RENDIMIENTO DE BIOMASA Y CONTENIDO DE LÍPIDOS DE Tetraselmis suecica

UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE EFLUENTES DE

BODEGAS DE EMBARCACIONES ANCHOVETERAS INDUSTRIALES EN

CONDICIONES DE LABORATORIO

BACH. JOSÉ ARTURO GONZÁLEZ FERRERBACH. LINCOL ROLLER POLO BORDONABE

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTAFACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL BIOLOGIA EN ACUICULTURA

Contienen proteínas, vitaminas y ácidos

grasos poliinsaturados (Quevedo et al., 2008).

Puede utilizar diferentes fuentes nitrogenadas inorgánicas (urea, fosfato diamónico, nitratos, nitritos, etc.)En cultivos heterotróficos utilizando residuos orgánicos, puede metabolizar diversos aminoácidos y vitaminas produciendo cambios importantes en su crecimiento y composición bioquímica (Merino et al., 2003).

microalga marina unicelular 4 flagelos isodinámicos 10 um de diámetro (Ulloa, 2011).

Alimentación humana y animal

investigaciones genéticas,

morfológicas, fisiológicas,

nutricionales y bioquímicas (Blanco, 1991; Alveal et al.,

1995; Bertoldo et al., 2006).

Indicadores biológicos de contaminación respecto a la calidad de las aguas (Gómez & Ramírez, 2004).

Microalgas

Tratamiento de las aguas residuales (Romero et al.,

2009)

Tetraselmis suecica

INTRODUCCIÓN

Industria Pesquera

Desechos sólidos y líquidos

ambiente marino

0,05 a 2 TM de sanguaza por TM de pescado crudo (Cabrera, 2002; TASA, 2013).

Líquidos orgánicos (sangre, escamas, vísceras y agua marina de faena, que al verterse en el mar ocasionarán problemas de contaminación.

Chimbote

Chlorella sp. con residuos industriales líquidos orgánicos pesqueros DBO 85 % Romero (2011)

Méndez et al. (2010)Biorremediación utilizando la clorofita Scenedesmus quadricauda en efluentes cloacales diluidos al 25, 50 y 75 % 94, 40, 94 y 94 % amoníaco (63,7 mg L-1), nitrato (2,5 mg L-1), fosfato (16,725 mg L-1), fósforo total (5,464 mg L-1)sulfuros disminuyeron un 99% respecto al valor inicial (1,645 mg L-1)

Silva et al. (2011) concentraciones de sanguaza entre el 2 y 9 % como medio de cultivo para T. suecica, encontrando que un 3,5 % y 4,56 % presentan los crecimientos máximos.

Zhang (2012)Demostró la efectividad de Chlorella para eliminar completamente el amonio y fostatos presentes en los efluentes domésticos secundarios.

Lípidos en microalgas

síntesis y acumulación de triglicéridos,

Composición Nitrógeno

(Alsull & Wan, 2012)

Contenido lipídico

1 - 90 % peso secoAdición o restricción

alteraciones en la composición de los lípidos y ácidos grasos.

Biomasa microalgal

Biocombustible

Lípidos

(Donohue & Codgell, 2006; Meng et al., 2009; Rodolfi et al., 2009).

ESTRÉS

Crece exitosamente en diferentes medios de cultivo y metabolizar diversas fuentes nitrogenadas orgánicas e inorgánicas (Fernández & Paredes, 2006; Ipanaqué & Paredes, 2010).

T. suecica

Ensayos realizados con residuos pesqueros (Fernández & Paredes, 2007)

Efluentes bodegas de embarcaciones

Biomasa microalg

al y lípidos

Biotransformación

Contaminación marina

¿Cuál es el rendimiento de biomasa y contenido de lípidos de Tetraselmis suecica utilizando diferentes concentraciones de efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales en condiciones de laboratorio?

Objetivos

Objetivo general

Evaluar el rendimiento de biomasa y contenido de lípidos de Tetraselmis suecica utilizando diferentes concentraciones de efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales en condiciones de laboratorio.Objetivos específicos

- Determinar el rendimiento de biomasa y velocidad de crecimiento de T. suecica utilizando diferentes concentraciones de efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales (EEA) en condiciones de laboratorio;

- Determinar el contenido de lípidos de T. suecica utilizando diferentes concentraciones de EEA en condiciones de laboratorio.

Hipótesis de investigación

Si utilizamos concentraciones de 1, 2 y 5 % de efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales (EEA) se obtendrá mayor rendimiento de biomasa y contenido de lípidos de Tetraselmis suecica con la concentración de 2 % de EEA.

- Variable independiente (Vi) Concentraciones de EEA (1, 2 y 5 % ).

- Variable condicional (Vc) Condiciones de Laboratorio (luz, temperatura, aireación).

- Variables dependientes (Vd) Producción de biomasa. Concentración de lípidos totales.

Materiales y métodosMaterial biológico

Guillard f/2

20 mL Luz 40 w

Tratamiento del agua de cultivo

suspensión

Agitación constanteT. suecica

Laboratorio Cultivos

agua de mar

“El Dorado”

Transporte

2 recipientes 100 L c/u

Sedimentado

48 h

Filtrado

10 µm - malla de Nytal

Hipoclorito de sodio (5,25 %) 1 ml x L de agua de mar x 24 h

Neutralizado

Tiosulfato de sodio (15 % ) 1 mL x L de agua de mar

abundante aireación (5 L min-1) x 1 h

Preparación de los inóculos de T. suecica

Inóculos microalgal

es

100 mL cultivo

agua de mar esterilizada

iluminación constante x 5 días (2000 lux)

250 mL

Volumen efectivo 600 mL

iluminación (2000 lux)

aireación constante (50 mL min-1)

agitación manual 2 veces x día.

Inóculos

1

2

Preparación de los medios de cultivo

Medio Guillard f/2

COMPUESTOCONCENTRACIÓN

(mg L-1)

Nutrientes MayoresNaNO3

NaH2PO4H2O

 75,05,0

MicronutrientesNa2EDTA

FeCl3.6H2O

CuSO4.5H2O

ZnSO4.7H2O

CoCl2.6H2O

MnCl2.4H2O

Na2MnO4.2H2O

 4,363,150,01

0,0220,010,18

0,006

VitaminasTiaminaBiotinaCianocobalamina

 0,10,50,5

Obtención de EEA

Homogenizar (licuadora) y

filtrar a 20 um malla de nytal

Autoclave 121 °C x 15', licuar y filtrar -papel Whatman 41

Realizar las diluciones

Neutralizar a pH 7, con NaOH o

HCl

Almacenar a 5 °C en las botellas

hasta el inicio del experimento

Flujo de la preparación de los efluentes para el cultivo de T. suecica.

Acondicionamiento de las Unidades Experimentales

Tratamientos Especificaciones

T0Cultivo de T. suecica con medio de cultivo Giullard f/2 (Control).

T1Cultivo de T. suecica con efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales con una concentración de 1 % de EEA.

T2Cultivo de T. suecica con efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales con una concentración de 2 % de EEA.

T3Cultivo de T. suecica con efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales con una concentración de 5 % de EEA.

Tratamientos utilizados en los cultivos de T. suecica.

PARÁMETROS CONCENTRACIÓN

Humedad (%) 91,26

Proteínas (%) 3,71

Lípidos (%) 0,14

Cenizas (%) 3,38

Sólidos Totales (g L-1) 87,44

Nitratos (mg L-1) 1,52

Nitritos (mg L-1) 0,02

Fosfatos (mg L-1) 1,17

Amonio (mg L-1) 8,23

Valores de las concentraciones de los principales parámetros de los efluentes de las embarcaciones anchoveteras industriales (EEA).

Analizado en el Laboratorio de Biología y Ecología de la Universidad Nacional del Santa.

Determinación del crecimiento poblacional de T. suecica

conteos diarios

suspensión

microalgal

Cámara Neubauer alícuotas

microscopio

binocular Olympus

velocidad de crecimiento

poblacional por día (µ)

tiempo de duplicación diaria (TD) al quinto día de cultivo

 

N0 y Nf corresponden al número de células por mL al inicio y al quinto día (T0 y Tf), respectivamente.

Determinación de la biomasa de T. suecica

Pesado papel filtro Whatman N° 42

Embudo Büchner

matraz Kitasato

Bomba de vacío Filtrado50 mL de suspensión microalgal x c/ unidad experimental

Secado

estufa a 60° C por 8 h105° C por 10 min

Enfriado

Pesado

secador de campana por 1 h

Biomasa (mg L-1)

((P2 – P1) / 50) x 1000

P1: Peso inicial (papel) mgP2: Peso final (papel + muestra) mg.

Agregar 2 mL de H2SO4

concentrado

Muestra centrifugada (10 mL)

Agregar 3 mL de metanol:cloroformo (2:1)

Centrifugar 10000 rpm por 10 min.

Agregar 3 mL de agua y extraer la capa superior

Evaporación de gases y secado con calor

Calentar a 200 ºC x 60´

Enfriar a temperatura ambiente

Lectura espectrofotométrica a 375 nm (longitud de onda)

Dejar reposar por 24 horas a 5 ºC

Flujograma para determinar los lípidos totales de T. suecica en todos los tratamientos. Metodología de Blight & Dyer (1959) y Marsh & Weinsteinn (1966).

y = 1,7635xR² = 0,9982

y = 1,6876xR² = 0,9934

0,0

0,1

0,3

0,4

0,5

0,6

0,8

0,9

1,0

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Abso

rban

cia

Lípidos (mg mL-1)

A

B

Lineal (A)

Lineal (B)

Curvas de calibración para la determinación de lípidos en T. suecica.

(Blight & Dyer, 1959; Marsh & Weinsteinn, 1966)

 

Donde:V: Volumen final de muestra analizada (ml).M: Peso equivalente al peso seco (mg) en 10 mL de cultivo.

Contenido de lípidos (LT) en biomasa

 

 

Donde:L: Porcentaje de lípidos (%).B: Biomasa seca total por litro (mg).

Análisis estadístico de los datos

Análisis de varianza (ANOVA) Diferencias ÷ promedios

Prueba de Tukey HSD para establecer el mejor promedio

Nivel de significancia de 0,05Microsoft Office Excel 2010 y SPSS 20.0 para Microsoft Windows 7

Resultados

Parámetros del cultivo de T. suecica

Variación de la temperatura promedio (°C) en los cultivos de T. suecica de los tratamientos con medio EEA y Guillard f/2 (control).

22,1 - 24,3 °C

Δ 2,2 ºC

Variación del pH promedio en los cultivos de T. suecica de los tratamientos con medio EEA y Guillard f/2 (control).

Δ 7,81 al inicio del experimento, y 9,26 en el cuarto y quinto día de cultivo.

Crecimiento poblacional de T. suecica

DÍA DECULTIVO

EEA (%)

CONTROL 1 2 5

0 0,18 ±0,00a 0,18 ±0,00a 0,18 ±0,00a 0,18 ±0,00a

1 0,26 ±0,01a 0,21 ±0,01b 0,20 ±0,01b 0,20 ±0,01b

2 0,42 ±0,02a 0,34 ±0,03b 0,31 ±0,02b 0,32 ±0,02b

3 0,94 ±0,04a 0,82 ±0,02b 0,77 ±0,02b 0,80 ±0,02b

4 1,75 ±0,10ab 1,64 ±0,09b 1,88 ±0,10a 1,93 ±0,05a

5 2,33 ±0,13b 2,13 ±0,11b 2,65 ±0,08a 2,78 ±0,09a

6 2,70 ±0,07b 2,16 ±0,09c 2,91 ±0,09ab 3,05 ±0,09a

7 2,72 ±0,12b 2,04 ±0,09c 3,24 ±0,16a 3,44 ±0,15a

8 2,59 ±0,12c 1,90 ±0,13d 3,22 ±0,15b 3,61 ±0,08a

9 2,40 ±0,09b 1,75 ±0,09c 3,15 ±0,10a 3,34 ±0,11a

10 2,36 ±0,10b 1,40 ±0,11c 3,18 ±0,16a 3,42 ±0,10a

11 1,89 ±0,12c 1,13 ±0,07d 3,07 ±0,14b 3,38 ±0,12a

Densidad poblacional promedio (x106 cél. mL-1) de T. suecica cultivados con medio EEA y Guillard f/2 (control).

Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).

Variación de la densidad poblacional (x106 cél. mL-1) en los cultivos de T. suecica de los tratamientos con medio EEA y Guillard f/2 (control). 

PARÁMETRO

EEA (%)

CONTROL 1 2 5

µ (día-1) 0,51 ±0,01b 0,49 ±0,01b 0,54 ±0,01a 0,55 ±0,01a

TD (día) 1,35 ±0,03b 1,40 ±0,03b 1,29 ±0,01a 1,27 ±0,02a

Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).

Promedios de la Tasa de crecimiento (µ) y Tiempo de duplicación diaria (TD) poblacional de T. suecica en los tratamientos cultivados con medio de cultivo EEA y Guillard f/2 (control).

Al quinto día de cultivo

Inicio del experimento

Contenido de lípidos en T. suecica

a

b bc

Contenido de lípidos en porcentaje de T. suecica en los tratamientos con medio de cultivo EEA y Guillard f/2 (control). Letras diferentes indican diferencia significativa (α=0,05).

Rendimiento de biomasa total y lípidos en T. suecica

PARÁMETROSEEA (%)

1 2 5

Biomasa Total (BT)(mg L-1)

434,66 ±22,85b 569,49 ±22,63a 607,13 ±18,18a

Biomasa Lípidos (BL)(mg L-1)

116,09 ±4,12b 133,09 ±2,17a 140,63 ±2,61a

Promedios del rendimiento en biomasa total y de lípidos de T. suecica, en los tratamientos cultivados con 2 y 3 % de EEA.

Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).

Rendimiento de biomasa total y lípidos de T. suecica en los tratamientos dosificados con EEA.

Letras diferentes entre tratamientos indica diferencia significativa (α=0,05).

434,66

569,49

607,13

116,09133,09 140,63

0

100

200

300

400

500

600

700

10 20 50

mg

L-1

EEA (mL L-1)

BIOMASA TOTAL BIOMASA LÍPIDOS

(2 %) (5 %)(1 %)    

b

b

a

a

a

a

PARÁMETROSEEA (%)

2 5

Rendimiento BT(g / L de EEA)

28,47 ±1,13a 12,14 ±0,36b

Rendimiento BL(g / L de EEA)

6,65 ±0,11a 2,81 ±0,05b

Promedios del rendimiento en biomasa total y de lípidos de T. suecica, en relación a la dosificación de EEA, en los tratamientos cultivados con 2 y 5 % de EEA.

Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).

R² = 0,9954

R² = 0,9989

0

10

20

30

40

0 10 20 30 40 50 60

Ren

dim

ient

o (g

/ L

de E

EA

)

EEA (mL L-1)

R BIOMASA TOTAL R BIOMASA LÍPIDOS

(2 %) (5 %)

Rendimiento de biomasa total y de lípidos en relación a la dosificación de EEA para T. suecica en los tratamientos con medio de cultivo EEA.

DISCUSIÓN

cultivos microalgales características ambientales

composición química

luminosidad

nutrientes

pH

(Laing & Helm, 1981; Richmond & Becker, 1986; Millán-Núñez et al., 2010)

Rango T°

especiemicroalgas

cultivadas

Rango T°

Hasta 25 °C

36 °C

Abalde et al. (1995)

T. suecica

18 y 22 °C

productividad no es afectada

Laing & Helm (1981)

significativamente iguales en cada día de cultivo, por lo que no serían condicionantes para la obtención de los resultados.

Δ T° 22,1 - 24,3 °C,

pH

Rango óptimo

7 - 8

(Richmond & Becker, 1986)

cultivan T. suecica 7,3 y 8,5

Millán-Núñez et al. (2010)

Silva et al. (2011)

cultivan T. suecica 7,13 y 8,69

pH entre 7,81 y 9,26, no determinante en los resultados.

crecimiento

poblacional

asimilación nutrientes,

T. suecica

Nitrógeno

limitación de

nutrientes

crecimiento

Densidades microalgales

acumulación de lípidos

el doble (Thompson 1996)Tiempo de duplicación diaria (TD)

1,50 día Sheehan et al. (1998)

Alsull & Wan (2012) Loera-Quezada & Olguín (2010)

Fábregas et al. (1996)

Inhibición x

saturación N

CONCLUSIONES

Las mayores densidades poblacionales de T. suecica al quinto día de cultivo se obtuvieron en los tratamientos dosificados con 2 y 5 % EEA, con 2,65 y 2,78 x106 cél. mL-1, respectivamente; mientras que el menor se encontró con el dosificado con 1 % de EEA con 2,13 x106 cél. mL-1.

Los mayores valores de µ para T. suecica al quinto de cultivo se presentaron en los tratamientos dosificados con 2 y 5 % de EEA, con 0,54 y 0,55 día-1, respectivamente; y el menor valor se presentó en el tratamiento dosificado con 1 % de EEA, con 0,49 día-1.

El mayor valor de TD para T. suecica en el quinto día de cultivo, se obtuvo en el tratamiento con 1 % de EEA, con 1,40 día; mientras que los menores valores se presentaron en los tratamientos con 2 y 5 % de EEA, con 1,29 y 1,27 día, respectivamente.

El mayor contenido en porcentaje de lípidos para T. suecica al quinto día de cultivo, se obtuvo en el tratamiento dosificado con 1 % de EEA con 26,73 %; y con dosificaciones de 2 y 5 % de EEA se obtuvieron menores porcentajes con el 23,39 y 23,18 %, respectivamente.

Los mayores rendimientos en biomasa de lípidos para T. suecica al quinto día de cultivo, se obtuvieron en los tratamientos dosificados con 2 y 5 % de EEA, con 133,1 y 140,6 mg L-1, respectivamente; y con el 1 % de EEA se obtuvo una menor biomasa de lípidos con 116,1 mg L-1.

Al comparar el rendimiento de biomasa total (BT) y lípidos (BL) de los tratamientos con 2 y 5 % de EEA, se obtuvo que el dosificado con 2 % de EEA presentó un mayor rendimiento para BT y BL con 28,47 y 6,65 g / L de EEA, respectivamente; mientras que con 5 % de EEA, se obtuvieron 12,14 y 2,81 g / L de EEA, para BT y BL, respectivamente.

RECOMENDACIONES

Evaluar el contenido de carbohidratos y proteínas de los cultivos de T. suecica con diferentes concentraciones de EEA.

Evaluar el efecto del número de dosificaciones en el crecimiento y contenido de lípidos, carbohidratos y proteínas de T. suecica cultivado con diferentes concentraciones de EEA.

Determinar el efecto de diferentes concentraciones de EEA en el crecimiento poblacional y contenido de lípidos en cultivos masivos de T. suecica cultivados en tanques de 100 L. Evaluar con diferentes concentraciones de EEA, los costos de producción de biomasa y lípidos a escala piloto de T. suecica. 

Gracias

PARÁMETRO

EEA (%)

CONTROL 1 2 5

R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3

N0 (x106 cél. mL-1) 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18

Nf (x106 cél. mL-1) 2,46 2,33 2,21 2,03 2,11 2,24 2,56 2,66 2,72 2,68 2,79 2,86

Día 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

µ (día-1) 0,52 0,51 0,50 0,48 0,49 0,50 0,53 0,54 0,54 0,54 0,55 0,55

TD (día) 1,33 1,35 1,38 1,43 1,41 1,37 1,31 1,29 1,28 1,28 1,26 1,25

Valores de la Tasa de crecimiento (µ) y Tiempo de duplicación diaria (TD) poblacional de T. suecica en las unidades experimentales de los tratamientos cultivados con medio de cultivo EEA y Guillard f/2 (control).

PARÁMETROS

EEA (%)

CONTROL   1   2   5

Biomasa (mg L-1)507,

5480,

2460,

6 

412,7

433,0

458,3

 545,

5572,

4590,

5 

587,7

609,9

623,8

Absorbancia (λ)0,35

50,36

00,33

8 

0,391

0,394

0,417

 0,45

20,45

90,46

7 

0,494

0,476

0,486

Lípidos (%)20,2

721,7

221,2

6 

27,45

26,37

26,36

 24,0

123,2

322,9

1 

24,35

22,61

22,58

Lípidos (mg L-1)102,

9104,

397,9  

113,3

114,2

120,8

 131,

0133,

0135,

3 

143,1

137,9

140,8

Valores de la Biomasa, Absorbancia, Porcentaje de lípidos y Biomasa de lípidos de T. suecica en las unidades experimentales de los tratamientos cultivados con medio de cultivo EEA y Guillard f/2 (control).