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VIH genómica y proteómica
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VIH:Genómica, proteómica y diagnóstico
Dr. en C. Erwin ChiqueteMedicina InternaBiología Molecular en [email protected]
O.P.D. Hospital Civil de Guadalajara “Fray Antonio Alcalde”
Objetivos• Describir la estructura genética del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
• Referir el ciclo de vida del VIH en el humano.
• Describir el curso biológico de la infección por VIH.
• Analizar las estrategias de diagnóstico de la infección por VIH.
Antecedentes
En 1980 se publica por vez primera la existencia de un retrovirus humano: el HTLV.
En 1981 los CDC identificaron un grupo de homosexuales con una inusitada presentación clínica de inmunodeficiencia adquirida severa.
En 1983 se describe al VIH, como el agente causal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Pero no es sino hasta 1984 cuando se confirma la relación entre el VIH y el SIDA.
A partir de este momento, el panorama global de las enfermedades infecciosas cambia para siempre.
Antecedentes
Estudios de sueros con décadas de almacenamiento han revelado que de hecho el primer caso documentado de infección por VIH ocurrió en 1959 en África (República Democrática del Congo).
Antecedentes
Se estima actualmente que hasta el 40 millones de personas en el mundo podrían estar actualmente infectadas con el VIH.
La prevalencia es altamente variable, según la región estudiada.
Importancia
En EUA la prevalencia es de 0.3%, dando cuenta de unos 900,000 individuos actualmente afectados.
Importancia
En Latinoamérica, la prevalencia más alta de la infección por VIH se encuentra en los países más pequeños, Belice, Guatemala y Honduras, donde cerca del 1% o más de los adultos estaban infectados por el VIH a finales de 2003.
Importancia
En México se carece de estudios poblacionales amplios, pero estimaciones basadas en datos de bancos de sangre sugieren que la seroprevalencia puede oscilar entre 0.1 y 0.4%, según la región.
Importancia
El virus
El VIH pertenece a la familia de los retrovirus, y al subgrupo de los lentivirus.
Existen dos principales subespecies: el VIH-1 (más común) y el VIH-2.
Estos virus infectan a una gran variedad de especies de mamíferos incluyendo al hombre.
El virus
El virus
Existe evidencia convincente de que la infección por VIH-1 llegó al humano por el chimpancé (Pan troglodytes).
El VIH-2 provino de un macaco africano (Cercocebus atys).
El virus
Dadas las costumbres de alimentación en las regiones del centro y sur de África, la hipótesis más plausible del inicio de esta zoonosis establece que el VIH nació a partir del VIS (o SIV, en inglés), por el consumo de carne de primates inferiores infectados.
El virus
La infección por VIS en primates inferiores ya ha llegado al equilibrio (adaptación mutua de las especies). Sin embargo, la infección por VIH en el humano no.
El VIH-1 y el VIH-2 tienen un porcentaje de homología genética que va del 40 al 60%.
El ancestro humano más antiguo del VIH-1 se originó a principio de la década de 1930, mientras que el VIH-2 emergió en la de 1940.
El virus
El virus
HIV-2
SIVsm
SIVcpz
HIV-1Década de 1930
Década de 1940
• Su genoma es ARN sencillo, pero diploide.
• Tiene una capa proteica central interna que contiene al genoma y a enzimas clave.
• Además posee una cápside envuelta por una membrana doble de lípidos.
El virus
El virus
El virus: genoma
El VIH tiene sólo 9 genes (en carga diploide). Los genes gag, pol y env corresponden a las proteínas funcionales y estructurales. Los genes tat, rev, nef, vif, vpr y vpu (o vpx, para el VIH-2) corresponden a proteínas funcionales que controlan la habilidad para infectar la célula y producir nuevos viriones.
El virus: genoma
A cada lado del genoma del VIH existen regiones denominadas LTR (Long Terminal Repeats), que participan en el control de la replicación viral.
VIH y SIDA
Factores de riesgo
Usualmente el VIH entra al humano a través de mucosas, donde se encuentra con sus células hospederas (principalmente linfocitos CD4+), para pasar posteriormente a la circulación general.
También puede ocurrir que el VIH penetre directamente al torrente sanguíneo.
Factores de riesgo
Los factores de riesgo varían según la región, teniendo entre los más comunes:
• Relaciones sexuales sin protección de barrera con individuos infectados.
• Uso de drogas intravenosas (intercambio de agujas).
• Transfusión de productos sanguíneos antes de 1985-1986.
Factores de riesgo
Factor Probabilidad
Contacto sexual sin condón 1 / 558 (0.2%)
Accidente con punzocortantes 1 / 300 (0.3%)
Transmisión perinatal 23%
* Estas tasas correlacionan directamente con la carga viral, es decir, a más carga viral, más probabilidad de ser infectivo.
El ciclo de vida del VIH El VIH tiene como células hospederas a aquellas que porten en su membrana los receptores CD4 y los receptores de quimiocinas CXCR4 y CCR5.
Células como ciertos linfocitos (los CD4+, algunos CD8+, algunos NK, etc.), macrófagos, células dendríticas y algunas epiteliales poseen estos receptores, entre otras.
Erwin
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NH2 COOH
El ciclo de vida del VIH
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El VIH, si bien es un virus citopático, acaba con la vida de la célula hospedera por mecanismos diversos. Los dos más importantes son:
1. Autofusión de la membrana de la célula hospedera y la subsecuente lisis.
2. Expresión de antígenos virales y eliminación de las células infectadas por linfocitos T citotóxicos y NK).
El ciclo de vida del VIH
Sorprendentemente, el VIH tiene un mayor tropismo por linfocitos T CD4+ activados específicos (sensibilizados contra el VIH), que contra los no activados.
Se cree que en unos cuantos días después de la infección la población de linfocitos T CD4+ de las mucosas se agotan importantemente.
El ciclo de vida del VIH
En cambio, la población de linfocitos T CD4+ circulantes (menos del 2% del total del cuerpo) se van agotando poco a poco con los años.
El VIH se alberga con el tiempo sobretodo en el tejido linfático general, donde origina alteraciones estructurales características. Pero se encuentran nichos en SNC y tracto genito-urinario.
El ciclo de vida del VIH
La habilidad del VIH de permanecer latente en células del tejido linfoide por largos periodos explica varios fenómenos intrigantes:
• La hasta ahora imposible eliminación total y definitiva del virus.
• La emergencia de variantes resistentes a la terapéutica farmacológica.
El ciclo de vida del VIH
Con el tiempo, usualmente de 5 a 10 años, la población de linfocitos T CD4+ decrece dramáticamente; momento en que aparecen enfermedades oportunistas que ponen en peligro la vida del paciente.
El ciclo de vida del VIH
Con la aparición de la terapia antirretroviral altamente activa (HAART, por sus siglas en inglés) el curso clínico ha cambiado impresionantemente, con los siguientes beneficios:
El ciclo de vida del VIH
• Prolongación dramática de la expectativa de vida.
• Aumento del periodo libre de enfermedad.
• Mejora en la calidad de vida.
• Disminución del riesgo de infección a contactos de individuos infectados.
El ciclo de vida del VIH
Diagnóstico
Diagnóstico
Siempre usemos los datos clínicos
Diagnóstico
Las técnicas de diagnóstico se desarrollaron poco después de la identificación del VIH como agente causal del SIDA.
La detección de la infección se hace usualmente mediante análisis de una muestra de plasma o suero.
Diagnóstico
Las pruebas de diagnóstico son usadas en tres importantes rubros:
1. Detectar la infección activa.
2. Carga viral.
3. Estado del número de linfocitos T CD4+.
Diagnóstico
Las principales técnicas de detección de la infección por VIH radican en dos estrategias básicas:
1. Detección de anticuerpos anti-VIH (técnica indirecta).
2. Detección del ARN del VIH (técnica directa).
Detección de anticuerpos La detección de anticuerpos anti-
VIH ha evolucionado con el tiempo a ensayos más sensibles y específicos. Existen dos principales procedimientos:
1. Técnicas basadas en inmunoensayo (ELISA). Actualmente, EIA automatizado.
2. Técnicas basadas en hibridación de proteínas (Western blot).
ELISA
La prueba conocida como ELISA es altamente sensible, pero menos específica (falsos positivos pueden llegar al 2%).
Con el tiempo se han ido generando pruebas que aumentan su especificidad.
ELISA
En realidad en la actualidad el método usado es el EIA (con diversas variantes), que es un método automatizado con partículas en suspensión, no en sustrato sólido, como ocurre en el ELISA.
Por tradición, se le sigue conociendo como ELISA.
ELISA / EIA
Las técnicas de EIA se usan únicamente como de escrutinio o tamizaje (detección de posibles casos) y no para confirmar la presencia de infección por VIH. Por lo tanto es necesario el uso de un análisis confirmatorio complementario.
Western blot
La confirmación de la presencia de anticuerpos anti-VIH específicos se hace con la técnica conocida como Western blot (WB).
Con el WB se confirma que existen anticuerpos anti-VIH, mas no si el virus está presente en la sangre (viremia).
Western blot
El criterio usual para considerar un WB como positivo es el de la presencia de anticuerpos contra el antígeno p24 más anti- gp120/160 ó anti-gp41 más anti- gp120/160. Es decir, presencia de al menos 2 bandas positivas.
Los resultados posibles son: positivo, negativo ó indeterminado.
Western blot
Un resultado indeterminado (la presencia de anticuerpos contra un solo de los 3 antígenos) obliga a repetición de la prueba en 3 a 4 meses.
Western blot
Usando ELISA ó EIA más WB, la frecuencia de falsos positivos en poblaciones de alta prevalencia es de alrededor de 0.3%. En poblaciones de baja prevalencia es de 0.001%.
Western blot
Con las nuevas técnicas de ELISA/EIA y WB el periodo de ventana se ha reducido a 2 ó 3 semanas.
Detección del ARN
Las técnicas de detección del ARN del VIH se consideran confirmatorias de la presencia de viremia.
Estas técnicas pueden ser cualitativas o cuantitativas.
Detección del ARN
Las técnicas cualitativas arrojan resultados de positividad o negatividad y son más sensibles. El límite más bajo de detección de estas pruebas puede llegar a ser de 50 UI por mL de suero.
Existen ensayos manuales (caseros) o automatizados.
Detección del ARN La detección del ARN VIH se realiza
actualmente con una de tres maneras:
1. RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa con previa retrotranscripción).
2. TMA (Amplificación mediada por transcripción).
3. DNA-Branched (técnica de amplificación de la señal del ADN ramificado).
Detección del ARN
La técnica más usada en México es la basada en RT-PCR.
La RT-PCR puede ser cualitativa o cuantitativa.
La RT-PCR cuantitativa nos da información sobre la carga viral, es decir, nos arroja un resultado numérico (número de copias por mL).
Sin embargo, esta técnica es menos sensible que la cualitativa (el límite inferior es en general de 500 copias por mL), por lo que no debe ser usada para confirmar la infección por VIH.
Detección del ARN
Detección del ARN
La determinación de la carga viral (RT-PCR cuantitativa) puede expresar si el virus está presente en la sangre (pues da un valor numérico), pero no nos informa si el virus no está presente.
Por eso no debe ser usada para diagnosticar una infección.
Detección del ARN
La determinación de la carga viral se usa para valorar la respuesta al tratamiento durante y después del mismo, tomando una determinación de la carga viral basal (antes de iniciarlo).
También orienta respecto al estado clínico del paciente y la probabilidad de ser infectivo.
¿Cómo se hace el diagnóstico de la
infección por VIH?
Diagnóstico Primero es necesario tomar en cuenta los siguientes aspectos:
• La “serología” (detección de anticuerpos por EIA) es una prueba de escrutinio.
• El WB es una prueba para confirmar la presencia de anticuerpos.
• La RT-PCR confirma la presencia del ARN VIH en sangre (viremia) y sirve para valorar si un paciente ha respondido al tratamiento.
Algoritmo de diagnóstico
Positivo (2 ocasiones)Negativo
Nada WB
Positivo
PCR y carga viral
Seguimiento y vigilancia (repetir a los 3-4 meses)
Negativo
Determinación de anti-VIH por ELISA / EIA (serología)
NadaIndeterminado
Diagnóstico
Siempre usemos los datos clínicos
Conclusiones
• Las pruebas de diagnóstico son varias pero la información que nos ofrecen no es intercambiable, cada una ofrece datos distintos e importantes.
• El uso racional de las pruebas de diagnóstico nos puede llevar a una atención óptima del paciente.
• Debemos tomar en cuenta los datos clínicos para llegar a un mejor manejo del paciente.
Gracias
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