considera un tipo de microorganismo filamentoso como dominante y probable responsable

principal de problemas de bulking y/o foaming si se clasifica en categoría “común” o superior (IF ≥ 3).

Son organismos secundarios aquéllos que estén presentes, pero no con la suficiente abundancia

como para representar un problema de espumación y son los englobados en la categoría de “algunos” o

inferior (IF ≤ 2).

Este es un método rápido y capaz de establecer si un organismo filamentoso es dominante o

secundario, y si responde a las medidas de control. Las categorías de abundancia suelen coincidir entre las

apreciaciones de distintos observadores, siendo reproducibles dentro de un margen de ±1 categoría.

La observación microscópica para indicar un índice de filamentos representativo de la muestra, es

de al menos la mitad de los campos posibles que se puedan ver en el pocillo donde ésta se ha aplicado. Se

puede realizar un barrido superficial de todo el pocillo, determinando con esto, aproximadamente, los

campos que serán representativos en el criterio de abundancia de filamentosas a determinar.

3.6. Parámetros físico-químicos y parámetros operacionales.

Una vez establecidas e identificadas las variables biológicas mediante la técnica FISH de los

distintos grupos de “Nostocoida limicola”, se presentan los parámetros físico-químicos analizados (mediante

los procedimientos establecidos en el manual Standard Methods de la American Public Health Assocciation,

APHA (2005)) y los parámetros operacionales con los que trabajan las EDAR de donde fueron tomadas

las muestras.

Tabla 8. Parámetros físico-químicos analizados y empleados en el presente estudio.

Parámetro Abreviatura Unidades

Afluente

Porcentaje DQO soluble %DQOs %

Relación DBO/DQO DBO/DQO -

Nitrógeno total Nt_af mg N/L

Carga de nitrógeno total CNT kg N/kg SSVLM·d

Nitrógeno total soluble Nts_af mg N/L

Carga de nitrógeno total soluble CNTs kg N/kg SSVLM·d

Nitrógeno amoniacal N-NH4_af mg N-NH4/L

Porcentaje Nitrógeno amoniacal %N-NH4 %

Carga de Nitrógeno amoniacal CN-NH4 kg N-NH4/kg SSVLM·d

Nitrógeno orgánico N_org_af mg N/L

Nitrógeno orgánico soluble N_orgs_af mg N/L

Fósforo total PT_af mg P/L

Carga de fósforo total CPT kg P/kg de SSVLM·d

Fósforo total soluble PTs_af mg P/L

Carga de fósforo total soluble CPTs kg P/kg de SSVLM·d

Fósforo relativo a ortofosfatos P_PO4_af mg P-PO4/L




Porcentaje fósforo relativo a ortofosfatos %P_PO4_af %

Carga de fósforo relativo a Ortofosfatos CP_PO4 kg P-PO4/kg SSVLM·d

Fósforo orgánico Porg_af mg P/L

Fósforo orgánico soluble Porgs_af mg P/L

Relación DBO5 y Nitrógeno Kjeldahl total DBO5/NKT mg DBO /mg de N

Relación DQO y Nitrógeno Kjeldahl total DQO/NKT mg DQO /mg de N

Relación DBO5 y fósforo total DBO5/Pt mg DBO /mg de P

Relación DQO y fósforo total DQO/Pt mg DQO /mg de P

Tensioactivos Tensani_af mg/L

Hidratos de carbono CARBO mg/L

Carga de hidratos de carbono CCARBO kg HC/kgSSVLM

Proteínas Prote mg/L

Carga de proteínas Cprote kg proteínas/kgSSVLM

Ácidos grasos volátiles AGV mg/L

Carga de ácidos grasos volátiles CAGV kg AGV/kgSSVLM

Licor mezcla

pH pHLM -

Conductividad CondLM µS/cm

Sólidos suspendidos SSLM mg SS/L

Sólidos suspendidos volátiles SSVLM mg SSV/L

Porcentaje sólidos suspendidos volátiles %SSVLM %

Índice volumétrico del fango IVF ml/g

Nitrógeno total de SSV del licor mezcla NT SSVLM mg/L

Fósforo total PT SSVLM mg/L

DQO del licor mezcla DQOLM mg/L

Temperatura Tª ºC

Tabla 9. Parámetros operacionales de funcionamiento de las EDAR estudiadas.

Parámetro Abreviatura Unidades

Carga másica en base a la DBO CmDBO kg DBO5/kg SSVLM·d

Carga másica en base a la DQO CmDQO kg DQO/kg SSVLM·d

Tiempo de retención hidráulico del reactor TRHr Horas

Edad del fango EF Días

Oxígeno disuelto bajo * O_bajo %

Oxígeno disuelto medio * O_medio %

Oxígeno disuelto alto * O_alto %

* En relación a los parámetros del oxígeno, los rangos numéricos que rigen esta clasificación son para oxígeno disuelto bajo: <0,8 ppm, para oxígeno disuelto medio: 0,8-2 ppm y para oxígeno disuelto alto: de >2 ppm.

Los datos físico-químicos y operacionales que caracterizan cada EDAR fueron analizados en estudios

anteriores y han sido facilitados para el análisis estadístico multivariante de este proyecto.

Con todos estos parámetros, de aquí en adelante, variables ambientales o variables explicativas, se

realizará un análisis estadístico con el que se pretende explicar la ecología del morfotipo filamentoso

“Nostocoida limicola” en función de las identificación con las sondas FISH (variables biológicas) en las

EDAR seleccionadas en este proyecto de investigación.




3.7. Análisis estadístico aplicado en el estudio.

En el análisis estadístico se emplearon un total de 48 variables ambientales (41 variables físico-

químicas y 7 variables operacionales) y 6 variables biológicas (correspondientes a cada una de las sondas

FISH utilizadas para la identificación del morfotipo “Nostocoida limicola”) y las 93 muestras de las EDAR

implicadas en este estudio.

Por convenio para realizar análisis estadístico de un conjunto de datos se requiere obtener las

medias, mínimos y máximos y desviación típica estándar de dichos datos. Consecuentemente se

emplearon técnicas estadísticas para obtener la relación de variabilidad entre las variables ambientales y las

biológicas, es decir, averiguar los cambios en la composición y abundancia de la población microbiana en

estudio según las variables ambientales.

Puesto que se trata de un estudio que entraría, entre otros, dentro de la ecología microbiana, se

utilizaron dos tipos de análisis muy aplicados y especializados en este campo. En primer lugar se introdujo

un análisis bivariante mediante el cálculo del coeficiente de Spearman y posteriormente se aplicó el análisis

multivariante mediante un análisis de redundancia.

3.7.1. Análisis bivariante. Coeficiente de correlación de Spearman.

Las técnicas de análisis bivariante expresan el grado de relación entre dos variables. Son

consideradas, en algunos supuestos, como casos simplificados de análisis multivariantes. Por ello es

recomendable realizar una exploración previa mediante este tipo de análisis antes de abordar la aplicación

de cualquier técnica multivariante.

La correlación es la técnica bivariante de uso frecuente aplicada para resumir la fuerza de la

asociación entre dos variables métricas. El coeficiente de correlación de Pearson y de Spearman son las

dos técnicas estadísticas de análisis bivariante empleadas para medir dicha fuerza de asociación.

Ambos coeficientes conllevan una prueba de significación asociada con la que únicamente se

prueba la hipótesis nula de que el coeficiente puede ser igual a 0, lo que significa que no existe ninguna

relación lineal entre ambas variables. El nivel de significación “P” representa, entonces, la probabilidad

de error que se comete al aceptar el resultado observado como válido. Cuanto mayor es este nivel de

significación mayor es el error que se comete al aceptar que las correlaciones observadas entre las variables

son indicadoras de la relación entre las respectivas variables del conjunto de datos. Por ejemplo, si P es ≤

a 0,05 existe una probabilidad del 5% de que la relación observada entre las variables en la muestra

estudiada sea casualidad. Este nivel del 0,05 es considerado un nivel de error aceptable en casi la mayoría

de las áreas de estudio donde se aplica análisis estadístico.




3.7.1.1. Coeficiente de correlación de Spearman.

El coeficiente de correlación de Spearman (1904) es una medida de asociación lineal que mide la

intensidad de la relación entre dos variables X e Y linealmente relacionadas siempre que estas sean

ordinales o bien de intervalo (rangos), es decir, que no satisfagan el supuesto de la normalidad (a diferencia

del coeficiente de Pearson), como son los datos ecológicos o ambientales.

La correlación de Spearman se basa en los rangos de los datos en lugar de los valores reales, y

compara dichos rangos para cada grupo de variables (Conover, 1998). El uso de este coeficiente

estadístico se aconseja en el momento en que se tiene un número alto de categorías.

El coeficiente de correlación de Spearman es utilizado para variables que sean aleatorias

continuas, o al menos una de ellas, de forma que los objetos o individuos puedan posicionarse en series

ordenadas (Siegel, 1983). Se calcula a través de la siguiente ecuación:

𝑟𝑠 = 1 −6 · ∑𝑑𝑖

2

𝑛(𝑛2 − 1)

di= diferencia entre los rangos de X e Y, es decir: di=rxi-ryi

N= número de valores de la muestra.

Los valores de los rangos se colocan según el orden numérico de los datos de la variable

estudiada. El coeficiente de correlación de Spearman está comprendido entre los valores +1 y -1, donde el

valor de +1 indica que existe correlación positiva fuerte entre las variables (existe una fuerte relación

lineal), 0 indica que no hay correlación lineal entre las variables y -1 que existe una asociación negativa.

3.7.1.2. Tratamiento de los datos con el coeficiente de Spearman.

Lo primero que se comprueba es si los datos siguen una distribución normal o no mediante el test

de Asimetría. Aquellos datos que no siguen dicha distribución normal se transforman a través del cálculo

logarítmico siguiente (Esteban et al., 1991):

𝑉𝑎𝑟𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒 = 𝐿𝑛 (𝑣𝑎𝑟𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒 + 1)

Mediante el programa IBM SPSS versión 19 se obtuvo el coeficiente de correlación de

Spearman. Para ello, se introdujo en el programa una matriz con los parámetros físico-químicos y los

parámetros operacionales, además de las especies de “Nostocoida limicola”, en este caso nombradas según las

sondas FISH con las que se les identifica.

El programa genera como salida de este estudio una tabla con los valores de las correlaciones y los

p-valores de cada una. Estos últimos indican la bondad estadística del modelo ajustado. Por ejemplo p-




valores ≤ 0,05 indican una relación estadísticamente significativa al 95%. Esta prueba de significancia nos

sirve para discriminar si aceptamos o no la hipótesis nula que se plantea en el siguiente análisis estadístico.

Con este tratamiento se pretende realizar una exploración previa de la intensidad de la asociación lineal

entre las variables biológicas y las variables ambientales, de manera que de todas las variables físico-químicas y

operacionales (ambientales) presentadas en las tablas 8 y 9, se descartan aquéllas que muestran poca

correlación entre las variables ambientales y las variables biológicas. Así, para el posterior análisis se

presenta una matriz de datos con aquellas variables ambientales que se presentan en los resultados del

SPSS como variables de gran fuerza en la variación de los microorganismos objeto de este estudio.

De todos modos, hay que tener en cuenta que el coeficiente de correlación de Spearman es una

técnica previa exploratoria, lo que hay que tener en cuenta a la hora de evaluar los resultados obtenidos,

por lo que el análisis no es riguroso. Esto será confirmado por el siguiente método estadístico más

avanzado de ordenación ambiental.

3.7.2. Análisis multivariante. Análisis de Redundancia (RDA).

El análisis multivariante es la parte de la estadística y del análisis de datos que estudia, analiza,

representa e interpreta los datos que resultan de observar más de una variable estadística sobre una

muestra de individuos. Las variables observables son homogéneas y correlacionadas, sin que ninguna

predomine sobre las demás.

Dentro del análisis multivariante se encuentran diversas técnicas exploratorias y explicativas. Las

técnicas exploratorias buscan y analizan la relación entre las variables, y las técnicas explicativas tratan de

interpretar dicha relación en base a la hipótesis nula de que la variables X e Y no presentan relación. Para

el presente estudio se emplea el Análisis de Redundancia (RDA).

3.7.2.1. Análisis canónico de Redundancia (RDA).

Es una técnica estadística explicativa (Rao et al., 1964) en gradiente directo, lo que quiere decir que

intenta explicar únicamente la relación entre aquéllas variables que están directamente asociadas a variables

ambientales.

Es un tipo de análisis similar al Análisis de Correspondencias Canónico (CCA) con la que se

reduce la información disponible de un conjunto de datos con gran cantidad de variables o categorías, de

manera que busca encontrar la respuesta de las variables biológicas (los organismos) sobre la combinación

de un conjunto de variables ambientales, considerando simultáneamente la información biológica y la

ambiental.




A diferencia del CCA, que sigue un modelo unimodal, el análisis canónico de Redundancia es

también un análisis canónico pero basado en modelos lineales, por lo que también es considerado como

una extensión del Análisis de Componentes Principales (PCA), que sigue esta linealidad. En este caso, los

principales ejes son constreñidos para ser combinaciones lineales de variables ambientales.

Para poder aplicar este análisis de Redundancia, es necesario preparar dos tablas: una para los

datos de las especies o individuos biológicos (variables “dependientes”) y otra para las variables

ambientales (variables “independientes”). Esta última tabla presenta sólo los parámetros operacionales y

físico-químicos que no han sido descartados con el previo análisis bivariante.

Tabla 10. Variables físico-químicas y operacionales a introducir en el análisis de Redundancia.

Parámetros Físico-Químicos Abreviatura Parámetros Operacionales Abreviatura

Afluente

Porcentaje DQO soluble %DQOs Carga másica en base a la DBO CmDBO

Biodegradabilidad DBO/DQO Carga másica en base a la DQO CmDQO

Carga de nitrógeno total CNT Tiempo de retención hidráulico del

reactor TRHr

Porcentaje Nitrógeno amoniacal %N-NH4 Edad del fango EF

Carga de Nitrógeno amoniacal CN-NH4 Oxígeno disuelto bajo O_bajo

Carga de fósforo total CPT Oxígeno disuelto medio O_medio

Porcentaje fósforo relativo a ortofosfatos %P_PO4_af Oxígeno disuelto alto O_alto

Carga de fósforo relativo a Ortofosfatos CP_PO4

Relación DBO5 y Nitrógeno Kjeldahl total DBO5/NKT

Relación DBO5 y fósforo total DBO5/Pt

Carga de hidratos de carbono CCARBO

Carga de proteínas Cprote

Carga de ácidos grasos volátiles CAGV

Licor mezcla

pH pHLM

Conductividad CondLM

Sólidos suspendidos SSLM

Sólidos suspendidos volátiles SSVLM

Porcentaje sólidos suspendidos volátiles %SSVLM

Índice volumétrico del fango IVF

Nitrógeno total de los SSV NT SSVLM

Fósforo total de los SSV PT SSVLM

Temperatura Tª

Los análisis canónicos extraen toda la varianza de la matriz respuesta (donde se sitúan las variables

biológicas) que está relacionada con la matriz explicativa (variables ambientales, tabla 10).

La ordenación de la matriz respuesta se precisa de forma que los vectores de ordenación

resultantes son combinaciones lineales de las variables de la matriz explicativa.

Lo que se busca con el análisis de Redundancia es la mejor ordenación de los objetos, de modo

que no sólo se representen los principales patrones de variación de las especies o variables biológicas a

través de las variables ambientales (Ramette, 2007), sino también mostrando los coeficientes de

correlación de cada variable biológica y cada variable ambiental en el conjunto de datos.




El proceso del RDA es el siguiente:

Sean X= (X1, …, Xp), Y=(Y1, …, Yq) dos vectores aleatorios de dimensiones p y q. Se pretende

encontrar dos variables compuestas, U = Xa = a1X1+ … + apXp, V = Yb = b1Y1 + … + bqYq, siendo a =

(a1, …, ap), b = (b1, …, bq)´, tales que la correlación entre ambas sea máxima. Se indicarán por S11, S22 las

matrices de covarianzas (muestrales) del primer y segundo conjunto, es decir, de las variables X, Y,

respectivamente, y sea S12 la matriz p x q con las covarianzas de las variables X con las variables Y. Es

decir:

𝑋 𝑌𝑋 𝑆11 𝑆12

𝑌 𝑆21 𝑆22

donde: S21 = S12

Figura 23. Matriz de covarianzas RDA.

Entonces podremos suponer que var (U) = a´S11a =1 , var (V) = b´S22b = 1, reduciendo el

problema a maximizar a´S12b restringido a a´S11a =1, b´S22b = 1.

Los vectores de coeficientes a, b que cumplen esta condición son los primeros vectores

canónicos. La máxima correlación entre U, V es la primera correlación canónica r1. La posibilidad de

comprobar si existe una relación estadísticamente significativa entre la composición de la comunidad y una

matriz de variables ambientales permite pasar de un uso meramente descriptivo de las ordenaciones a

emplearlas como herramientas para el contraste de hipótesis formuladas a priori. La hipótesis nula (H0) de

un análisis canónico es que no existe relación alguna entre la matriz de variables respuesta y la matriz de

variables explicativas. La significación de esta hipótesis nula se puede evaluar mediante permutaciones, es

decir, que se evalúa el tipo de distribución o el orden que sigue el conjunto de los datos de nuestro

estudio. En este caso, el estadístico es la suma de todos los valores propios canónicos y su significación se

evalúa mediante un test de la F. La hipótesis alternativa (HA) establece que la suma de todos los valores

propios canónicos es mayor que la que se obtiene de matrices en las que se han permutado sus filas de

datos. Esta hipótesis es la que seguirá el RDA.

3.7.2.2. Postratamiento de los datos con la técnica multivariante RDA.

Para realizar el análisis de redundancia se utilizó el programa XLSTAT versión 2013.4.05, donde

se introdujo la matriz de datos y se especificaron las variables para realizar el análisis.

En primer lugar se comprobó si existían relaciones lineales entre las variables o bien unimodales,

para ello se evaluaron los resultados de las pruebas de permutación, que indican la aceptación o rechazo de

la hipótesis nula.




Como se comentaba en el apartado anterior, la hipótesis nula establece que no existe relación

lineal entre la matriz de variables respuesta (organismos) y la matriz de variables explicativas (variables del

proceso). En los casos que no se acepta la hipótesis nula no es posible llevar a cabo el CCA y se debe

proceder a la realización del análisis de redundancia canónica (RDA). En este caso todos los datos analizados

dieron como resultado el rechazo de la hipótesis nula, como resultado de los test de permutación, por lo que se ha aplicado el

análisis de redundancia.

El resultado del RDA consiste principalmente en un diagrama de ordenación (biplot o triplot)

formato por un sistema de ejes o dimensiones, los cuales son combinación lineal de las variables

explicativas. En ellos es posible representar los sitios, las especies (u organismos en general) y las variables

ambientales. Para este estudio, se empleó un diagrama biplot, para las especies y las variables

ambientales. Este diagrama es una representación gráfica de datos multivariantes con el que se reduce la

dimensionalidad del conjunto de datos, a partir de una representación conjunta de filas y columnas de una

matriz de datos. Esto último es lo que lo diferencia de otros gráficos de reducción de dimensionalidad.

Este diagrama representa un análisis directo del gradiente. La longitud de las variables explicativas,

representadas por vectores, indica su variabilidad. Cuanto menor es el ángulo entre ellas más directa es la

relación entre las variables, si forman un ángulo de 90º significa que las variables no están relacionadas, y a

medida que este se va a aproximando a un ángulo de 180º la relación que indica es decreciente. Cuanto

más alto corte la perpendicular de la variable respuesta con la variable explicativa mayor será el grado de

relación entre ambas.




4. RESULTADOS.

4.1. Hibridación in situ con sondas 16S rDNA (FISH).

Se presentan en las siguientes figuras algunas de las bacterias del morfotipo “Nostocoida limicola”

cuya hibridación dio resultado positivo y que, por tanto, pudieron visualizarse en el microscopio de

epifluorescencia. La coloración roja de las imágenes es debida a que las sondas utilizadas en la técnica

FISH están marcadas con fluorocromo TAMRA, que absorbe luz verde y emite en longitud de onda

mayor, luz roja.

En cada pie de figura se detallan los aumentos a los que se realizó la fotografía y la EDAR a la que

pertenece la muestra hibridada.

4.1.1. Sonda Noli-644.

Sonda que detecta bacterias filamentosas del morfotipo “N. limicola” II, de tipo Gram negativo

(Snaidr et al., 2002). Filogenéticamente las bacterias se identifican como “Ca. Alysiosphaera europaea”

dentro del phyllum α-Proteobacteria.

Figura 24. “Ca. Alysiosphaera europaea” a 600X. A) Muestra de EDAR Quart Benàger. B) Muestra de EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

4.1.2. Sonda MC2-649.

Esta sonda hibrida para la bacteria filamentosa “Ca. Molinibacter batavus”, agrupada dentro del

morfotipo “N. limicola”II y Gram negativa (Snaidr et al., 2002). Filogenéticamente esta bacteria pertenece al

phyllum α-Proteobacteria.

Figura 25. “Ca. Monilibacter batavus” a 600X. Muestra de EDAR Cuenca del Carraixet (línea A+B).

A B




Figura 26. A) “Ca. Monilibacter batavus” a 600X perteneciente a la EDAR de Dénia-Ondara-Pedreguer. B) La misma bacteria vista en contraste de fases, donde podemos observar que se ubica parcialmente dentro del flóculo.

4.1.3. Sonda AHW 183.

Sonda que detecta bacterias filamentosas del morfotipo “N. limicola” II, de tipo Gram negativo

(Schade et al., 2002). Filogenéticamente las bacterias se identifican como Nostocoida limicola II dentro del

phyllum Choloroflexi.

Figura 27. Nostocoida limicola II a 600X. Muestra de EDAR Cuenca del Carraixet (línea C+D).

4.1.4. Sonda NLIMI 91.

Hibrida bacterias filamentosas del morfotipo “N. limicola” I y Gram positivas (Liu y Seviour et al.,

2001). Filogenéticamente las bacterias se identifican como Trichococcus sp. dentro del phyllum Firmicutes.

Figura 28. Células individuales de Trichococcus sp. a 600X. Muestra de EDAR Quart Benàger.

A B




4.1.5. Sonda NLIMII 192.

Esta sonda detecta bacterias filamentosas agrupadas dentro del morfotipo “N. limicola” II y que

sean Gram positivas (Liu y Seviour et al., 2001). Filogenéticamente estas bacterias pertenecen al phyllum

Actinobacteria relacionadas con Tetrasphaera japonica.

Figura 29. Tetrasphaera japonica a 600X. Muestra de EDAR Quart Benàger.

4.1.6. Sonda NLIMIII mix.

Esta sonda es un conjunto de tres sondas de detección de bacterias del morfotipo “N.limicola” III

(Liu y Seviour et al., 2001) que son NLIMIII 301, NLIMIII 729 y NLIMIII 830.

Esta sonda hibrida con bacterias Gram positivas. Filogenéticamente estas bacterias pertenecen al

phyllum Planctomycetes y se identifican como Isosphaera sp.

Figura 30. Células individuales y agrupadas de Isosphaera

sp. a 600X. Muestra de EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.




4.2. Cuantificación de las poblaciones del morfotipo “Nostocoida limicola”.

La abundancia de las poblaciones de los morfotipos “N. limicola” analizados se representa en los

siguientes gráficos, en términos de Índice de Filamentos (IF) según el criterio subjetivo de Eikelboom

(2002).

4.2.1. EDAR Cuenca del Carraixet (Línea A+B).

Figura 31. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la línea A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet.

Tetrasphaera japonica está presente prácticamente a lo largo de todo el año, especialmente en los

meses correspondientes a las estaciones de otoño e invierno con un IF de 3.

Con un IF más elevado entre 4 y 5, las bacterias del phyllum Chloroflexi son las más abundantes

(IF = 4-5) en todas las épocas del año, salvo los meses de Julio y Agosto. Puede observarse, sin embargo,

que a partir del 8 de julio de 2009, estos microorganismos no vuelven a estar presentes en la EDAR.

En el caso de “Ca. Monilibacter batavus”, su IF es mayoritariamente de 3, en desde diciembre de

2008 hasta junio de 2009. Por otra parte, desde principios de julio, M. batavus está presente (IF = 0).

Por su parte, las bacterias del género Trichococcus presentan elevada abundancia a lo largo de todo

el año, especialmente en los meses de enero y febrero y con IF de 4 en los meses de primavera.

Finalmente se observa que las dos especies de filamentosas menos abundantes son “Ca.

Alysiosphaera europaea” e Isosphaera sp. y tienden a aparecer de manera muy escasa con un IF de 1.

0

1

2

3

4

5

IF

Abundancia de "Nostocoida limicola" en EDAR Carraixet (Línea A+B)

Alysiosphaera europaea Monilibacter batavus Phyllum Chloroflexi Trichococcus sp. Tetrasphaera japonica Isosphaera sp.




4.2.2. EDAR Cuenca del Carraixet (Línea C+D).

Figura 32. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la línea C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet.

La abundancia de las comunidades de microorganismos filamentosos estudiados en la línea de

agua denominada C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet es muy similar a la observada en la línea de agua

A+B.

Tetrasphaera japonica, “Ca. Monilibacter batavus” y las bacterias del phyllum Chloroflexi, junto con las

del género Trichococcus presentan unos IF de entre 3 a 5, siendo comunes y/o abundantes por las mismas

épocas del año comentada anteriormente. En el caso de Chloroflexi, también ocurre que a partir del mes de

Julio no está presente hasta finales del año 2009. Las bacterias del género Trichococcus muestran gran

dominancia poblacional en los meses Febrero, Marzo y Abril.

“Ca. Alysiosphaera europaea”, apenas tienen un IF de 1, aunque en el caso de la última parece ser

que aunque se muestra poco común, aparece más habitualmente en los meses de Septiembre, Octubre y

Noviembre.

Isosphaera sp. se observa en una muestra del mes de Noviembre.

0

1

2

3

4

5

IF

Abundancia de "Nostocoida limicola" en EDAR Carraixet (Línea C+D)





4.2.3. EDAR Quart Benàger.

Figura 33. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la EDAR Quart Benàger.

En la EDAR de Quart Benàger, Isosphaera sp. es la más abundante de todas las poblaciones

microbianas analizadas. Presenta un índice de filamentos de 5, mayoritariamente desde finales de

Diciembre de 2008 hasta finales de Abril de 2009, comenzando a decrecer hasta desaparecer en los meses

de verano hacia delante.

Tetrasphaera japonica, es muy común (IF = 3 y 4) a lo largo de todo el año muestreado en la EDAR.

Las bacterias del género Trichococcus son también comunes (IF=3) a lo largo del año, aunque en este caso

con índice máximo de 3, y desaparece a partir de Octubre de 2009.

Los microorganismos filamentosos del phyllum Chloroflexi, presentan IF entre 3 y 4, siendo

comunes y/o abundantes desde principios de enero hasta finales del mes de junio de 2009.

Contrariamente a la EDAR Cuenca del Carraixet, “Ca. Alysiosphaera europaea” ha sido

encontrada en todas las muestras analizadas. Presenta una tendencia de crecimiento similar al de T. japonica

con un IF =3.

M. batavus, sin embargo, no aparece en ningún momento (IF = 0).

0

1

2

3

4

5

IF

Abundancia de "Nostocoida limicola" en EDAR Quart Benàger





4.2.4. EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

Figura 34. Abundancia de las poblaciones microbianas del morfotipo “N. limicola” en la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

En este caso “Ca. Alysiosphaera europaea” muestra mayor índice de abundancia en esta EDAR

junto a Trichococcus sp., con IF de 3 y 4, mayoritariamente. Ambas están presentes a lo largo de todo el año.

Tetrasphaera japonica tiene índices muy variados, desde IF=1 hasta IF de 5, en este último caso, en

los mese de Abril y Mayo, y en los meses de Noviembre y Diciembre de 2009.

“Ca. Monilibacter batavus” también está presencia a lo largo de todo el año muestreado, con una

abundancia desde poco común a común (IF de 1 a 3), mayoritariamente.

Isosphaera sp. es poco común (IF=1) entre Febrero y Mayo, aunque en los meses de Diciembre de

2008 y Enero de 2009, muestra mayor abundancia (IF= 3).

En este caso, no hay ninguna bacteria perteneciente al phyllum Chloroflexi.

0

1

2

3

4

5

IF

Abundancia de "Nostocoida limicola" en EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer





4.3. Parámetros físico-químicos y parámetros operacionales.

Las variables utilizadas en el estudio se presentan en los Anexos I y II., donde se indican el

promedio, desviación típica y el mínimo y el máximo (rango) de los valores de las variables físico-químicas

del afluente, de las variables físico-químicas del licor mezcla, y de las variables operacionales de cada una

de las EDAR donde se tomaron las muestras.

4.4. Análisis estadístico.

4.4.1. Análisis bivariante. Aplicación del Coeficiente de Correlación de

Spearman.

Se ha realizado el análisis bivariante aplicando el coeficiente de correlación de Spearman a cada

uno de los grupos de variables presentados en el Anexo I y II y a su vez, para cada una de las EDAR

estudiadas. Finalmente se presenta la correlación de cada grupo de variables ambientales de manera global,

es decir, para las tres EDAR (cuatro líneas de agua) muestreadas.

Se obtuvieron las correlaciones existentes entre las variables físico-químicas y las variables

operacionales (variables ambientales) y las sondas FISH, con las que se identificaron bacterias

filamentosas del morfotipo “Nostocoida limicola” (variables biológicas).

En las tablas siguientes se muestran las etiquetas de las variables ambientales, cuyo significado se

pueden consultar en las tablas 8 y 9. En la tabla 4 se puede consultar la secuencia de la bacteria

formadora de espumas biológicas del morfotipo “N.limicola” a la que corresponde cada una de las sondas

empleadas.

Tabla 11. Coeficientes de correlación de Spearman de las variables físico-químicas del afluente de la EDAR Cuenca del Carraixet (línea de agua A+B) con las sondas FISH empleadas.

CARRAIXET Línea A+B (AFLUENTE)

NLIMI 91 Noli-644 MC2-649 AHW 183 NLIMII 192 NLIMIII mix

%DQOs -.411 ,448* -,465

* -,556

** -,419

* .000

DQO/DBO .108 -.241 .267 .266 .142 -.155

CNT ,532**

-,463* .374 ,595

** -.002 -.096

%N-NH4 -.348 .090 -.191 -.290 -.050 .032

CN-NH4 .406 -.313 .247 ,459* -.060 -.096

CPT ,602**

-,448* ,462

* ,568

** .169 -.096

%P_PO4 _af -.090 -.194 .196 .256 -.091 -.064

CP_PO4 ,614**

-,478* ,469

* ,620

** .176 -.193

DBO5/NKT .228 -.225 .141 .139 -.041 -.155

DBO/PT .015 .097 -.099 .017 -.389 .017

CCARBO ,468* -.313 .376 ,603

** -.058 -.096

Cprote .326 -.388 ,446* ,526

** -.144 -.225

CAGV .284 -.348 .233 .322 .134 -.125

Nivel de significación: ** p < 0.01, * p < 0.05




Las sondas AHW 183 y NLIMI 91 presentan correlación positiva significativa (P<0,01) con las

variables CNT, CPT, CP_PO4, CCARBO (de menor significancia para la sonda NLIMI 91) y con

Cprote. La sonda MC2-649 también presenta relación positiva (P<0,05) con las variables relacionadas con

el fósforo (CPT, CP_PO4) y la de CNT.

NLIMII 192 muestra correlación negativa con el %DQOs, al igual que MC2-649 y AHW 183, en

cuyo último caso, es de mayor significancia negativa (P<0,01)..

Por su parte, a sonda Noli-644 presenta correlaciones contrarias a las anteriores, manteniendo

correlación positiva con %DQOs y correlación negativa con CNT, CPT y CP_PO4.

Tabla 12. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del afluente de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas.

CARRAIXET Línea C+D AFLUENTE


%DQOs -.225 .228 -,562**

-,475* ,512

* .289

DQO/DBO -.206 -.052 .382 .147 .020 .189

CNT .345 -.402 ,658**

,655**

-.396 -.225

%N-NH4 -.132 ,419* -.284 -.290 .222 .096

CN-NH4 .365 -.206 ,542**

,562**

-.286 -.225

CPT .382 -.342 ,662**

,600**

-,460* -.225

%P_PO4 _af .049 -.160 .112 .219 -.237 -.225

CP_PO4 ,430* -.375 ,704

** ,642

** -,515

* -.257

DBO5/NKT ,449* -.032 .041 .213 -.207 -.361

DBO/PT .263 -.049 -.151 .122 .106 -.224

CCARBO .411 -,436* ,512

* ,618

** -.286 -.257

Cprote .190 -.212 ,546**

,665**

-.002 -.289

CAGV .102 -.307 ,447* ,442

* -.073 -.125


Las sondas AHW 183 y MC2-649 presentan las mismas correlaciones positivas que en la línea de

agua A+B, mostrando también correlación positiva con CAGV. Ambas sondas mantienen correlación

negativa con %DQOs, siendo más significativa esta correlación con la sonda MC2-649.

La sonda NLIMII 192 presenta correlación negativa (P<0,05) con %DQOs y correlación positiva

con CPT y CP_PO4. La sonda NLIMI 91, por su parte sólo presenta correlación positiva con CP_PO4 y

DBO5/NKT.

Noli-644 mantiene, en este caso, correlación positiva con %N_NH4, y correlación negativa con

CCARBO (P<0,05).




Tabla 13. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del afluente de la EDAR Quart Benàger con las sondas FISH utilizadas.

QUART BG. AFLUENTE


%DQOs -.133 .007 . .006 -.031 -.196

DQO/DBO -.405 -.006 . -.297 -,561**

-.311

CNT ,423* .302 . ,702

** ,499

* ,807

**

%N-NH4 -.068 -.400 . -.169 .022 -,423*

CN-NH4 ,405* .240 . ,686

** ,554

** ,748

**

CPT .241 .209 . ,687**

,572**

,754**

%P_PO4 _af .080 -.035 . .284 .383 ,420*

CP_PO4 .189 .115 . ,622**

,640**

,728**

DBO5/NKT .313 .261 . ,527* ,591

** .299

DBO/PT .180 .159 . .408 ,574**

.167

CCARBO ,405* .384 . ,699

** .339 ,674

**

Cprote ,446* .155 . ,689

** ,482

* ,639

**

CAGV .076 .298 . ,455* .202 .247


AHW 183 y NLIMII 192 y NLIMIII mix tienen correlación positiva significativa (P<0,01) con

todas las variables referentes a cargas: CNT, CN_NH4, CPT, CP_PO4, CCARBO, Cprote. Las dos

primeras sondas también muestran la misma correlación con DBO5/NKT. La sonda AHW 183 también

tiene correlación positiva (P<0,05) con CAGV. NLIMII 192 presenta además correlación al 99% (p<0,01)

con la relación DBO/PT, y correlación negativa con la relación DQO/DBO. Por su parte, la sonda

NLIMIII mix tiene correlación positiva con %P_PO4, y negativa con %N_NH4 (P<0,05).

En el caso de NLIMI 91 presenta correlación positiva (P<0,05) con CNT, CN_NH4, CCARBO y

Cprote. Noli-644 no presenta ninguna significación con las variables ambientales.

Tabla 14. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del afluente de la EDAR Denia-Ondara-Pedreguer con las sondas FISH utilizadas.

DENIA AFLUENTE


%DQOs -.320 -.141 -.193 . -.095 .395

DQO/DBO -.097 -.323 -.092 . .320 -.282

CNT .099 .066 -.023 . .100 -.148

%N-NH4 -.182 .092 .128 . -.014 -.100

CN-NH4 -.251 .136 .139 . -.121 -.009

CPT .382 -.039 -.167 . .185 -.202

%P_PO4 _af .089 -.014 .400 . .087 -.054

CP_PO4 .149 -.204 .045 . .069 .011

DBO5/NKT -.011 -.176 -.039 . .037 -.108

DBO/PT -.247 .011 ,451* . -.092 -.295

CCARBO .135 ,415* .171 . -.051 .156

Cprote .043 -.085 .227 . .155 -.206

CAGV .231 -.206 -.121 . .165 -.240


MC2-649 tiene correlación positiva con la relación DBO/PT y la sonda Noli-644 con CCARBO.




Tabla 15. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del licor mezcla (LM) de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas.

CARRAIXET (A+B) LICOR MEZCLA


pHLM -.196 .000 .120 .027 -.143 .097

CondLMµS/cm .047 -.060 .379 .314 .330 -.193

SSLM -,540**

.358 -.350 -,467* .292 .225

SSVLM -,571**

.373 -.327 -,463* .326 .257

%SSVLM -.057 .083 .409 .307 .354 -.178

IVF .296 -.164 ,516* ,498

* .117 -.032

NT SSVLM .383 -.388 .378 ,551**

.217 -.096

PT SSVLM ,618**

-,552**

.340 .336 .115 .000


Las sondas AHW 183 y NLIMI 91 tienen correlación negativa con las variables SSLM y SSVLM,

siendo más significativa (P<0,01) en el caso de NLIMI 91. AHW 183 y MC2-649 muestran correlación

positiva con el IVF. AHW183 también tiene un p-valor de 0,01 con la variable NT SSVLM.

Por otro lado, NLIMI 91 mantiene correlación positiva con PT SSVLM, al contrario que Noli-

644, que presenta correlación significativa negativa con esta variable.

Tabla 16. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del licor mezcla (LM) de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas.

CARRAXET (C+D) LICOR MEZCLA


pHLM -.190 .326 -.076 -.064 .410 .354

CondLMµS/cm -.039 -.014 ,628**

,491* -.005 -.129

SSLM -,576**

.250 -.115 -.341 .241 .354

SSVLM -,593**

.219 -.050 -.269 .225 .354

%SSVLM .000 -.199 ,468* ,475

* -.161 -.081

IVF .046 .022 .262 ,443* .173 .064

NT SSVLM .324 -.289 ,495* ,427

* -,473

* -.161

PT SSVLM .411 -.276 .181 .127 -,443* -.032


Las sondas MC2-649 y AHW 183 presentan correlación positiva con la conductividad

(CondLMµS/cm), más significativamente la primera sonda (P<0,01), y con %SSVLM y NT SSVLM. La

sonda AHW 183 muestra también correlación positiva con el IVF.

NLIMI 91 tiene relación negativa significativa (P<0,01) con las variables SSLM y SSVLM.

En el caso de la sonda NLIMII 192 presenta correlación negativa (P<0,05) con NT SSVLM y PT

SSVLM. Noli-644 no presenta ninguna significación.




Tabla 17. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables físico-químicas del licor mezcla (LM) de la EDAR Quart Benàger con las sondas FISH utilizadas.

QUART BG. LICOR MEZCLA


pHLM -.182 -.051 . -.087 -.164 -.258

CondLMµS/cm .355 ,414* . ,645

** .352 ,878

**

SSLM -.230 -.064 . -,460* -.293 -,508

*

SSVLM -.084 .029 . -.379 -.226 -.372

%SSVLM .309 ,426* . .343 ,466

* ,598

**

IVF .391 .189 . ,488* ,614

** ,545

**

NT SSVLM .359 .340 . ,500* .328 ,879

**

PT SSVLM -.046 .037 . -.146 -,551**

-.236


En la EDAR de Quart Benàger destaca la relación significativa positiva (P<0,01) de NLIMIII mix

con las variables CondLMµS/cm, %SSVLM, IVF y NT SSVLM. Esta sonda tiene correlación negativa

con SSLM, al igual que la sonda AHW183. Esta última, presenta también significancia positiva (P<0,01)

con la conductividad (CondLMµS/cm), además de con NT SSVLM.

Noli-644 y NLIMII 192 tienen correlación positiva con %SSVLM, además de correlación positiva

(P<0,05) con CondLMµS/cm y con IVF, respectivamente. Por su parte, NLIMII 192 presenta correlación

negativa significativa con PT SSVLM.


de la EDAR Denia-Ondara-Pedreguer con las sondas FISH utilizadas.

DENIA LICOR MEZCLA


pHLM -.356 -.344 .248 . .087 -.055

CondLMµS/cm .104 .114 .011 . .286 -.115

SSLM .149 -.277 -.263 . .029 .011

SSVLM .379 -.056 -.292 . -.007 .156

%SSVLM ,508* .370 .094 . .115 .242

IVF ,579**

,571**

-.078 . .131 .208

NT SSVLM ,468* ,414

* .137 . .030 .059

PT SSVLM -.351 -.044 .155 . .131 .037


En esta planta depuradora tanto la sonda NLIMI 91 como la sonda Noli-644 presentan

significancia positiva (P<0,01) con la variable IVF, además de correlación positiva con NT SSVLM.

NLIMI 91 tiene también correlación positiva (P<0,05) con %SSVLM.




Tabla 19. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la línea de agua A+B

de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas.

CARRAIXET (A+B) OPERACIONALES


Cmdbo ,662**

-.404 ,514* ,517

* -.006 -.225

Cmdqos ,512* -.368 ,462

* ,533

** -.165 -.323

TRHr .321 -.313 .379 .232 .252 .064

EF -,632**

,538**

-,621**

-,676**

-.276 .097

O_bajo ,485* -.229 .237 .300 .044 -.082

O_medio ,475* -.380 ,443

* ,582

** -.064 -.136

O_alto -,604**

,532**

-,573**

-,680**

.151 .191

Tº r -.213 .187 -.254 -,463* -,456

* -.064


Las sondas AHW 183, MC2-649 y NLIMI 91 comparten correlación positiva significativa con la

variable O_medio. NLIMI 91 también tiene correlación positiva (P<0,05) con O_bajo.

Las tres sondas anteriores también comparten significancia negativa (P<0,01) con las variables

(O_alto) y la edad del fango (EF). AHW 183 presenta, además correlación negativa (P<0,05) con Tºr, al

igual que la sonda NLIMII 192.

Contrariamente a estas tres sondas, Noli-644 muestra significancia positiva (P<0,01) con las

variables O_alto y EF.

Tabla 20. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la línea de agua C+D

de la EDAR Cuenca del Carraixet con las sondas FISH utilizadas.

CARRAIXET (C+D) OPERACIONALES


Cmdbo ,483* -.260 ,476

* ,708

** -.221 -.161

Cmdqos .336 -.211 ,459* ,658

** -.067 -.049

TRHr .089 -.138 .185 .187 -.042 -.161

EF -,462* ,492

* -,660

** -,697

** ,524

* .354

O_bajo ,474* -.203 -.070 .234 -,471

* -.082

O_medio ,464* -.335 .358 ,557

** -.334 -.136

O_alto -,618**

,470* -,444

* -,651

** ,467

* .191

Tº r -.053 .205 -,448* -.305 ,418

* .000


Las sondas NLIMI 91 y AHW 183 tienen correlación positiva con O_medio, siendo dicha

correlación más significativa con la primera sonda. Ambas sondas también muestran correlación negativa

(P<0,05), significativa respecto a la primera sonda (P<0,01), con las variables EF y O_alto.




Como en la línea de agua A+B, la sonda Noli-644 presenta correlación positiva (P<0,05) con las

variables EF y O_alto, al igual que la sonda NLIM II 192, la cual además, tiene correlación positiva con

Tºr, y correlación negativa (P<0,05) con O_bajo.

La sonda MC2-649 también muestra significancia negativa con EF (P<0,01), O_alto y Tºr.

Tabla 21. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la EDAR Quart

Benàger con las sondas FISH utilizadas.

QUART BG. OPERACIONALES


Cmdbo .326 .372 . ,651**

,532**

,789**

Cmdqos .299 .383 . ,634**

,408* ,707

**

TRHr -,414* -.157 . -.344 -.255 -,560

**

EF -.364 -.370 . -,645**

-,478* -,748

**

O_bajo -.078 -.053 . -.339 -.070 -.288

O_medio -.078 -.028 . .106 .029 .089

O_alto ,447* .165 . .304 .005 .346

Tº r .253 .025 . -.283 -.391 -,643**


En la EDAR de Quart Benàger, las sondas NLIMIII mix, AHW 183 y NLIMII 192 muestran

correlación negativa (P<0,05) con EF, además de con TRHr y Tºr en el caso de NLIMIII mix.

Por otro lado, la sonda NLIMI 91 tiene correlación positiva con O_alto y correlación negativa

con TRHr.

Tabla 22. Coeficiente de correlación de Spearman entre las variables operacionales de la EDAR Dénia-

Ondara-Pedreguer con las sondas FISH utilizadas.

DENIA OPERACIONALES NLIMI 91 Noli-644 MC2-649 AHW 183 NLIMII 192 NLIMIII mix

Cmdbo .239 -.147 .079 . .141 -,510*

Cmdqos -.016 -,480* -.183 . .235 -.228

TRHr .082 -.219 -.185 . .225 -.215

EF -.318 .163 .320 . -.362 .275

O_bajo .395 .234 .281 . .257 -.141

O_medio -.105 -.073 -.103 . -,631**

.286

O_alto -.376 -.092 -.291 . .025 .161

Tº r -.356 -.270 -.090 . .182 .354 Nivel de significación: ** p < 0.01, * p < 0.05

NLIMII 192 presenta correlación negativa significativa con O_medio (P<0,01).




Además de explorar el nivel de significación de la relación lineal entre las sondas (variables

respuesta) y las variables ambientales en cada una de las tres depuradoras estudiadas, se ha analizado este

análisis estadístico bivariante de manera global. A continuación, se muestra la tabla con los coeficientes de

correlación de Spearman con todas las depuradoras muestreadas en conjunto.

Tabla 23. Coeficientes de correlación de Spearman entre las variables ambientales de las tres EDAR estudiadas y las variables respuesta (sondas FISH).

EDAR CARRAIXET (ambas líneas) , QUART BG. y DENIA


VA

RIA

BL

ES

FIS

ICO

-QU

ÍMIC

AS

AF

LU

EN

TE

%DQOs -.174 ,573**

-,596**

-,418**

.198 ,439**

DQO/DBO -.093 -,480**

,299**

,267* -.077 -,458

**

CNT ,281**

-,590**

,286**

,751**

.032 -,252*

%N-NH4 -.176 ,467**

-,327**

-,377**

.152 ,207*

CN-NH4 ,247* -,490

** .162 ,727

** .087 -,208

*

CPT ,266* -,653

** ,269

** ,717

** .031 -,327

**

%P_PO4 _af -.025 -,559**

,417**

,325**

-.188 -,364**

CP_PO4 .198 -,705**

,384**

,703**

-.092 -,356**

DBO5/NKT ,209* ,232

* -,245

* .092 ,214

* ,212

*

DBO/PT .057 ,578**

-,252* -,224

* .161 ,394

**

CCARBO ,316**

-,473**

.136 ,756**

.053 -.187

Cprote ,225* -,497

** .137 ,736

** .149 -,228

*

CAGV .174 .110 -.035 ,292**

.186 .126

VA

RIA

BL

ES

F

ÍSIC

O-

QU

ÍMIC

AS

LIC

OR

ME

ZC

LA

pHLM -,228* -.053 .033 .005 .063 -.092

CondLMµm/L .037 ,419**

.200 -.085 .058 ,412**

SSLM -,300**

,505**

-.069 -,675**

-.045 ,281**

SSVLM -,252* ,478

** -.104 -,600

** .027 ,289

**

%SSVLM .185 -,408**

.115 ,617**

.194 -.186

IVF ,256* .186 ,261

* .195 .088 ,346

**

NT SSVLM ,313**

-,450**

.183 ,659**

.067 -.075

PT SSVLM .082 ,362**

.154 -,285**

-.171 .180

VA

RIA

BL

ES

OP

ER

AC

ION

AL

ES

Cmdbo ,394**

-,448**

.182 ,767**

.129 -.160

Cmdqos ,325**

-,256* .000 ,696

** ,204

* -.004

TRHr -.001 ,653**

-.197 -,361**

.161 ,404**

EF -,403**

,487**

-,246* -,786

** -.098 .192

O_bajo .059 ,630**

-.026 -,477**

-.051 ,451**

O_medio .103 ,708**

-,211* -,229

* .068 ,497

**

O_alto -.127 -,678**

.136 ,252* -.047 -,416

**

Tº r .060 .003 -,287**

-.160 .020 -,221*


Las correlaciones de Spearman globales de las variables respuesta son las siguientes:




Variables físico-químicas del afluente.

Noli-644 y NLIMIII mix presentan significación positiva (P<0,01) con las variables %DQOs,

%N_NH4, DBO5/NKT y DBO/PT. Ambas sondas tienen significancia negativa (P<0,01) con la

relación DQO/DBO, CNT, CN_NH4, CPT, %P_PO4af, CP_PO4, CCARBO y Cprote.

Por otro lado, MC2-649 y AHW 183 tienen relación significativa negativa (P<0,01) con las

variables %DQOs, %N_NH4, DBO/PT y, en el caso de la primera sonda también con DBO5/NKT.

Ambas sondas presentan significación positiva con DQO/DBO, CNT, CPT, %P_PO4af y CP_PO4.

Adicionalmente, la sonda AHW 183 tiene significación positiva con CN_NH4, CCARBO, Cprote y

CAGV.

NLIMI 91 muestra correlación positiva con CNT y CCARBO (P<0,01), además de con

CN_NH4, CPT, DBO5/NKT y Cprote (P<0,05). NLIMII 192, sólo presenta correlación positiva con la

variable DBO5/PT.

Variables físico-químicas del licor mezcla.

Noli-644 y NLIMIII mix muestran significación positiva (P<0,01) con las variables del licor

mezcla CondLMµS/cm, SSLM y SSVLM, además de con las variables PT SSVLM y IVF (P<0,05),

respectivamente. Por su parte, Noli-644 también presenta significación negativa con %SSVLM y NT

SSVLM.

En este caso, MC2-649 sólo tiene correlación positiva (P<0,05) con la variable IVF, al igual que la

sonda NLIMI 91, que también la presenta con NT SSVLM de manera significativa (P<0,01). Esta última

sonda tiene correlación negativa (P<0,01) con pHLM, SSLM y, de menor significación (P<0,05), con

SSVLM.

AHW 183 tiene significación positiva (P<0,01) con las variables %SSVLM y NT SSVLM, pero

también presenta relación negativa (P<0,01) con SSLM, SSVLM y con PT SSVLM.

Variables operacionales.

Existe diversidad de correlaciones entre este grupo de variables y las sondas FISH utilizadas. Se

observa que Noli-644 muestra correlación negativa con O_alto (P<0,01), y correlación positiva (P<0,01)

con TRHr, EF, O_bajo y O_medio.

Por otro lado, la sonda AWH 183 muestra las correlaciones contrarias con las variables

operacionales descritas con la sonda Noli-644.

NLIMIII mix tiene correlación positiva (P<0,01) con TRHr, O_bajo y O_medio, además de

significación negativa (P<0,01) con O_alto y Tºr.




MC2-649 se correlaciona negativamente con EF y O_medio (P<0,05), y también con Tºr más

significativamente.

4.4.2. Análisis multivariante. Aplicación del Análisis canónico de Redundancia.

Los gráficos biplot que representan el resultado del análisis canónico de redundancia (RDA), e

presentan, a continuación, en el mismo orden que las tablas del análisis bivariante.

Con los resultados de este análisis se interpretará el comportamiento de los distintos

microorganismos del morfotipo “Nostocoida limicola” (variables respuesta) según su relación con las

variables ambientales estudiadas.

Los resultados se muestran en un diagrama biplot, donde se representan las variables ambientales

(variables explicativas) como vectores, indicando así la dirección en que mejor se sucede el cambio

individual de cada variable biológica. Los ángulos entre dos vectores indican la correlación entre las

variables que representan:

- Ángulo agudo correlación alta positiva.

- Ángulo próximo a 180º correlación negativa.

- Ángulo próximo a 90º no existe apenas correlación (cercano a 0).

La lectura de los puntos que representan las variables biológicas (nombradas con las sondas FISH

con las que fueron identificadas), se realiza proyectando perpendicularmente una línea al vector que

representa una variable ambiental en particular.

Figura 35. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR C. del Carraixet de la línea A+B.

N91Noli644

MC2649

AHW183

N192

MixIII%DQOs

DQO/DBO

CNT

%N-NH4

CN-NH4

CPT

%P_PO4 _af

CP_PO4DBO5/NKT

DBO/PT CCARBO

CproteCAGV

-1.6

-0.8

1E-14

0.8

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

F2 (

19

.87

%)

F1 (69.82 %)

Gráfico RDA Carraixet (A+B) - Afluente(ejes F1 y F2: 89.70 %)

VARIABLES BIOLÓGICAS

VARIABLES AFLUENTE




En la figura 35 las sondas NLIMI 91 (representada como N91), MC2-649 y AWH 183 se

agrupan con la mayoría de los parámetros físico-químicos del agua residual afluente a la línea A+B. De

manera que estas sondas presentan correlación positiva con todas las cargas relacionadas con los

nutrientes del agua de entrada, la relación de biodegradabilidad (DQO/DBO), la relación DBO5/NKT y

con los compuestos orgánicos como las proteínas, hidratos de carbono y los ácidos grasos volátiles. De las

tres, es la sonda AHW 183 la que mayor variabilidad presenta, teniendo además, correlación negativa con

el porcentaje de DQO soluble.

Por otra parte la sonda Noli-644 tiene correlación positiva con el porcentaje de DQO soluble,

pero correlación negativa con CPT y CP_PO4.

NLIMII 192 (representada como N192) presenta relación positiva con CPT, CNT y correlación

negativa con la el porcentaje de DQO soluble y con la relación DBO/PT.

Figura 36. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR C. del Carraixet de la línea C+D.

Las sondas NLIMI 91, MC2-649 y AHW 183 muestran relación lineal con las cargas de

nutrientes y de compuestos orgánicos, sobre todo AHW 183. Todas ellas presentan correlación negativa

con el porcentaje de DQO soluble. NLIMII 91, por su parte, tiene correlación positiva con la relación

DBO5/PT.

Noli-644 presenta relación directa con el porcentaje de nitrógeno amoniacal (%N_NH4) y alta

correlación negativa con la carga de hidratos de carbono (CCARBO).

N91

Noli644

MC2649AHW183

N192

MixIII%DQOs

DQO/DBO

CNT

%N-NH4 CN-NH4

CPT

%P_PO4 _afCP_PO4

DBO5/NKTDBO/PT

CCARBO

Cprote

CAGV

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2

F2 (

13

.47

%)

F1 (73.68 %)

Gráfico RDA Carraixet (C+D) - Afluente(ejes F1 y F2: 87.15 %)


VARIABLES AFLUENTE




En esta línea de agua, también destaca la relación positiva de la sonda NLIMII 192 con el

porcentaje de fósforo (%P_PO4), y algunas de las cargas nutricionales de nitrógeno amoniacal y la DQO

soluble (%DQOs).

Figura 37. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR Quart-Benàger.

NLIMI 91, NLIMII 192 y AHW 183 son las que muestran variabilidad con todos los parámetros

físico-químicos que definen el agua afluente a esta planta. AWH 183 y NLIMIII mix son las que más

variabilidad presentan. Esta última, junto con NLIMI 91 tiene correlación negativa con el porcentaje de

nitrógeno amoniacal entrante.

La sonda MC2-649 no presenta relación con los variables ambientales, ya que permanece

posicionada en el grafico en el promedio de estas variables.

Noli-644 está más próximamente relacionado con la carga de ácidos grasos volátiles, la relación

DBO5/NKT y el porcentaje de DQO soluble entrante.

N91

Noli644

MC2649

AHW183

N192

MixIII

%DQOs

DQO/DBOCNT

%N-NH4

CN-NH4CPT

%P_PO4 _af

CP_PO4DBO5/NKT

DBO/PT

CCARBO

Cprote

CAGV

-1

-0.5

0

0.5

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2

F2 (

12

.51

%)

F1 (75.17 %)

Gráfico RDA Quart Benàger - Afluente(ejes F1 y F2: 87.67 %)


VARIABLES AFLUENTE




Figura 38. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables del afluente de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

AHW 183 permanece centrada en los valores promedio de las variables ambientales, no

manteniendo relación con ninguna de ellas.

Noli-644 y NLIMI 91 muestran correlación positiva con CCARBO.

NLIMII 192 tiene relación directa con las cargas asociadas al fósforo y con las relaciones

DBO5/NKT y DQO/DBO.

La sonda MC2-649 presenta relación positiva con las cargas del nitrógeno (CNT, CN_NH4) y

con los porcentajes de nitrógeno amoniacal y el de DQO soluble.

N91

Noli644

MC2649

AHW183N192

MixIII

%DQOs

DQO/DBO

CNT%N-NH4

CN-NH4

CPT

%P_PO4 _af

CP_PO4

DBO5/NKT

DBO/PT

CCARBO

Cprote

CAGV

-1

-0.5

0

0.5

1

-1 -0.5 0 0.5 1 1.5

F2 (

27

.27

%)

F1 (43.89 %)

Gráfico RDA Denia - Afluente(ejes F1 y F2: 71.16 %)


VARIABLES AFLUENTE




Figura 39. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet.

La sonda AHW 183 presenta gran variabilidad con las variables del licor mezcla, estando

correlacionada negativamente con los sólidos suspendidos y los sólidos suspendidos volátiles (SSLM y

SSVLM). Esta correlación negativa también la presenta la sonda NLIMI 91, que muestra relación positiva

con el parámetro PT SSVLM.

Por otra parte, la sonda Noli-644 tiene correlación negativa con PT SSVLM y la sonda MC2-549

presenta correlación positiva con el IVF y NT SSVLM.

NLIMII 192 muestra correlación positiva con el porcentaje de SSVLM y la conductividad, además

de correlación negativa con el pH.

NLIMII mix permanece entre los valores promedio de las variables ambientales del licor mezcla.

N91Noli644

MC2649

AHW183

N192

MixIII

pHLM

CondLMµS/cm

SSLM

SSVLM%SSVLM

IVF

NT SSVLM

PT SSVLM

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2

F2 (

14

.76

%)

F1 (79.08 %)

Gráfico RDA Carraixet (A+B) -- Licor Mezcla(ejes F1 y F2: 93.83 %)


V. LICOR MEZCLA




Figura 40. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet.

La sonda AHW 183 muestra gran variabilidad con los parámetros NT SSVLM, CondLMµS/cm,

pH, IVF y con (%SSVLM). MC2-649 presenta las mismas correlaciones.

Noli-644 presenta relación negativa con PT SSVLM, al contrario que NLIMI 91, la cual muestra

correlación negativa con SSLM y SSVLM.

Por su parte, NLIMII 192 tiene correlación negativa con el nitrógeno y fósforo totales (NT

SSVLM y PT SSVLM.

Figura 41. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la EDAR Quart Benàger.

N91

Noli644

MC2649

AHW183N192 MixIII

pHLM

CondLMµS/cm

SSLM

SSVLM

%SSVLM

IVF

NT SSVLM

PT SSVLM

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2

F2 (

18

.35

%)

F1 (71.08 %)

Gráfico RDA Carraixet (C+D) - Licor Mezcla(ejes F1 y F2: 89.44 %)


V. LICOR MEZCLA

N91

Noli644

MC2649

AHW183

N192

MixIII

pHLM CondLMµS/cm

SSLM SSVLM %SSVLM

IVF

NT SSVLM

PT SSVLM

-1

-0.5

0

0.5

1

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2

F2 (

8.8

9 %

)

F1 (85.04 %)

Gráfico RDA Quart Benàger - Licor mezcla (ejes F1 y F2: 93.93 %)


V. LICOR MEZCLA




La sonda NLIMIII mix presenta variabilidad con la conductividad, %SSVLM, IVF y con

nitrógeno total del licor mezcla (NT SSVLM).

Noli-644 y NLIMI 91 tienen correlación negativa con SSLM, PT SSVLM y relación directa con

% SSVLM.

AHW 183 y NLIMII 192 tiene mayor variabilidad positiva con las variables IVF y % SSVLM.

Figura 42. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables del licor mezcla de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

NLIMII 192 presenta variabilidad con la mayoría de los parámetros físico-químicos del licor

mezcla.

Noli-644 tiene correlación positiva con NT SSVLM y con IVF, pero correlación negativa con el

pH y PT SSVLM, al igual que la sonda NLIMI 91, que también muestra relación positiva con NT SSVLM.

MC2-649 también está correlacionada positivamente con NT SSVLM y con IVF, y negativamente

con la conductividad.

N91

Noli644MC2649AHW183

N192

MixIIIpHLM

CondLMµS/cmSSLM SSVLM %SSVLM

IVF

NT SSVLM

PT SSVLM

-1

-0.5

0

0.5

1

-1 -0.5 0 0.5 1 1.5

F2 (

28

.59

%)

F1 (46.16 %)

Gráfico RDA Denia - Licor Mezcla(ejes F1 y F2: 74.75 %)


V. LICOR MEZCLA




Figura 43. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables operacionales de la línea de agua A+B, de la EDAR Cuenca del Carraixet.

NLIMI 91, AHW 183 y MC2-649 presentan correlación positiva con la variables de oxígeno

disuelto medio y bajo (O_medio y O_bajo). Por otro lado, las tres sondas muestran relación negativa con

la edad del fango (EF) y con el oxígeno disuelto alto (O_alto). AHW 183 también se correlaciona

negativamente con la temperatura del reactor biológico (Tºr), al igual que la sonda NLIMII 192.

Noli-644, por su parte está relacionada positivamente con el oxígeno disuelto alto y con la edad

del fango, al igual que NLIMIII mix, aunque esta sonda con menor variabilidad.

Figura 44. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables operacionales de la línea de agua C+D, de la EDAR Cuenca del Carraixet.

N91

Noli644 MC2649 AHW183

N192

MixIII

Cmdbo

Cmdqos

TRHr

EF

O_bajo

O_medio

O_alto

Tº r

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

F2 (

12

.79

%)

F1 (81.69 %)

Gráfico RDACarraixet (A+B) - V. Operacionales(ejes F1 y F2: 94.48 %)


V. OPERACIONALES

N91

Noli644 MC2649 AHW183N192

MixIII

CmdboCmdqosTRHr

EF

O_bajoO_medio

O_alto

Tº r

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

-2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

F2 (

15

.04

%)

F1 (73.71 %)

Gráfico RDA Carraixet (C+D) - V. Operacionales(ejes F1 y F2: 88.75 %)


V. LICOR MEZCLA




NLIMIII mix muestra relación positiva con la temperatura del reactor y el tiempo de retención

hidráulico (TRHr) del reactor.

Noli-644 y NLIMII 192 presentan correlación positiva con EF y con O_alto. La segunda sonda

también presenta relación negativa con la variable del oxígeno disuelto bajo.

AHW 183, NLIMI91 y MC2-649 se correlacionan negativamente con la temperatura del reactor y

la edad del fango.

Figura 45. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables operacionales de la EDAR Quart Benàger.

NLIMIII mix es la sonda con mayor variabilidad respecto a los parámetros operacionales

descritos para esta EDAR, presentando correlación negativa con la edad del fango (EF), TRHr y Tºr.

AHW 183 y NLIMII 192 muestran correlaciones positivas con las variables de carga másica, pero

sólo tienen relación negativa con EF.

NLIMI 91 está correlacionada negativamente con el THRr y Noli-644 presenta relación positiva

con la variable O_medio.

N91Noli644

MC2649

AHW183

N192

MixIII

Cmdbo

Cmdqos

TRHr

EF

O_bajo

O_medio

O_alto

Tº r

-1

-0.5

0

0.5

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

F2 (

10

.99

%)

F1 (77.05 %)

Gráfico RDA Quart - Benàger - V. Operacionales(ejes F1 y F2: 88.04 %)


V. OPERACIONALES




Figura 46. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables operacionales de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

NLIMII 192 muestra relación positiva con las variables de carga másica, pero correlación negativa

con O_medio. MC2 649 tiene correlación positiva con O_bajo y negativa con O_alto.

NLIMI 91 tiene correlación negativa con EF, relacionándose positivamente con O_bajo y con Tªr

NLIMIII mix y Noli-644 están relacionadas con O_medio positivamente.

De manera global, con el análisis canónico de redundancia se observan los siguientes resultados:

Figura 47. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida

limicola” (sondas FISH) y las variables físico-químicas del afluente.

N91

Noli644

MC2649

AHW183 N192MixIII

Cmdbo

Cmdqos

TRHrEF

O_bajo

O_medio

O_alto

Tº r

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

F2 (

35

.24

%)

F1 (49.64 %)

Gráfico RDA Denia-Ondara - V. Operacionales(ejes F1 y F2: 84.88 %)

VARIABLES …V. OPERACIONALES

N91Noli644

MC2649

AHW183

N192

MixIII

%DQOs

DQO/DBO

CNT%N-NH4

CN-NH4CPT

%P_PO4 _af

CP_PO4

DBO5/NKT

DBO/PT CCARBOCprote

CAGV

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2

F2 (

23

,28

%)

F1 (63,17 %)

Gráfico RDA - Afluente(ejes F1 y F2: 86,45 %)


VARIABLES AFLUENTE




Los resultados del análisis RDA muestran por un lado, que la sonda AHW 183 tiene relación

positiva con las variables relacionadas con las cargas de nutrientes (nitrógeno y fósforo) y las cargas de

compuestos orgánicos (hidratos de carbono y proteínas). La sonda MC2-649 está más relacionada

positivamente con %P_PO4 y la relación DQO/DBO. Ambas sondas presentan correlación negativa con

el porcentaje de DQO soluble (%DQOs).

NLIMI 91 presenta relaciones semejantes a las de AHW 183, pero con menor grado de

variabilidad.

Noli-644 se relaciona positivamente con %DQOs, pero de manera negativa con las cargas de

nutrientes CPT y CNT, además de con la relación de biodegradabilidad (DQO/DBO).

NLIMIII mix asemeja sus correlaciones a las de la sonda NLIMI 91, pero con menor variabilidad

que ésta última.

La sonda NLIMII 192 está relacionada directa y positivamente con la relación DBO/PT.

Figura 48. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables físico-químicas del licor mezcla.

Las sondas MC2-649 y NLIMI 91 muestran correlación positiva con NT SSVLM y % SSVLM.

NLIMI 91 también presenta correlación negativa con la variable pHLM.

NLIMIII mix se relaciona positivamente con las mismas variables que NLIMI, pero además con

IVF, al igual que la sonda NLIMII 192.

La sonda Noli-644 tiene relación positiva con la conductividad y PT SSVLM, estando

negativamente relacionada con %SSVLM.

N91

Noli644

MC2649

AHW183N192

MixIII

pHLM

CondLMµS/cm

SSLM

SSVLM

%SSVLM

IVF

NT SSVLM

PT SSVLM

-0.5

0

0.5

1

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

F2 (

20

,47

%)

F1 (64,91 %)

Gráfico RDA - Licor Mezcla(ejes F1 y F2: 85,38 %)


V. LICOR MEZCLA




Figura 49. Gráfico de Análisis canónico de Redundancia entre microorganismos “Nostocoida limicola” (sondas FISH) y las variables operacionales de las tres estudiadas.

Las sondas Noli-644 y NLIMIII mix se relacionan positivamente con las variables TRHr, O_bajo

y O_medio, y tienen correlación negativa con O_alto.

La sonda MC2-649 muestra correlación positiva con O_alto.

AHW 183, sin embargo, que presenta mayor variabilidad con la mayoría de los parámetros

operacionales, muestra relación negativa con niveles de oxígeno bajo y medio, además de con la EF y con

TRHr.

NLIMII 192 muestra correlación negativa con EF, la temperatura del reactor (Tºr) y con el

parámetro O_alto.

NLIMI 91 está positivamente relacionada con las cargas másicas de la DBO y la DQO soluble, al

igual que la sonda AHW 183. Esta última también tiene correlación positiva con O_alto.

N91

Noli644

MC2649

AHW183

N192

MixIII

Cmdbo

CmdqosTRHr

EF

O_bajo

O_medio

O_alto

Tº r

-1

-0.5

0

0.5

1

-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2

F2 (

25

,62

%)

F1 (57,84 %)

Gráfico RDA - Operacionales(ejes F1 y F2: 83,46 %)


V. OPERACIONALES




5. DISCUSIÓN.

La mayoría de EDAR convencionales de eliminación de carbono sufren, esporádicamente, serios

problemas de separación de los sólidos que conforman el fango activo, tales como el bulking y el foaming.

Esta problemática también surge en sistemas con procesos de eliminación biológica de nutrientes (BNR)

tales como el nitrógeno y el fósforo. En definitiva, todas las EDAR, tanto de aguas residuales domésticas

como de tipo industrial (Eikelboom 2000, 2006), son susceptibles de sufrir estos problemas de separación

de sólidos, causados por abundantes bacterias filamentosas.

Los microorganismos del morfotipo “Nostocoida limicola” (Seviour y Blackall, 1999), se han

encontrado de forma abundante en Australia, Italia y la República Checa. En la EDAR de la Comunidad

Valenciana estudiadas en este proyecto aparecen con frecuencia, si bien no lo hacen como especie

dominante: EDAR Cuenca del Carraixet, EDAR Quart-Benàger y EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

Identificación del morfotipo “Nostocoida limicola” con la técnica FISH.

Muy pocos de los morfotipos filamentosos formadores de espumas biológicas, pueden ser

identificados realmente basándose sólo por sus características morfológicas. En estudios iniciales este era

el tipo de identificación utilizado y determinado mediante métodos convencionales dependientes de

cultivo, junto a la microscopía óptica. Gran parte de los microorganismos que componen los fangos

activos son, en general, difíciles de cultivar en medios artificiales, y no se puede obtener información de

sus requerimientos nutricionales.

Un ejemplo claro de esto es el que representa el morfotipo “Nostocoida limicola”, que desde los

primeros estudios ha sido presentado como un morfotipo filamentoso constituido por tres grupos

diferenciados morfológicamente: grupos I, II y III. En realidad los microorganismos de estos grupos, no

tienen relación filogenética y, además, presentan diferencias fisiológicas (Liu y Seviour et al., 2001;

Kragelund et al., 2006).

Como se ha observado en este estudio al obtener señales de los filamentos con la morfología de

“N. limicola” que han hibridado con sondas de diferentes grupos filogenéticos (técnica FISH), se han

identificado células individuales con forma de cocos pertenecientes al género Trichococcus del phylum

Firmicutes que además, pueden agruparse en cadenas cortas en forma de filamentos, como ha descrito otros

autores (Liu y Seviour 2001). La presencia de células individualizadas o en formar de filamentos del género

Isosphaera del phylum Planctomycetes también se ha observado en algunas de las muestras.




Abundancia del morfotipo “Nostocoida limicola” en las tres EDAR de la

Comunidad Valenciana analizadas.

Los resultados obtenidos tras utilizar el criterio subjetivo de Eikelboom (2002), para la

cuantificación de la abundancia de microorganismos (apartado 4.2.), revelan que las bacterias del phylum

Chloroflexi, “Candidatus Monilibacter batavus” y “Candidatus Alysiosphaera europaea” (clase α-Proteobacteria)

y Tetrasphaera japonica (phylum Actinibacteria), todas ellas dentro del grupo “Nostocoida limicola” II, y

Trichococcus sp. del phylum Firmicutes (grupo “N.limicola” I), son las más abundantes en los fangos activos de

las tres depuradoras estudiadas. Todas ellas son prácticamente dominantes en los meses de invierno y

primavera, principalmente. Se consideran comunes dentro de las comunidades microbianas del fango

activo (Seviour et al., 2000; Beer et al., 2002; Bjornsson et al., 2002; Nielses y Kragelund, 2009).

El grupo “N.limicola” II (Blackall y Seviour, 2006) ha mostrado ser es el más versátil, en lo que

respecta a la dominancia en las tres EDAR estudiadas. Está constituido por cuatro bacterias distintas,

dentro de tres grupos filogenéticos: clase α- Proteobacteria, phylum Chloroflexi y phylum Actinobacteria. Los

resultados de estudio muestran que una o dos de estas especies puede dominar sobre las otras, según la

época de año.

Sin embargo, también se observa que “Candidatus Monilibacter batavus” (α-Proteobacterias) no

está presente en ningún momento en la depuradora de Quart Benàger. Isosphaera sp. (phylum

Planctomycetes, y del grupo “N.limicola” III), y “Candidatus Alysiosphaera europaea” (α– Proteobacterias, y

del grupo “N.limilcola” II), no están casi presentes (IF=1) en ninguna de las líneas de agua (A+B o C+D)

de la EDAR Cuenca del Carraixet. Por su parte, las bacterias del phylum Chloroflexi tampoco se encuentran

en la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

Ecofisiología de las poblaciones “Nostocoida limicola”.

Aunque la técnica FISH combinada con la microautoradiografía (MAR) es el método más

empleado actualmente para explicar la fisiología in situ y, por tanto, el comportamiento poblacional de

microorganismos filamentosos, sigue siendo bastante difícil generalizar con los factores que afectan al

crecimiento de estos microorganismos. Esto es más complicado si además no se trata de un

microorganismo diferenciado en tres grupos por su morfología celular, como es el caso del morfotipo

“Nostocoida limicola”, sino que se trata de un conjunto variado de microorganismos, pertenecientes a cinco

phyla distintos (Levantesi et al., 2004; Kragelund et al., 2006): clase Alfaproteobacteria, phylum Chloroflexi,

phylum Actinobacteria, phylum Firmicutes y phylum Planctomycetes.




Hasta ahora, es poca la información sobre la ecofisiología de estas bacterias, pero sí existe la

suficiente para determinar que las herramientas de control a aplicar sobre las bacterias filamentosas,

asociadas a los problemas de bulking y foaming de los fangos activos, no son universales.

Las variables físico-químicas del afluente y del licor mezcla, junto a las variables operacionales,

muestran su influencia sobre la dinámica poblacional de las bacterias del morfotipo “N.limicola”. Cada una

de ellas presenta cierta versatilidad en crecimiento y metabolismo. Esto es indicativo de que los factores

fisiológicos que determinan la presencia, aumento o disminución de las poblaciones estudiadas, no pueden

ser generales para estas bacterias.

- Variables físico-químicas del afluente.

De todas las variables analizadas en este proyecto, las que se definen como carga han mostrado

ser más significativas respecto al crecimiento de las bacterias.

En los gráficos RDA resultantes del análisis estadístico de la EDAR Cuenca del Carraixet se

observa que “Ca. Monilibacter batavus” y “Ca. Alysiosphaera europaea” (Levantesi et al., 2004) presentan

preferencias nutricionales distintas. Pese a que ambas son de la clase Alfaproteobacteria, M. batavus (sonda

MC2-649) aumenta cuanto mayor es la carga de proteínas y de nitrógeno y fósforo totales, mientras que

disminuye en presencia de altos porcentajes de DQO soluble. A. europaea (sonda Noli-644) muestra una

tendencia totalmente contraria con respecto a las misma variables mencionadas. Estudios previos

realizados sobre las Alfaproteobacterias (Kragelund et al., 2005, 2006) señalan que M. batavus tiene

preferencia sobre los ácidos grasos volátiles de cadena corta (AGV), mientras que A. europaea consume

preferentemente hidratos de carbono y aminoácidos, y AGV con menor preferencia.

En la EDAR de Dénia-Ondara-Pedreguer, los datos de las variables ambientales mencionadas son

de rango más bajo que las de la EDAR Cuenca del Carraixet, por lo que no parecen ejercer significativa

influencia sobre los microorganismos formadores de espumas. Bien es cierto que en el gráfico RDA de

esta planta, A. europaea está próxima a la variable de hidratos de carbono, lo que confirma los datos de

Kragelund et al. (2005, 2006) sobre la utilización de hidratos de carbono por esta especie. M. batavus por el

contrario, está negativamente relacionado con los AGV.

Las bacterias del phylum Chloroflexi suelen ser miembros comunes (Beer et al., 2002; Bjornsson et

al, 2002) de la comunidad microbiana del fango activo, asociadas a episodios de bulking (Schade et al.,

2002). Se suelen encontrar, especialmente, en plantas con eliminación biológica de fósforo (Bjornsson et al,

2002; Speirs et al., 2009). Estos microorganismos son fundamentalmente activos bajo condiciones

aerobias, asimilando azúcares principalmente (Nielsen et al., 2002; Thomsen et al., 2002 y Kragelund et al.,




2006). Esto es sostenido en estudios donde se ha observado expresión de exoenzimas como por ejemplo,

actividades quitinasa y galactosidasa (Kragelund et al., 2007a).

En los resultados obtenidos a través de los gráficos biplot del análisis de redundancia (RDA), para

las EDAR Cuenca del Carraixet y Quart Benáger, se observa que las bacterias filamentosas del phylum

Chloroflexi (sonda AHW 183) están altamente correlacionadas con las variables de carga de hidratos de

carbono, proteínas, e incluso con los ácidos grasos volátiles. Este último sustrato también es

frecuentemente utilizado por algunas bacterias de este phylum (Kragelund y Nielsen, 2009).

Existen evidencias de que estos tres microorganismos nombrados, de la clase Alfaproteobacteria y

del phylum Chloroflexi, tienen la capacidad de almacenar biopolímeros de reserva en forma de gránulos de

polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de diversos sustratos y con aceptores electrónicos distintos (Nielsen

et al., 2002; Kragelund y Nielsen, 2009).

Tetrasphaera japonica (sonda NLIMII 192) del phylum Actinobacteria (Maszenan et al, 2000; Mckenzie

et al., 2006), suele ser poco abundante (Wanner et al., 1994), además de ocasional o poco recurrente en los

fangos activos. Los gráficos de abundancia de las EDAR de la Comunidad Valenciana analizadas en este

proyecto muestran que estos microorganismos se presentan con altos índices de filamentos (IF = 3-5).

Hasta ahora no existen observaciones ni evidencias para creer que los microorganismos de este género

puedan causar problemas de espumas (Kragelund y Kong, 2006).

Ciertas evidencias sugieren la posibilidad de que T. japonica sea capaz de acumular polifosfato

(Blackall et al., 2000; Liu et al., 2001). Los resultados estadísticos de este proyecto muestran que este

microorganismo está asociado negativamente con las cargas de fósforo total y ortofosfatos y, sin embargo,

en la EDAR de Dénia-Ondara-Pedreguer tiene relación positiva elevada con estas variables. Esto sucede

posiblemente porque al tener capacidad de almacenar gránulos de polifosfato, no requiera elevadas cargas

de fósforo en el afluente, las cuales sí son elevadas en la EDAR de Quart Benàger y Cuenca del Carraixet,

pero no en la primera.

Por otra parte, las bacterias del género Trichococcus (phylum Firmicutes) agrupadas como “Nostocoida

limicola” I son observadas de manera más ocasional (Eikelboom y Geurkink, 2002), aunque cuando

aparecen son muy abundantes dentro del fango activo. Estudios recientes sobre actividades fermentativas

dentro del fango activo revelan que Trichococcus sp. es frecuente en EDAR con eliminación de fósforo

(Trebesius et al., 2000) y utiliza azúcares como la glucosa tanto en condiciones aerobias como en

condiciones anaerobias (fermentación), pero no tienen capacidad para consumir acetato (Kong et al, 2008).

En los resultados del RDA realizados, se observa que Trichococcus sp tiene significación positiva con las

variables de carga de ortofosfatos y del fósforo. Además suele estar muy relacionado también con los

hidratos de carbono.




Por último, la fisiología del morfotipo filamentoso “N. limicola” III, que corresponde al género

Isosphaera (sonda NLIMIII mix) del phylum Planctomycetes (Liu et al., 2001), es desconocida. Los primeros

datos son los que se refieren a este estudio, donde Isosphaera sp. es común a lo largo de todos el año

muestreado en las EDAR de Quart Benàger y Dénia-Ondara-Pedreguer, siendo muy abundante, si no

dominante, en la EDAR de Quart Benàger. Este género queda ligado a los parámetros analizados relativos

al fósforo, estando también relacionado con los hidratos de carbono y las proteínas.

- Variables físico-químicas del licor mezcla.

No existen referencias bibliográficas a las que remitirse, en el caso de la relación de este grupo de

variables con el morfotipo “Nostocoida limicola”, analizado con la técnica FISH. Los resultados más

destacados, tras proceder con el análisis estadístico, muestran que el phylum Chloroflexi, M. batavus, A.

europaea y T. japonica, (especies del grupo morfológico de “N. limicola” II) están positiva y significativamente

relacionadas con IVF, lo que se correspondería con la capacidad de estos microorganismos de originar

episodios de bulking y/o foaming (Eikelboom et al., 2006).

La conductividad con rangos entre 1100 y 3000 µS/cm puso de manifiesto su relación

significativa positiva con todas las bacterias del morfotipo “N. limicola” de los phyla Chloroflexi, Proteobacteria

y Actinobacteria. Por lo que estos microorganismos filamentosos están presentes en un amplio rango de

conductividad.

Tanto las bacterias de los géneros Trichococcus e Isosphaera, así como M. batavus y el phylum

Chloroflexi están asociadas con bajas concentraciones de sólidos totales del licor mezcla y tienen relación

positiva con el porcentaje de SSV, al igual que A. europaea en este último caso.

Como dato fisiológico destacable respecto a Trichococcus sp. y. A. europaea se observa que

Trichococcus sp. está asociada positivamente con el fósforo total en el licor mezcla, mientras que A. europaea

tiene relación negativa con este parámetro en todas las EDAR muestreadas, independientemente del rango

de PTSSVLM en cada depuradora.

Por otro lado, el pH no ha mostrado ser representativo en el crecimiento poblacional de ninguno

de los microorganismos del morfotipo “N. limicola”, posiblemente porque existe poca variación en el

rango de este parámetro en todas las EDAR estudiadas.




- Variables operacionales.

El oxígeno disuelto es uno de los parámetros operacionales más influyentes en el comportamiento

poblacional de las bacterias “Nostocoida limicola”. Para la mayoría de estos microorganismos, con la

excepción de A. europaea, condiciones de oxígeno por encima de 2 mg/L, supone un problema para su

crecimiento. De hecho, M. batavus, Trichococcus sp. y el phylum Chloroflexi muestran estar relacionados

positivamente con valores de oxígeno disuelto entre 0,8 y 2 mg/L.

Estos resultados estadísticos concuerdan con estudios previos (Kragelund et al., 2005, 2006) que

confirman que, hasta ahora, las especies agrupadas como “N. limicola” son preferentemente aerobias,

aunque también son capaces de asimilar sustrato utilizando nitrato o nitrito como aceptor terminal de

electrones (Blackall y Seviour, 2000; Liu et al, 2001), aunque el hecho de que sean capaces de desnitrificar

no está claro todavía (Kragelund et al., 2006).

Por otro parte, todos los microorganismos “N. limicola” estudiados están relacionados con valores

bajos de edad del fango (Kragelund y Kong, 2006). En los gráficos RDA se observa su relación negativa

con este parámetro operacional de manera significativa.

Los gráficos RDA muestran la significativa asociación del morfotipo “Nostocoida limicola” con

valores de temperatura entre 15 y 25ºC generalmente, en las tres EDAR analizadas, lo que coincide con la

referencia de otros autores (Eikelboom et al, 2006), en que son más comunes en los meses de invierno y

primavera. Algunas de estas bacterias filamentosas estudiadas como Tetrasphaera japonica y el género

Trichococcus están presentes en los meses de julio y agosto, lo que corrobora otros estudios sobre la

presencia de estas bacterias a temperaturas próximas a 35ºC (Blackall et al, 1999; McKenzie et al., 2006) y

(Liu et al., 2002), respectivamente.

Globalmente, las tendencias observadas en las poblaciones del morfotipo “N. limicola” presentan

ciertas variaciones con respecto a las observadas por separado, aunque no significativamente distintas.

Esto es porque los rangos de las variables en cada depuradora son particulares y, en consecuencia,

diferentes.




6. CONCLUSIONES.

1. El grupo morfológico dominante en las EDAR de la Comunidad Valenciana estudiadas en este

proyecto ha sido “N. limicola” II con la presencia de bacterias filamentosas en diferentes phyla

(Chloroflexi y Alfaproteobacteria).

2. La mayoría de las especies estudiadas del morfotipo “N .limicola” tienen preferencia por los hidratos de

carbono y los ácidos grasos volátiles de cadena corta, además de por las proteínas. También requieren

condiciones de oxígeno no superiores a 2 mg/L, bajas edades del fango y temperaturas entre

15 y 25ºC aproximadamente.

3. Las bacterias filamentosas de la clase Alfaproteobacteria estudiadas, “Ca. Monilibacter batavus” y “Ca.

Alysiosphaera europaea” (morfotipo “N. limicola” II), asimilan una variedad de sustratos

orgánicos en condiciones aerobias, que son marcadamente reducidos bajo condiciones anóxicas. Pese a

pertenecer al mismo grupo filogenético presentan preferencias nutricionales opuestas.

4. Tetrasphaera japonica., del phylum Actinobacteria (morfotipo “N. limicola” II) y Trichococcus sp. del

phylum Firmicutes (morfotipo “N. limicola” I), están presentes a lo largo de todo el año muestreado en

la EDAR de Quart Benàger. Estas bacterias se relacionan con valores altos de fósforo total y

ortofosfatos, SSV e hidratos de carbono, y con temperaturas entre 25 y 35ºC.

5. El género Isosphaera sp., del phylum Planctomycetes y perteneciente al morfotipo “N. limicola” III, es

común durante todo el año muestreado en las EDAR de Quart Benàger y Dénia-Ondara-

Pedreguer, siendo abundante en la primera EDAR. Está relacionado con altos contenidos en fósforo

total, ortofosfatos y sólidos suspendidos (totales y volátiles). Este género puede crecer en condiciones

de oxígeno disuelto en el rango de 0,8 - 2 mg/L y a temperaturas superiores a 25ºC.

6. Se ha observado que Trichococcus sp. e Isosphaera sp. se presentan en forma filamentosa y en

agrupaciones de células individualizadas.

7. El morfotipo “Nostocoida limicola” clasificado con los métodos convencionales como I, II y III, no

permite una adecuada identificación de las bacterias filamentosas que lo constituyen y que pueden

pertenecer a diferentes phyla, por lo que se deben emplear técnicas moleculares para su

identificación y estudio de su ecología en EDAR a escala real.

8. El morfotipo “N.limicola” está constituido por microorganismos filamentosos e individuales de diversa

identidad filogenética y variedad fisiológica, lo cual hace difícil aplicar métodos concretos para el

control de las bacterias asociadas a los problemas de foaming y/o bulking en los sistemas de fangos

activos.




7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

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8. ANEXOS.

ANEXO I. Valores promedio, rango y desviación estándar de los parámetros* físico –

químicos y operacionales analizados por cada una de las EDAR estudiadas.

*Todos los parámetros analizados están nombrados según las etiquetas utilizadas durante el estudio (véase Tablas 8 y 9).

Tabla 24. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos asociados al afluente de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet.

Tabla 25. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos asociados al afluente de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet.

AFLUENTE (CARRAIXET C+D) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar

%DQOs % 31 15 - 42 8

DQO/DBO - 2.10 0 - 3.46 0.63

CNT kg N/kg SSVLM·d 0.12 0.04 - 0.19 0.05

%N-NH4 % 56 35 - 87 14

CN-NH4 mg/L 0.06 0.01 - 0.10 0.02

CPT kg N/kg SSVLM·d 15.23 3.78 -30.19 7.00

%P-PO4 % 76 59 - 92 9

CP-PO4 Kg P-PO4/kg

SSVLM·d 11.43 2.22 - 19.31 4.84

DBO5/NKT gDBO5/gNKT 2.98 0 . 5.37 0.94

DBO/PT mg/L 23.37 0 - 41.13 7.73

CCARBO kg /kg SSVLM·d 16.75 4.07 - 59.71 11.65

Cprote kg /kg SSVLM·d 94.78 18.38 - 154.21 37.58

CAGV kg /kg SSVLM·d 8.63 0 - 108.91 23.70

AFLUENTE (CARRAIXET A+B) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar

%DQOs % 31 15 – 42 8

DQO/DBO - 2.10 0 - 3.46 0.63

CNT kg N/kg SSVLM·d 0.12 0.04 - 0.19 0.05

%N-NH4 % 56 35 – 87 14

CN-NH4 mg/L 0.06 0.01 - 0.10 0.02

CPT kg N/kg SSVLM·d 15.20 3.77 - 30.12 6.98

%P-PO4 % 76 59 – 92 9

CP-PO4 Kg P-PO4/kg

SSVLM·d 11.40 2.21 - 19.27 4.82

DBO5/NKT gDBO5/gNKT 2.98 0 - 5.37 0.94

DBO/PT mg/L 23.37 0 - 41.13 7.73



CAGV kg /kg SSVLM·d 8.61 0 - 108.56 23.64




Tabla 26. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos asociados al afluente de la EDAR Quart Benàger.

AFLUENTE (QUART BENÀGER) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar

%DQOs % 49 37 - 61 5

DQO/DBO - 1.60 0 - 2.33 0.53

CNT kg N/kg SSVLM·d 0.05 0.03 - 0.10 0.02

%N-NH4 % 76 66 - 88 6

CN-NH4 mg/L 0.04 0.02 - 0.08 0.01

CPT kg N/kg SSVLM·d 4.92 2.23 - 8.99 1.98

%P-PO4 % 45 0 - 81 15

CP-PO4 Kg P-PO4/kg SSVLM·d 2.28 0 - 5.37 1.32

DBO5/NKT gDBO5/gNKT 4.23 0 - 7.93 1.68

DBO/PT mg/L 44.69 0 - 97.87 19.40



CAGV kg /kg SSVLM·d 31.32 0 - 297.20 62.44

Tabla 27. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos asociados al afluente de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

AFLUENTE (DENIA-ONDARA) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar

%DQOs % 37 23 - 58 8

DQO/DBO - 1.89 1.38 - 2.26 0.28

CNT kg N/kg SSVLM·d 0.04 0.02 - 0.06 0.01

%N-NH4 % 63 0 - 94 23

CN-NH4 mg/L 0.02 0 - 0.03 0.01

CPT kg N/kg SSVLM·d 3.46 0.69 - 5.96 1.12

%P-PO4 % 47 0 - 93 33


DBO5/NKT gDBO5/gNKT 3.13 1.15 - 6.61 1.21

DBO/PT mg/L 33.95 17.74 - 46.51 6.67



CAGV kg /kg SSVLM·d 1.43 0 - 16.29 3.92




Tabla 28. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos asociados al licor mezcla de la línea de agua A+B de la EDAR Cuenca del Carraixet.

LICOR MEZCLA (CARRAIXET A+B) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar

pHLM - 7.44 7 - 7.88 0.20

CondLMµS/cm µS/cm 1625.35 946 - 2540 351.23

SSLM mg/L 1938.04 1100 - 2980 549.07

SSVLM mg/L 1605.43 905 - 2410 435.57

%SSVLM % 83 70 -91 5

IVF mL/g 119.58 71.43 - 231.18 44.64

NT SSVLM mg/L 95.94 72.14 - 140.29 18.27

PT SSVLM mg/L 24.32 18.73 - 38.56 4.83

Tabla 29. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos asociados al licor mezcla de la línea de agua C+D de la EDAR Cuenca del Carraixet.

LICOR MEZCLA (CARRAIXET C+D) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar

pHLM - 7.46 7.08 - 7.76 0.15

CondLMµS/cm µS/cm 1607.13 947 - 2541 298.91

SSLM mg/L 1830.87 1101 - 2981 449.85

SSVLM mg/L 1513.26 906 - 2411 364.42

%SSVLM % 83 74 - 89 4

IVF mL/g 130.70 77 - 287 60.30

NT SSVLM mg/L 96.24 67,87 - 138,50 17.55

PT SSVLM mg/L 25.68 21,13 - 41 4.67

Tabla 30. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos asociados al licor mezcla de la EDAR Quart Benàger.

LICOR MEZCLA (QUART BENÀGER.) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar

pHLM - 7.43 7.05 - 7.79 0.18

CondLMµS/cm µS/cm 2066.57 1330 - 2740 433.59

SSLM mg/L 2412.83 1790 - 3120 373.36

SSVLM mg/L 1909.13 1455 - 2490 288.54

%SSVLM % 79.17 68 - 87 3.71

IVF mL/g 119.26 59 - 167 27.62

NT SSVLM mg/L 73.28 41.06 - 107.55 20.95

PT SSVLM mg/L 29.60 18.66 - 40.44 5.45




Tabla 31. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos asociados al licor mezcla de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

LICOR MEZCLA (DÉNIA -ONDARA) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar

pHLM - 7.40 6.92 - 8 0.26

CondLMµS/cm µS/cm 2783.70 986 - 5440 1050.45

SSLM mg/L 3225.22 2500 - 3780 289.79

SSVLM mg/L 2238.52 1790 - 2730 229.96

%SSVLM % 69 62 - 75 3

IVF mL/g 143.03 103.34 - 234.18 32.62

NT SSVLM mg/L 57.49 31.08 - 78.16 11.50

PT SSVLM mg/L 35.08 27.91 - 42.76 3.70

Tabla 32. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros operacionales de funcionamiento de la EDAR Cuenca del Carraixet (línea A+B).

OPERACIONALES (CARRAIXET A+B) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar

Cmdbo kg DBO/kg SSVLM·d 0.29 0.12 - 0.43 0.10

Cmdqos kg DQOs/kg SSVLM·d 0.17 0.08 - 0.29 0.05

TRHr horas 6.4 5.3 - 6.9 0.4

EF días 7.5 3.3 - 21.7 5.2

O_bajo* % 1 0 - 10 2

O_medio* % 3 0 - 23 6

O_alto* % 96 66 - 100 8

Tªr ºC 20 15 - 27 4 *Oxígeno disuelto bajo ≤ 0,8 mg/L.; Oxígeno disuelto medio: 0,8 – 2 mg/L y oxígeno disuelto alto ≥ 2 mg/L.

Tabla 33. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros operacionales de funcionamiento de la EDAR Cuenca del Carraixet (línea C+D).

OPERACIONALES (CARRAIXET C+D) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar



TRHr horas 6.4 5.3 - 6.9 0.4

EF días 7.5 3.3 - 21.7 5.2

O_bajo* % 1 0 - 10 2

O_medio* % 3 0 - 23 6

O_alto* % 96 66 - 100 8





Tabla 34. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros operacionales de funcionamiento de la EDAR Quart Benàger.

OPERACIONALES (QUART BENÀGER) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar



TRHr horas 16.8 13.5 - 21.9 1.7

EF días 10.6 5.2 - 29 5.7

O_bajo* % 33 5 - 69 18

O_medio* % 61 12 - 95 20

O_alto* % 5 0 - 40 10


Tabla 35. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros operacionales de funcionamiento de la EDAR Dénia-Ondara-Pedreguer.

OPERACIONALES (DÉNIA - ONDARA) Media Mínimo-Máximo Desviación Estándar



TRHr Horas 14.9 12.3 - 18.9 1.9

EF Días 17.2 10 - 30.5 5.4

O_bajo* % 55 37 - 64 6

O_medio* % 30 21 - 38 4

O_alto* % 14 8 - 42 7





ANEXO II. Valores promedio, rango y desviación estándar de los parámetros* físico –

químicos y operacionales analizados globalmente para las tres EDAR estudiadas.

*Todos los parámetros analizados están nombrados según las etiquetas utilizadas durante el estudio (véase Tablas 8 y 9).

Tabla 36. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos que caracterizan el afluente de las tres EDAR estudiadas.

Parámetros del AFLUENTE Media Mínimo –Máximo Desviación Estándar

%DQOs % 36.88 15- 61 10.43

DQO/DBO - 1.92 0 - 3.46 0.57

CNT kg N/kg SSVLM·d 0.08 0.02 - 0.19 0.05

%N-NH4 % 62.66 0 - 94 17.15

CN-NH4 mg/L 0.05 0 - 0.10 0.03

CPT kg N/kg SSVLM·d 9.65 0.69 - 30.19 7.45

%P-PO4 % 60.76 0 - 93 24.05


DBO5/NKT gDBO5/gNKT 3.34 0 - 7.93 1.33

DBO/PT mg/L 31.49 0 - 97.87 14.60



CAGV kg /kg SSVLM·d 12.70 0 - 297.20 37.11

Tabla 37. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros físico-químicos que caracterizan el licor mezcla de las tres EDAR estudiadas.

PARÁMETROS LICOR MEZCLA Media Mínimo – Máximo Desviación Estándar

Phlm - 7.43 7.92 - 9.00 0.2

CondLMµS/cm µS/cm 2015.20 947 - 5441 767.6

SSLM mg/L 2358.17 1081 - 3781 691.77

SSVLM mg/L 1821.46 901 - 2731 438.45

%SSVLM % 79 62 - 91 7

IVF mL/g 128,09 1 - 287 45.28

NT SSVLM mg/L 81.31 32.08 - 141.29 23.83

PT SSVLM mg/L 29.69 19.66 - 43.76 6.24




Tabla 38. Valores promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de los parámetros operacionales de las tres EDAR estudiadas.

PARÁMETROS OPERACIONALES Media Mínimo – Máximo Desviación Estándar



TRHr horas 11.20 5.3 - 21.9 4.98

EF días 10.70 3.3 - 30.5 6.59

O_bajo* % 22.70 0 - 69 25.22

O_medio* % 24.88 0 - 95 26.47

O_alto* % 52.43 0 - 100 44.24

Tªr ºC 20.11 11 - 29 3.84 *Oxígeno disuelto bajo ≤ 0,8 mg/L.; Oxígeno disuelto medio: 0,8 – 2 mg/L y oxígeno disuelto alto ≥ 2 mg/L.