Embed Size (px)
DESCRIPTION
*
Citation preview
Ли-Жуланов Н.С.
Новосибирск
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОРАЗМЕРНОЙ СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ
НУКЛЕОЗИДТРИФОСФАТОВ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Примеры нуклеозидных лекарственных препаратов
Ацикловир Цитарабин Гемицитабин Азидотимидин
2
Проблема использования нуклеозидных лекарственных препаратов
O
HO
HO OH
Base
O
O
HO OH
BaseP
O-
O
O
PO
O-
O
P-O
O-
O
3
Общая схема получения нанокомпозитов
+Nanoparticles pppN Nanoparticles pppN
Nanoparticles
TiO2
Fe2O3
SiO2
:
4
Использование «click»- реакции для ковалентного присоединения pppN к наночастицам
SiO2 N3 pppN SiO2 NNN
pppN
SiO2 N3 pppN SiO2N
NN
pppN
Метод 1
Метод 2
5
Линкеры используемые для модификации наночастиц и pppN
O
O O
O N
O
O
OO
O FF
F
FF
N3O
O
N
O
O
N-оксисукцинимидный эфир 6-азидогексановой кислоты
N-оксисукцинимидный эфир пропаргилового эфира
глутаровой кислоты
Пентафторфиниловый эфир 6-проп-2-инилокси-гексановой
кислоты
O NH2
3-аминопропоксипропин
6
Синтез модифицированных наночастиц диоксида кремния
HN O
OO
HN
SiO2
O
O
N3
O
HN
SiO2
SiO2
NH2SiO2
OO O
O N
O
O
OO
O FF
F
FF
N3 O
O
N
O
O1 2 3
1 2 3
7
Синтез модифицированных нуклеозидтрифосфатов
O NH
P
O
O
O-
P
O
O-
O P
O-
O
O
O
OH
O NH2
-O P
O
O
O-
P
O
O-
O P
O-
O
O
O
OH
B
Ph3P/ Py2S2
ДМСО
B+
P
O
O-
OP
O
O-
OP
O
O-
-O
2) (Bu3NH)2H2P2O7O
HN3
HH
HH
HO N
NH
O
OPOCl3/Pyridine1)
O
HN3
HH
HH
O
N
NH
O
O
8
Ковалентное присоединение pppN к наночастицам по методу 1
O NH
PO
OO-
PO
O-O P
O-O
O
O
OH
B
CuSO4 / TBTA, Na ascorbate
H2O / DMSO
SiO2
HN
ON N
NHN P
OO
O-PO
O-O P
O-O
O
O
OH
B
O
SiO2
HN
ON3
9
Синтез различных нанокомпозитов азидотимидина по методу 2
-O PO
OO-
PO
O-O P
O-O
O
O
N3
CuSO4 / TBTA, Na ascorbate
H2O / DMSO
1 или 2
SiO2
HN
O
3O
O NN
N
O
NN
N
ppp O
SiO2
HN
O
O5
ppp T
T
T
SiO2
HN
O3
O
O
12
SiO2
HN
O
O5
10
Флуоресцентномеченные наночастицы диоксида кремния и нуклеозидтрифосфаты
O OO
OHNH
OH
S
SiO2
NH2
NH
SiO2
Flu
pppAZT*
Li+
PO-
OOP
O-
OOP
O-
O
Li+ Li+
O NH
O
HOH
HHHH
O N
HN
O
ONH
O
OOO
OH
OH
NH
C
S
11
SiO2
pppUFlu
Оценка способности нанокомпозитов SiO2~pppN проникать в клетки методом
конфокальной микроскопииВ эксперименте используют клетки MDCK. К клеткам добавляют растворы pppUFlu, смесь pppUFlu с исходными SiO2~NH2-наночастицами и суспензию нанокомпозита SiO2~pppUFlu
Видно, что флуоресцентная метка более-менее равномерно распределена внутри клетки. В контрольных экспериментах показано, что pppUFlu, не будучи в составе нанокомпозита, не проникает в клетки. 12
Оценка цитотоксичности наночастиц и полученных нанокомпозитов
Для оценки цитотоксичности нанокомпозитов применяют метод окраски мертвых клеток с помощью красителя трипанового синего. Результаты представлены на графике, где темные столбцы относятся к наночастицам SiO2~NH2, светлые столбцы – к нанокомпозитам SiO2~pppC. Из графика видно, что выживаемость клеток примерно одинакова для всех исследуемых образцов, причем образцы обладают низкой токсичностью.
0
20
40
60
80
100
120
0 0,031 0,063 0,125 0,25 0,5 1
концентрация, мг/мл
жи
вы
е кл
етки
, %
13
Субстратные свойства нанокомпозита SiO2~pppС
Смесь 1. 4 природных pppNСмесь 2. 3 природных pppN (кроме
pppC) и SiO2~pppC Дорожки 1 и 2 – продукты реакции
в смеси 1 и 2 соответственно; дорожки 3 и 4 – исходные матрица и праймер, соответственно. Видно, что реакция элонгации в обеих реакционных смесях приводит к образованию ожидаемого продукта (26-мерного олигонуклеотида, дор.1 и 2), что свидетельствует о том, что SiO2~pppC является полноценным
субстратом ДНК-полимеразы I из E.Coli.
14
Субстратные свойства нанокомпозита SiO2~pppAZT*
5’dCTCCGAAGAAATAAGATCCp Матрица
dATTCTAGGp5’‑- Праймер
dbiotpppC
и pppT ДНК-полимераза
SiO2~pppAZT* и dbiotpppC
5’CTCCGAAGAAATAAGATCCp Матрица
biotCTTTATTCTAGGp5’‑ Праймер
На ДНК-чипе № 1 проводят реакцию элонгации праймера с использованием природного трифосфата тимидина (pppT) и трифосфата цитидина, несущего биотиновую метку (pppCbiot) Аналогично проводят две последовательные реакции на ДНК-чипе № 2, причем в первой реакции вместо pppT используют образец SiO2~~pppAZT*
1 2 3
15
ВыводыДля осуществления предложенного способа получения
наноразмерной системы доставки нуклеозидтрифосфатов в клетки:
Был сконструирован и синтезирован алкин- содержащий линкер со сложноэфирной группировкой для последующего отщепления
нуклеозидтрифосфата внутри клетки
Синтезированы различные алкиномодифицированные и азидомодифицированные SiO2-наночастицы
Были синтезированы различные нанокомпозиты азидотимидина
Были получены флуоресцентномеченные нанокомпозиты азидотимидина и контрольные модифицированные наночастицы
Результаты исследований дают основания полагать, что полученные нанокомпозиты могут быть использованы в качестве
противовирусных и противораковых средств 16
