Aula 15

Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA.

Atualizado em outubro de 2003

Para aumentar ao máximo o tempo de sobrevida do Para aumentar ao máximo o tempo de sobrevida do enxerto, os receptores e os doadores potenciais enxerto, os receptores e os doadores potenciais

devem ser histocompatíveis. A tipagem tecidual é devem ser histocompatíveis. A tipagem tecidual é feita com o auxílio de uma bateria de anticorpos feita com o auxílio de uma bateria de anticorpos

monoclonais anti-HLA ou com o uso de seqüências de monoclonais anti-HLA ou com o uso de seqüências de DNA específicas. Assim, é possível determinar as DNA específicas. Assim, é possível determinar as

especificidades HLA expressas por cada indivíduo e o especificidades HLA expressas por cada indivíduo e o grau de compatibilidade entre o receptor e o grau de compatibilidade entre o receptor e o

potencial doador.potencial doador.

O ideal é que o receptor não reconheça o tecido a ser O ideal é que o receptor não reconheça o tecido a ser enxertado como estranho, não desenvolvendo reação enxertado como estranho, não desenvolvendo reação

imunológica. Sendo as moléculas HLA os alvos imunológica. Sendo as moléculas HLA os alvos principais da reação de rejeição, a compatibilidade principais da reação de rejeição, a compatibilidade HLA entre receptor e doador, diminui a chance de HLA entre receptor e doador, diminui a chance de

acontecer rejeição ao enxerto. O grau de acontecer rejeição ao enxerto. O grau de compatibilidade mínima necessária entre receptor e compatibilidade mínima necessária entre receptor e

doador depende do tipo de transplante.doador depende do tipo de transplante.

A probabilidade de encontrar indivíduos HLA-A probabilidade de encontrar indivíduos HLA-compatíveis é muito maior entre membros de compatíveis é muito maior entre membros de

uma mesma família do que entre indivíduos não uma mesma família do que entre indivíduos não aparentados. Isto deve-se a uma característica aparentados. Isto deve-se a uma característica importante do HLA, o polimorfismo. Contudo, importante do HLA, o polimorfismo. Contudo,

ainda que a probabilidade de dois indivíduos não ainda que a probabilidade de dois indivíduos não aparentados serem HLA-compatíveis seja muito aparentados serem HLA-compatíveis seja muito

pequena, ela existe. Assim, pacientes que pequena, ela existe. Assim, pacientes que precisam de um transplante de medula óssea e precisam de um transplante de medula óssea e

não encontra um Doador HLA-compatível na não encontra um Doador HLA-compatível na família podem encontrar um doador após a família podem encontrar um doador após a

busca em um banco de doadores voluntários de busca em um banco de doadores voluntários de medula óssea (quanto maior for este banco, medula óssea (quanto maior for este banco,

maior será a chance de encontrar um doador).maior será a chance de encontrar um doador).Nos Nos slidesslides a seguir, você será apresentado (ou a seguir, você será apresentado (ou relembrará) a alguns importantes conceitos erelembrará) a alguns importantes conceitos e

conhecimentos na área dos transplantes.conhecimentos na área dos transplantes.

Transplante ClínicoÓrgãos / Tecidos mais Transplantados

- Rim- Coração- Fígado- Córnea- Medula óssea- Pele, etc...

Barreiras aos Transplantes

• Autotransplante• Isotransplantes

Tolerância• Alotransplantes• Xenotranplantes

Rejeição

1944 - Medawar,P.: publicação dos resultados de experimentos realizados em animais:

“A rejeição do enxerto é resultante de uma resposta imunológica, específica e com memória, ao tecido ou órgão transplantado”.

Mecanismos de rejeição

Kuby, 2000

Linfócito Th

Macrófagoativado

Linfócito TDTHLinfócito B

Plasmócito

Célula NKou macrófago

Linf.citotox.

Enzimas líticas

Expressão MHC

citotoxicidade

lise

lise

ADCCReceptor de Fc

Mecanismos Humorais e Celulares

AloantígenoMHC classe I

AloantígenoMHC classe II

ENXERTO

Mecanismos Imunológicos da reação de rejeição

Alvos da rejeição: antígenos de histocompatibilidade

Antígenos de Histocompatibilidade no Homem

• HLA - Antígenos Leucocitários Humanos (Dausset e Payne,1960)

A Compatibilidade HLA

• Glicoproteínas HLA - presentes na membrana de todas as

células nucleadas do organismo.

• Pessoas compatíveis - possuem as mesmas moléculas HLA

Moléculas HLA

• Grupos de proteínas HLA importantes para os

transplantes:HLA-A / HLA-B / HLA-DR

• Designação numérica. Ex: HLA-A2; HLA-B7;

HLA-DR8

Moléculas HLA• Para cada tipo de

molécula HLA há várias proteínas

diferentes (polimorfismo)

• Veja: HLA-A : 124HLA-B: 258

HLA-DR: 221

HLA - Genética

• Os genes estão localizados no cromossomo No 6.

• Nós somos diplóides: dois cromossomos 6;dois conjuntos de genes

do HLA (dois haplótipos).

Herança do HLA• O HLA é herdado

em conjunto (haplótipo).

• Um haplótipo do pai e um da mãe.

• Existem portanto um total de 4 combinações diferentes dos haplótipos dos pais.

(0,25)

HLA - Herança

(0,25) (0,25) (0,25)

Pais

Filhos

(0,5 / 0,5) (0,5 / 0,5)

uma das permutações possíveis

Herança do HLA - Probabilidade

• Chance que você tem de ter um irmão:1. HLA-idêntico = 25%2. HLA-distinto = 25%3. HLA-haplo-idêntico = 50%

HLA e Rejeição de Enxerto•Rejeição:

– Hiperaguda - dentro de 48 h após o enxerto– Aguda acelerada - até 7 dias após o enxerto– Aguda - após 7 dias – Crônica (Doença crônica do enxerto) - vários meses ou anos após o enxerto

•A Rejeição pode ser devida a:–Pré-sensibilização do receptor a antígenos HLA do doador (transfusão de sangue, gravidez, transplante etc.)–Ativação primária da resposta imune anti-enxerto após o transplante.

Prevenção da rejeição• Provas Cruzadas (Cross-Match)

Previne, principalmente, a “Rejeição hiperaguda e a aguda acelerada”.

• Tipagem tecidual (Determinação dos antígenos HLA do doador e do receptor) Permite selecionar os pares Receptor-Doador

histocompatíveis.• Imunossupressão inespecífica

Pode controlar as reações de rejeição.• Imunossupressão específica

Reduz as respostas anti-enxerto sem aumentar a susceptibilidade às infecções.

Provas Cruzadas (Crossmatch) •Indica se o receptor tem anticorpos pré-formados

contra o potencial doador. •Mistura-se uma pequena quantidade de soro do

receptor com linfócitos do provável doador e adiciona-se uma fonte de proteínas do sistema complemento.

•Se o paciente tiver anticorpos contra o HLA do doador, a membrana das células do doador será lesada pelo complemento e este crossmatch é chamado de positivo.

• Um crossmatch positivo representa uma forte contra-indicação ao transplante, pois significa que o receptor poderá ter uma forte rejeição ao enxerto (rejeição hiperaguda)

Testes de Histocompatibilidade no Transplante de Órgãos - Provas Cruzadas

• Soro do receptor • + Linf. totais (T+B) do

doador• + Complemento• +Corante vital• +Formol

Prova Cruzada (Cross-Match) clássicaTeste de Microlinfocitotoxicidade(Terasaki e McClelland)

• As células do possível doador são incubadas com o soro do paciente (receptor):– As células usadas são, normalmente, linfócitos

T ou B, obtidos a partir de sangue periférico (doador vivo) ou linfonodos (doador cadáver).

– As células são purificadas por gradiente de densidade e aderência à lã de nylon ou com o uso de esferas magnetizadas contendo anticorpos anti-T ou anti-B.

linfócito teste

HLA-A3

linfócito teste

HLA-A3

anti-HLA-B5anti-HLA-A3

Complemento (Ativação)

Complemento(Não ativação)

Corante vital(penetra na

célula lesada)

Corantenão pene-tra na célula intacta

Veja a reação de microlinfocitotoxicidade:

Linfócito com membrana lesada Linfócito intacto

Veja o resultado ao microscópio de contraste de fase:

a: Linfócitos não lisados (reação de citotoxicidade negativa)

b: Linfócitos lisados (reação de citotoxicidade positiva)

Kuby, 2000

A reação de microlinfocitotoxicidade é realizada em placas de Terasaki, apresentada a seguir:

• Provas mais sensíveis e específicas:– CM-T (HLA Classe I)– CM-B (HLA Classe II)– Tratamento do soro com agente redutor de IgM

• (Ditiotreitol [DTT])– Adição de Anti-Gamaglobulina (AGH)– Citometria de fluxo...

• Análise da Reatividade contra Painel de Linfócitos (PRA)

Testes de Histocompatibilidade no Transplante de Órgãos - Provas Cruzadas

Tipagem MolecularTipagem Molecular

Sonda seqüência-específica (PCR-SSO)Sonda seqüência-específica (PCR-SSO)Envolve a amplificação a amplificação pela “Reação em Envolve a amplificação a amplificação pela “Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)” de um éxon do gene do Cadeia da Polimerase (PCR)” de um éxon do gene do HLA, utilizando “HLA, utilizando “primers” primers” de oligonucleotídios que de oligonucleotídios que

hibridizam com regiões do hibridizam com regiões do locuslocus HLA que são HLA que são conservadas entre diferentes alelos. A seqüência conservadas entre diferentes alelos. A seqüência

amplificada é então hibridizada com diferentes sondasamplificada é então hibridizada com diferentes sondas de oligonucleotídios, cada uma com seqüências de oligonucleotídios, cada uma com seqüências específicas de um alelo ou grupo de alelos HLA.específicas de um alelo ou grupo de alelos HLA.

• Esses ensaios visam a definição das especificidades Esses ensaios visam a definição das especificidades (baixa resolução) ou dos alelos (alta resolução) HLA de (baixa resolução) ou dos alelos (alta resolução) HLA de um indivíduo, a partir de amostra de DNA e com o uso um indivíduo, a partir de amostra de DNA e com o uso de “primers” e sondas específicas.de “primers” e sondas específicas.•Dois desses métodos cada vez mais utilizados: Dois desses métodos cada vez mais utilizados:

Amplificação seqüência-específica (PCR-SSP)Amplificação seqüência-específica (PCR-SSP)

Esse método consiste em colocar o DNA de uma Esse método consiste em colocar o DNA de uma amostra em diferentes tubos com dois amostra em diferentes tubos com dois primersprimers PCR. Um PCR. Um dos primers hibridiza uma região conservada do dos primers hibridiza uma região conservada do locuslocus HLA que está sendo tipado, sendo adicionado a todos HLA que está sendo tipado, sendo adicionado a todos

os tubos (ex. HLA-DRB1). O segundo os tubos (ex. HLA-DRB1). O segundo primerprimer PCR PCR hibridiza com uma região polimórfica do hibridiza com uma região polimórfica do locuslocus HLA – HLA –

cada tubo contém um cada tubo contém um primerprimer de especificidade de especificidade diferente. A amplificação do DNA só será observada no diferente. A amplificação do DNA só será observada no

tubo contendo um segundo tubo contendo um segundo primerprimer específico que específico que corresponde ao alelo (alta resolução) ou grupo de corresponde ao alelo (alta resolução) ou grupo de

alelos (baixa resolução) do HLA na amostra de DNA O alelos (baixa resolução) do HLA na amostra de DNA O produto gênico amplificado poderá ser detectado em produto gênico amplificado poderá ser detectado em

gel de agarose corado com Brometo de Etídio.gel de agarose corado com Brometo de Etídio.FIM