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R. Carrozzo, D. Verrigni

Unità di Malattie Muscolari e Neurodegenerative Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Roma

Efficienza diagnostica dei pannelli NGS per la diagnosi genetica delle malattie mitocondriali:

risultati di 3 anni di attività

6° Convegno Nazionale Malattie Mitocondriali Roma, 27-28-29 Maggio 2016

www.mitocon.it

PROGRAMMA SESSIONI SCIENTIFICHE (ECM)

Programme Scientific Sessions

VENERDÌ 27 MAGGIO 2016 8:45

Registrazione partecipanti - Registration of participants Intervento di Apertura - Opening speech

1° Sessione – DALLA RICERCA DI BASE ALLA CLINICA DELLE MALATTIE MITOCONDRIALI 1st Session – From basic research to the clinical comprehension of mitochondrial disease

Moderatori: Gabriele Siciliano Università di Pisa – Università Milano P. Santantonio – Mitocon

09.00 09:15 09:40 10:05 10:30 10:55

Mitochondrial disease: a story - Cristina Sarra - mito-mamma Getting ready to clinical trials: the importance of registry, natural history, biomarkers and outcome measures - Micho Hirano – Columbia University – New York USA Resolving the genetic basis of mitochondrial disorders Patrick Chinnery – Cambridge University - UK Metabolomi e Biomarkers Marilena D’Aurelio – Cornell University - New York USA New therapeutic perspectives: state of the art in general and specific treatments Massimo Zeviani – MRC Cambridge, UK Coffee Break

2° Sessione – Genotipi – Fenotipi 2nd Session – Genotypes – Phenotypes

Moderatori: Enrico Bertini IRCCS Bambino Gesù - Roma - Paola Desideri – Mitocon

11:20 11:45 12:10 12:35 13:00

Efficienza diagnostica dei pannelli NGS per la diagnosi genetica delle malattie mitocondriali: risultati di 3 anni di attività Rosalba Carrozzo, Daniela Verrigni - IRCCS Bambino Gesù -Roma Encefalopatie associate a Difetto di PDH in età pediatrica: correlazioni clinico-genetiche e possibili prospettive terapeutiche Anna Ardissone – Isabella Moroni – IRCSS C. Besta - Milano Storia Naturale di patologie mitocondriali dell’adulto Serenella Servidei – Università Cattolica “A. Gemelli” - Roma Malattie Mitocondriali senza coinvolgimento neuromuscolari Carlo Dionisi Vici – IRCSS Bambino Gesù – Roma Expanding the ocular envolment in mitochondrial disorders Valerio Carelli – Università di Bologna

13:25

Pranzo – Lunch

Ampio spettro di presentazioni cliniche: qualsiasi sintomo,

qualsiasi organo o tessuto, qualsiasi età.

Gli organi più colpiti sono quelli che hanno maggior fabbisogno energetico

(cervello, muscolo, cuore)

FENOTIPO CLINICO

Le Malattie Mitocondriali sono considerate il disordine metabolico

più frequente con una prevalenza pari a 1:5000-1:8500 nati

VARIABILITA’ GENETICA

W.J.H. Koopman et al., Embo Mol Med, 2016 S. DiMauro et al., Nat Rev Neurol, 2013

Geni codificanti subunità strutturali OXPHOS

Geni codificanti fattori di assemblaggio OXPHOS

Geni codificanti fattori coinvolti nel mantenimento e/o replicazione del mtDNA

Geni codificanti fattori coinvolti nella sintesi proteica

Geni codificanti per fattori della biosintesi dei lipidi e cofattori

H+ ATP H+

H+

H+

H+

1500 GENI NUCLEARI

REPLICAZIONE

FORMA DIMENSIONE

BIOSINTESI/TURN-OVER COMPLESSI RESPIRATORI

MITOFAGIA BIOGENESI

DINAMICA

CA 2+

BIOGENESI CENTRI FE/S MITOCONDRIALI

200 GENI-MALATTIA

Istochimica su sezioni di biopsia muscolare

Biochimica degli complessi enzimatici I-IV della catena respiratoria su omogenato di biopsia muscolare

Test biochimici e citochimici su fibroblasti ottenuti da biopsia cutanea

Ricerca di alterazioni genetiche

PROCESSO DIAGNOSTICO

INDAGINI GENETICHE

qRT-PCR: DEPLEZIONE DEL mtDNA

LONG-PCR: Delezioni singole del mtDNA, o Delezioni Multiple

Sequenziamento “Sanger” Sindrome (mtDNA o nDNA) Eredità materna (intero mtDNA) Clinica Eterogenea (gene 1-?, gene 2-?, etc)

PCR di sequenza

………2 giorni di lavoro……….

PCR PCR PCR PCR PURIFICA DELLE PCR

3’

SINGOLO GENE

PCR

SANGER NGS

+ Pazienti +Geni

……… 2 giorni di lavoro………

Sequenziamento + allineamento + chiamata varianti

Librerie genomiche

FENOTIPO GENOTIPO

NEXT–GENERATION-SEQUENCING

NGS

? Pazienti mitocondriali

?

? ? ?

? DIAGNOSI GENETICA

Frequenza nella popolazione (>1%)

Patogenicità delle varianti (sift/polyphen)

Fenotipo=Genotipo

Tipo di Ereditarietà

1381 geni nucleari mitocondriali ASSOCIATI/NON

ASSOCIATI MALATTIA

TARGETING RESEQUENCING 47 pazienti

5 NON ASSOCIATI A MALATTIA 18 GENI

Positivi

43% Negativi

57%

DIAGNOSI GENETICA (20 pazienti)

MITOEXOMA BGI

NGS si basa su 2 Approcci Whole-Exome-Sequencing (WES)

Targeting Resequencing

Kopajtich R, … Prokisch H. Mutations in GTPBP3 cause a mitochondrial translation defect associated with hypertrophic cardiomyopathy, lactic acidosis, and encephalopathy. Am J Hum Genet. 2014; 95(6):708-20. doi: 10.1016/j.ajhg.2014.10.017.

Brea-Calvo G, … Ghezzi D. COQ4 mutations cause a broad spectrum of mitochondrial disorders associated with CoQ10 deficiency. Am J Hum Genet. 2015; 96(2):309-17. doi: 10.1016/j.ajhg.2014.12.023.

Dallabona C, ... Bertini E. LYRM7 mutations cause a multifocal cavitating leukoencephalopathy with distinct MRI appearance. Brain. 2016 Mar;139(Pt 3):782-94. doi: 10.1093/brain/awv392.

Torraco A, … Carrozzo R. A novel mutation in NDUFB11 unveils a new clinical phenotype associated with lactic acidosis and sideroblastic anemia. Clin Genet. 2016 Apr 21. doi: 10.1111/cge.12790.

Di Nottia M., ... Carrozzo R. DJ-1 modulates mitochondrial response to oxidative stress: clues from a novel diagnosis of PARK7. Submitted to Clinical Genetics

Di Nottia M., … Carrozzo R. Novel homozygous mutation in mitochondrial Elongation Factor EF-Tu associated to leukodystrophy and defective mitochondrial DNA translation. Ready for submission

Torraco A, Ardissone A., … Ghezzi D, Carrozzo R. Novel mutations in IBA57 are associated with leukodystrophy and variable clinical phenotypes. Ready for submission

WHOLE-EXOME-SEQUENCING (WES) 13 PAZIENTI

SEQUENZIAMENTO DELL’INTERA PORZIONE CODIFICANTE IL GENOMA UMANO

BGI

Positivi

38%

In esame

62%

DIAGNOSI GENETICA (5 pazienti)

ACAD9

ELAC2

IBA57

FOXRED1

SLC16A2

File xls con elenco varianti Dati grezzi (Unità di Genomica; Dr. M. Tartaglia)

? ?

? ? Diagnostica “in house” Pannelli Targettati

Positivi

25%

Negativi

75%

PANNELLO mtDNA

PANNELLO mtDNA

16569 bp

“in house” DIAGNOSI GENETICA (8 pazienti analizzati)

POLG1, TWINKLE, RRMB2, TYMP, DGUOK

? ?

? ? Diagnostica “in house” Pannelli Targettati

PANNELLO mtDNA

PANNELLO nDNA

PANNELLO nDNA

“in house” GENI DELEZIONI

/DEPLEZIONE

DIAGNOSI GENETICA (40 pazienti)

Positivi

17%

Negativi

26% In esame

57%

? ?

? ? Diagnostica “in house” Pannelli Targettati

PANNELLO mtDNA

PANNELLO nDNA

TRUSIGHT-ONE

4813 GENI OMIM 400 GENI MITOCONDRIALI TRUSIGHT-ONE “in house”

- CI e CIV

1°es.

Fenotipo mitocondriale

- Cardiomiopatia

- Lieve ritardo psicomotorio

- Sintesi ATP normale nei fibro

KARS Lysil

tRNA-Synthase

FENOTIPI NEUROLOGICI

MAI A MALATTIA

MITOCONDRIALE

Ribonucleasi RNASEH2B SINDROME DI

AICARDI-GOUTIERES

GENOTIPO ..FENOTIPO

FENOTIPO ..GENOTIPO

2°es.

Fenotipo mitocondriale?

- Episodi febbrili simil-encefalitici

- Regresso psicomotorio - Tetraparesi spastica

Trusight-One Associata a…

Trusight one Associata a…

NGS => Improvement nella diagnostica

+ Accuratezza/efficienza

NGS => Improvement nella ricerca

Scoperta di nuove mutazioni in geni noti

Scoperta di mutazioni in nuovi geni

NUOVI TARGET

TERAPEUTICI

CONCLUSIONI

Riduzione dei costi

Velocizzare la diagnostica

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Settore Clinico - Enrico Bertini - Daria Diodato - Michela Catteruccia

Settore Istomorfologia

- Adele D’Amico - Margherita Verardo

Settore Enzimologia

- Fiorella Piemonte - Giulia Tozzi

GRUPPO MALATTIE MITOCONDRIALI

- Daniela Verrigni - Alessandra Torraco -Teresa Rizza - Michela Di Nottia - Daria Diodato - Rosalba Carrozzo

Unità di Malattie Muscolari e Neurodegenerative