UNIVERSITETI I PRISHTINËSFAKULTETI I BUJQËSISË DHE VETERINARISË

Teknologji Ushqimore me Bioteknologji

Lënda: Bioteknologji e Shtazëve Tema: Raport mbi ushtrimin e zhvilluar (Ekstraktimi i ADN-së).

Ass: Rreze Gecaj

________________________ Punuan: Valmir Ejupi Mirsim Tovёrlani Mustafё Xhemajli

DITA I

Grupi ynë në këtë ushtrim ka pasur të punoj me materialin e mëlqisë me qëllim të ekstraktimit të ADN-së nga ky material.

Ecuria e punës:

Së pari mostra prehet me thikë përafërsisht deri në peshën(25-30 mg)dhe një copë vendoset në tubin me vëllim 1.5 ml (fig.1.).

Më pastaj në këtë tub shtohen 180μl ATL-pufer (fig.2.), i cili pufer shtohet me qëllim të shpërbërjes së membranës së qelizës.

Fig.1. Tub për vendosjen e mostres. Fig.2. ATL-pufer.

Tubat 1.5 ml i përzijmë në vortex si në (fig.3).

Fig.3. Përzierja e tubave në vortex.

Në këtë hap, në secilin tub vendosen nga (20μl Proteinazë-K), e cila shtohet me qëllimin e vetëm që të shpërbëjë proteinat nga histonet, të cilat e mbajnë të lidhur zinxhirin e ADN-së rreth vetes së tyre dhe përsëri homogjenizohen (përzihen), në vortex.

Fig.4. Proteinazë-K.

Në këtë rast në çdo tub vendoset nga një sferë metalike me qëllim të copëtimit të mostrës dhe futen në homogjenizator për kohën 1minutë me 50 rrotullime.

Vendosen tubat në Termomixer për (15minuta në 56ºC).

Fig.5. Termomixeri për tubat 1.5 ml.

Ndërkohë tubat1.5 ml përzihen në vortex.Më pastaj ngadalë i shtohet secilit tub me pipetë automatike nga (200μl Al-pufer).

Fig. 6.Solucioni i Al-puferit. Fig.7. Pipetë automatike

Të përzihet herë pas here kjo përmbajtje në vortex. Pas përzierjes në vortex, më pas shtohen me pipetë automatike (200μl etanol Et-OH)- (96-100%) dhe përsëri përzihen tubat

në vortex .

Fig.8. Etanoli 96%

Më pas merren nga 700ml prej çdo tubi dhe vendosen në tubat me filtër (D-Neasy), si në (fig.9.). Këta tuba (D-Neasyt), që tanimë janë të mbushur me material të mëlçisë tani vendosen në centrifug si ne (fig.10.), me 8000

rrotullime për minutë (rpm), për së paku një minutë, ku me ç'rast bie poshtë një përzierje në tubin mbledhës:

Fig.9. Tubat me membranë (D-Neasy) Fig.10. Tubat në centrifugë

Tubat hiqen nga nga centrifuga dhe përmbajtja e kulluar në tubin mbledhës me rastin e centrifugimit largohet . Në këtë hap tani shtohen 500μl AË1-pufer dhe centrifugohen për 1 minutë ose më shumë:

Nxirren tubat nga centrifuga dhe këtyre tubave përsëri iu largohet përmbajtja e lëngët që grumbullohet në tubin e poshtëm mbledhës.

Tubave më pas iu shtohen (500μl AË2-pufer) për shpërlarjen e dytë të përzierjes së ADN-së:

Fig.Puferi larës AË1 Fig.Aë 2 puferi larës

Tubat centrifugohen për 3 minuta në 1400 rpm dhe përsëri masa e lëngët në tubën mbledhëse hudhet dhe ndërrohet me

një të re. ADN-ja më pas eluohet me anë të (200μl AE-pufer), që shihet në fotografinë e mëposhtme ;

Puferi për eluimin e ADN-së (Elution buffer)

Pasi ADN-ja të kryejë procesin e eluimit, lihet të qëndrojë në temperaturë dhome për kohën rreth 1 minutë.

Më pastaj tubi me ADN centrifugohet në centrifugë për 1 minutë në 8000 rpm.

Shihet se kemi ADN-në e ekstraktuar në fund të tubit, ku kjo ADN më pastaj duhet të ruhet në temperaturën (-20ºC), nëse me

këtë masë të ADN-së do të punojmë brenda një kohe të shkurtër, ose ruhet në temperaturën (-80ºC), nëse vendoset që me këtë

masë ADN-je të punohet më vonë.

Pra, në temperaturën (-80ºC), ADN-ja e ekstraktuar ruhet për një kohë më të gjatë.

DITA II

Nxirren tubat nga vendi i ruajtjes (inkubatori).Tubat me mostër e nxjerrur nga vendi i ngrirjes (ruajtjes), mbahen në dorë me qëllim që të shkrihen sa më shpejtë.Poashtu, herë pas here edhe centrifugohen.Mbushet një epruvetë me ujë dhe futet mostra "Blank" në spektrofoto-metër me qëllim që spektrofotometri të kthehet në vlerën e dendsitetit optik Në spektrofotometër zgjedhet opsioni "Double strand", pasiqë ne jemi të interesuar vetëm për ADN komplete dhe jo për ADN të degraduar-copëtuar.Tubi me mostër të mëlçisë tanimë vendoset më spektrofotometër dhe zgjedhet opsioni "Sample".Pasi të shtypet ky buton, do të fitohet një vlerë e caktuar, e cila tregon sasinë e ADN-së komplete (të pa degraduar).

Duhet të dihet se nëse raporti (260/280), duhet të jetë midis 1.8 dhe 2.0 sepse nëse ky raport është më i madh se ky kufi i numrave, atëherë themi se kemi kontaminim të mostrës me ARN.Poashtu, edhe raporti (260/230), nëse është mën vlerën 1.5, atëherë themi se mostra jonë është e kontaminuar me proteinë.Gjatë leximit në spektrofotometër, janë fituar këto vlera ne diagramet e paraqitura per mostren e mëlçis dhe pasi që në punim ka marër pjes një student nga (grupi i III),atēher kemi marrë të dhëna nga materiali muskuj.

Materiali: Mëlçi Materiali:Muskuj

Përgatitja e chipit:

Koncentracioni i A

DN

-së (ug/mL)

Gjatë këtij ushtrimi, përdoren chipat Agilent DNA 1000 Reagents/DNA chips; që duket si në fotografinë e mëposhtme:

Fig. Agilent DNA 1000 reagents/DNA chips.

Mbushet geli i kaltërt (9μl) në pikën (G) të chipit (këndi i djathtë-vrima tretë poshtë).Chip-i tanimë futet në sistemin për mbushje, ku shpërndahet geli për rreth 1 minutë, ku shihet se shiringa bie deri në vlerën 4.0mL sistemi i mbushjes duket si në foton e mëposhtme :

Fig. Stacioni për mbushjen e chipit.

Më pas mbushen edhe me (9 μl), Dye gel edhe dy vrimat tjera (G), si dhe me (5μl), Dye gel mbushet edhe vrima e mostrës Ladder gjithashtu.(1μl), e mostrës Ladder më pas vendoset po në vrimën Ladder.Pra tri vrimat e para të chipit nga këndi i djathtë duke shkuar poshtë pra janë për gel, kurse vrima e fundit në këndin e djathtë është për mostrën Ladder.Vazhdohet tanimë me mbushjen e vrimave(nga 1μl), me mostrat tona që i kemi përgatitur; së pari mbushen vrimat me mostrat si në vijim:Vrima 10→ mostra C5-IGF1 (paraprakisht e amplifikuar me PCR)Vrima 11 → mostra T14Vrima 12 → mostra C5Më pas, vazhdohet me mbushjen e vrimave të chipit me mostra nga (1μl), me pipetë. Chipi pas mbushjes përzihet në IKA MS3 vortexer (pajisje për përzierjen e mostrave të cilat ndodhen në chip), për 1 minutë.

Mbushja e vrimave të chipit me mostra. Pajisja IKA MS3 vortexer

Pas 1 minutë përzierje të chipit, chipi nxirret nga pajisja dhe shikohet për formimin eventual të ndondjë fluske në njërën nga vrimat e chipit (nëse ka fluska, ato largohen me ndonjë majë të hollë dhe sterile).Ndërkohë shpërlahen elektrodat e Bioanalyzer-it, ku kjo arrihet me anë të futjes në bioanalyzer të një chipi që në vrimat e mostrave ai përmbanë ujë të distiluar (500μl). Chipi dhe bioanalyzeri tanimë janë gati, kështu chipi tanimë futet në pajisjen Bioanalyzer.

Fig. Futja e chipit me mostra në Bioanalyzer

Mbyllet kapaku i Bioanalyzerit dhe në kompjuter hapet programi, i cili jep të dhënat dhe rezultatet në lidhje me leximin e chipit i cili është futur dhe zgjedhet në meny lloji i chipit me të cilin jemi duke punuar.

Fig. Aparatura që përdoret në rastin e leximit të chipit nga Bioanalyzeri;

Pas hapjes së programit në kompjutet, zgjedhet opsioni (100 seri).Shtypet butoni START, dhe në këtë mënyrë nisë edhe analizimi i chipit nga ana e Bioanalyzerit.Procedura e leximit dhe analizimit të mostrave merrë një kohë rreth 30 minuta, sepse Bioanalyzeri e lexon dhe e analizon secilën mostër veç e veç...

Pas 30 minutave është bërë leximi i mostrave të vendosuta në chip dhe janë arritur këto rezultate →↓

Interpretimi i Rezultateve

Qëllimi i punimit ka qenë për ta matur kualitetin (cilësinë), dhe kuantitetin(sasinë), e AND – së. Së pari kemi figurën e cila tregon se të gjitha mostrat jane analizuar (shikuar), nga Bioanalyzeri ; me ç’rast shihen shenjat e miratimit me ngjyre te gjelbert ne forme (√ ) :

\

Kemi paraqitur nje rast te një mostre e cila është degraduar gjatë eksperimentit, siç shihet ne figuërn në vijim.

Nëse kemi praninë e deri në (12 peaks), kjo tregon qe kemi te bëjmë me eksperimentin e kryer në rregull.Nëse kemi pak peaks ne elektroferrogram, tregon per moster e cila eshte e fragmentuar. Nëse ka shume peaks (50-60 peaks), kjo tregon per moster te degraduar,Nëse ka peaks ne intervalin pas (1500 bp), per ate moster themi se eshte e kontaminuar (me proteine,ARNetj.).Ne boshtin e abshises (s) te ferrogramit tregohet shpejtesia e migrimit te bazave neper gel, kurse bashti i ordinates (FU), nenkupton shendritjen ( shkallen e fluoreshences), se qifteve te bazave.Ja nje shembull i mostres e cila eshte e degraduar→↓

-- Kjo moster llogaritet e degraduar, sepse ka shume peaks ndermjet dy maksimumeve.Siq shihet ne 8 peask-at e parë nuk kemi aspak koncentracion te bazave (bp); edhe ky fakt qon ne konkludim për moster te degraduar.

Miinimumi i koncentracionit te qifteve te bazave arrihet ne shtate peaks-at e pare (7),Kurse, maksimumi i koncentrimit te qifteve te bazave arrihet ne peaks-in e nente (9) me rradhe.

-- Kurse ne pjesen e djathte shihet gel elektroforeza, me c’rast shihen edhe dy shiritet (me ngjyre vjollce dhe gjelber),ku keta dy shirite llogariten si markere ku ndermjet te cileve nuk duhet te kete asnje shirit te zi.

-- Ne rastin tone shihet qe ka sepse mostra eshte degraduar gjate eksperimentit .Kurse ne pjesen e djathte shihet gel elektroforeza, me q’rast shihen edhe dy shiritet (me ngjyre vjollce dhe i gjelber), ku keta dy shirite llogariten si markere ku ndermjet te cileve nuk duhet te kete asnje shirit te zi.Ne rastin tone shihet qe ka sepse mostra eshte degraduar gjate eksperimentit .

Kemi edhe rastin e leximit te mostres Ladder (referente), nga Bioanalyzeri, moster se ciles i njihet gjatesia e bazave dhe dijme parametrat e saj, e cila shihet si ne figurë→↓

Në pamje më të afërt dhe të detajuar ky ferrogram i mostrës Ladder (udheheqëse), shihet në figurën e mëposhtme :

Ketu shohim se kemi dy ekstreme te koncentrimit, të cilat paraqiten me anën e dy ngjyrave (e gjelbër dhe vjollce), te cilët mund të njihen edhe me emrin si “Markerë”.Shohim se koncentrimin me të vogel e kemi pasur në piken (15 bp) të cifteve te bazave, kurse maksimumi ne këtë rast është arritur në intervalin e cifteve të bazave (bp) 1500.

Nëse do të kishim pasur ndonjë peaks sado të vogël pas intervalit (1500 bp) atëherë kjo do të tregonte për një kontaminim të mundshëm të mostrës gjatë eksperimentit.

Tjetër rast i elektroferogramit kemi edhe atë të mostrës (C5), që shihet edhe në figurën e mëposhtme.Në këtë rast është paraqitur elektoferogrami i faktorit të rritjes, i ngjashëm me insulinën:

- Shohim se mostra ka funksionuar, por kemi një maksimum (peaks) në mes të të dy markerëve (gjelbërt dhe kaltërt) pra që edhe nëse do të vërehej gel elektroforeza e këtij elektroferogrami do të shihnim se do të kishte një devijim nga standardet (markerët).Koncentracioni më i madh në këtë rast është arritur në intervalin e (227 çifte të bazave apo bp) apo peak-un me numër 2, e cila ka vlerën (48.73 ng/μl) të koncentracionit.

Koncentracioni më i vogël i cifteve të bazave (bp) vërehet tek cifti (1500 bp), ku është arritur koncentracioni me vlerën (2.10 ng/μl).

Tjetër shembull i elektroferogramit është edhe rasti i analizimit të mostrës, me c’rast shihen disa fragmente të mostrës së trupit të verdhë nga gjedhi.

Këtu ne presim që të kemi sipas eksperimentit të planifikuar disa fragmente të ADN-së nga (138-388) cifte të bazave (bp):

- Por, fatkeqësisht shohim se kemi edhe degradim të materialit të ADN-së me c’rast numri i cifteve të bazave të llojit të tillë të pritur do të na zvogëlohet.