BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SỐNG

ĐỜI (KALANCHOE PINNATA) LÊN QUÁ TRÌNH TĂNG SINH TẾ BÀO CÓ NGUÔN GỐC TỪ DA CHUỘT NHẮT TRẮNG (MUS MUSCULLUS

VAR.ALBINO) SƠ CÂPHướng dẫn khoa học

Ths. LẠI ĐÌNH BIÊN

Sinh viên thực hiện

NGÔ QUỐC NGUYÊN

ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SỐNG ĐỜI

(KALANCHOE PINNATA) LÊN QUÁ TRÌNH TĂNG SINH TẾ BÀO CÓ NGUÔN GỐC TỪ

DA CHUỘT NHẮT TRẮNG (MUS MUSCULLUS VAR.ALBINO) SƠ CÂP

Giảng viên hướng dẫn

Ths. LẠI ĐÌNH BIÊN

Sinh viên thực hiện

NGÔ QUỐC NGUYÊN

Mã số SV: 2008100005

ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN

Mã số SV: 2008100084

Lớp: 01ĐHSH1

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

..........................................................................................................................................

TP. HCM,tháng 6 năm 2014Ký tên

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trinh học tâp, làm việc và hoàn thành khóa luân này, nhóm chúng

tôi đã nhân đươc sự hướng dẫn, giúp đơ quý báu cua các thây cô, các anh chi cùng các

bạn. Với long kinh trọng và biêt ơn sâu săc, chúng tôi xin đươc bày to lời cam ơn chân

thành tới:

Thạc sĩ – Lại Đình Biên, người Thây kinh mên đã hêt long hướng dẫn, giúp đơ và

tạo mọi điêu kiện thuân lơi cho nhóm chúng tôi thực hiện khóa luân tốt nghiệp.

Tâp thể các thây cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học và Kĩ thuât môi trường, đã

trang bi cho chúng tôi những kiên thức và kinh nghiệm quý giá trong quá trinh học tâp

tại trường và nhiệt tinh giúp đơ chúng tôi thực hiện đê tài này.

Tâp thể các bạn sinh viên khóa 01ĐHSH đã luôn giúp đơ và động viên chúng tôi

mỗi khi chúng tôi gặp khó khăn trong quá trinh làm việc.

Mặc dù đã có nhiêu cố găng, nhưng do thời gian có hạn, trinh độ, kỹ năng cua ban

thân con nhiêu hạn chê nên chăc chăn đê tài khóa luân tốt nghiệp này cua chúng tôi

không tránh khoi những hạn chê, thiêu sót, rất mong đươc sự đóng góp, chỉ bao, bổ

sung thêm cua thây cô và các bạn.

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi cam đoan rằng khóa luân tốt nghiệp này là do chinh chúng tôi thực hiện.

Các số liệu thu thâp và kêt qua phân tich trong báo cáo là trung thực, không sao chép từ

bất cứ đê tài nghiên cứu khoa học nào.

Tháng 6 năm 2014

Sinh viên thực hiện

NGÔ QUỐC NGUYÊN

ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN

MỤC LỤC

Trang bia lót

Nhân xét cua giáo viên hướng dẫn

Lời cam ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các bang biểu và sơ đồ

Danh mục các hinh anh và biểu đồ

PHẦN MỞ ĐẦU 1

Đặt vấn đê.....................................................................................................................2

Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................................... 2

PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................... 3

1.1 Đại cương vê mô da động vât................................................................................ 4

1.1.1 Các loại tê bào cua mô da................................................................................ 4

1.1.2 Cấu trúc mô da.................................................................................................5

1.2.1 Lich sử nuôi cấy tê bào.....................................................................................8

1.2.2 Đặc điểm cua tê bào động vât – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tê bào.........9

1.2.3 Các phương pháp tách tê bào từ mô sống......................................................11

1.2.4 Enzyme sử dụng trong tách tê bào.................................................................12

1.2.5 K ỹ thuât nuôi cây tê bào động vât................................................................14

1.2.6 Các yêu tố anh hưởng đên quá trinh nuôi cấy tê bào.....................................18

1.2.7 Tỉ lệ môi trường với mât độ tê bào đem nuôi, lương mô đem cấy.................22

1.2.8 Môi trường nuôi cấy.......................................................................................22

1.2.9 Ðánh giá tinh trạng tê bào nuôi cấy................................................................24

1.3 Đại cương vê nguyên bào sơi...............................................................................25

1.3.1 Nguồn gốc......................................................................................................25

1.3.2 Đặc điểm cua nguyên bào sơi.........................................................................25

1.3.3 Chức năng cua nguyên bào sơi.......................................................................26

1.3.4 Sơ lươc vê kinh nghiệm nuôi cấy nguyên bào sơi trên thê giới.....................26

1.3.5 Nguyên bào sơi trong các nghiên cứu và ứng dụng.......................................29

1.4 Sơ lươc vê cây sống đời (Kalachoe pinata).........................................................30

1.4.1 Nguồn gốc, phân bố và danh pháp cây sống đời............................................30

1.4.2 Đặc điểm hinh thái.........................................................................................31

1.4.3 Công dụng cua cây sống đời..........................................................................32

1.4.4 Thành phân hóa học trong cây sống đời.........................................................33

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................................34

2.1 Vât liệu..................................................................................................................35

2.1.1. Dụng cụ - thiêt bi...........................................................................................35

2.1.2 Hóa chât .........................................................................................................35

2.2 Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................36

2.2.1. Phương pháp thu nhân dich chiêt cây sống đời ............................................36

2.2.2. Phương pháp phân lâp và nuôi cấy nguyên bào sơi chuột từ da chuột ........38

2.2.3. Xử lý số liệu .................................................................................................43

PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................44

3.1 Thu nhân dich chiêt từ lá cây sống đời ................................................................45

3.2 Khao sát kha năng tách tê bào bằng phương pháp trypsin ấm và trypsin lạnh.....45

3.2.1 Trypsin ấm .....................................................................................................46

3.2.2 Trypsin lạnh ...................................................................................................47

3.3.1 Quá trinh tăng sinh và bám cua tê bào nguyên bào sơi chuột trong môi trường D’MEM 5% huyêt thanh tho...................................................................................50

3.3.2 Quá trinh tăng sinh cua tê bào nguyên bào sơi chuột trong môi trường D’MEM 5% huyêt thanh tho có bổ sung dich chiêt từ lá cây sống đời..................52

3.4. Khao sát nồng độ dich chiêt tối ưu khi bổ sung dich chiêt lá cây sống đời vào môi trường nuôi cấy....................................................................................................54

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................58

4.1 Kêt luân ................................................................................................................59

4.2 Kiên nghi .............................................................................................................59

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................60

PHỤ LỤC ......................................................................................................................61

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐÔ

Bang 1.4.3.1: Công dụng chữa bệnh cua cây sống đời.............................................32

Bang 1.4.4: Thành phân hóa học trong cây sống đời................................................33

Bang 2.2.2.4: Thi nghiệm khao sát nồng độ trypsin và phương pháp phù hơp để tách tê bào đơn......................................................................................................................40

Bang 3.2.1.1: Tổng mât độ tê bào đơn khi u với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau

..................................................................................................................................46

Bang 3.2.1.2: Mât độ tê bào đơn sống khi u với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau

...................................................................................................................................46

Bang 3.2.2.1: Tổng mât độ tê bào đơn khi u với trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau

...................................................................................................................................47

Bang 3.2.2.2: Mât độ tê bào đơn sống khi u với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau

...................................................................................................................................47

Bang 3.2.2.3: Xác đinh phương pháp phù hơp để tách tê bào đơn............................49

Sơ đồ 1.2.5: Quy trinh nuôi cấy sơ cấp.....................................................................16

Sơ đồ 2.2.1: Quy trinh thu dich chiêt từ lá cây sống đời...........................................37

Sơ đồ 2.2.2: Quy trinh phân lâp và nuôi cấy nguyên bào sơi từ da chuột.................43

DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐÔ

Hinh 1.1.1: Cấu tạo da.................................................................................................5

Hinh 1.1.2.1: Cấu trúc lớp biểu bi...............................................................................6

Hinh 1.1.2.2: Mô liên kêt trung bi...............................................................................7

Hinh 1.2.4.1: Cấu trúc không gian cua enzyme trypsin............................................13

Hinh 1.3.2: Cấu trúc nguyên bào sơi.........................................................................25

Hinh 1.4.1: Cây sống đời...........................................................................................31

Hinh 2.2.2.4: Buồng đêm hồng câu loại 25 ô lớn......................................................41

Hinh 3.1: Dich chiêt lá sống đời tươi........................................................................45

Hinh 3.2: Tê bào đươc nhuộm trypan blue................................................................46

Hinh 3.3.1.1: Tê bào nuôi ngày thứ nhất...................................................................50

Hinh 3.3.1.2: Tê bào nuôi ngày thứ ba......................................................................50

Hinh 3.3.1.3: Tê bào nuôi ngày thứ năm...................................................................51

Hinh 3.3.1.4: Tê bào nuôi ngày thứ bay....................................................................51

Hinh 3.3.1.5: Tê bào nuôi ngày thứ tám....................................................................52

Hinh 3.3.2.1: Tê bào nuôi ngày thứ nhất...................................................................52

Hinh 3.3.2.2: Tê bào nuôi ngày thứ ba......................................................................53

Hinh 3.3.2.3: Tê bào nuôi ngày thứ tư.......................................................................53

Hinh 3.3.2.4: Tê bào nuôi ngày thứ năm...................................................................54

Hinh 3.4.1: Tê bào nuôi ở nồng độ dich chiêt 10μl...................................................55

Hinh 3.4.2: Tê bào nuôi ở nồng độ dich chiêt 20μl...................................................55

Hinh 3.4.3: Tê bào nuôi ở nồng độ dich chiêt 30μl...................................................56

Hinh 3.4.4: Tê bào nuôi ở nồng độ dich chiêt 60μl...................................................56

Đồ thi 3.2.1: Mât độ tê bào đơn sống khi u với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau

...................................................................................................................................47

Đồ thi 3.2.2.1: Mât độ tê bào đơn sống khi u với trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau

...................................................................................................................................48

Đồ thi 3.2.2.2: So sánh mât độ tê bào đơn sống khi u với trypsin ấm và trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau..............................................................................................49

PHẦN MỞ ĐẦU

1

Đặt vấn đề

Với quan niệm “ nhất dáng nhi da” thi da xêp thứ hai để quan sát và đánh giá vẻ đẹp cua một con người. Hiện nay do kinh tê xã hội phát triển nên nhu câu thẩm mỹ vê da ngày càng phát triển, đặc biệt nhu câu thẩm mỹ trong điêu tri bong. Chinh vi những lý do đó các nhiêu nghiên cứu vê tri bong tức thời và lâu dài bằng cách tạo vât liệu sinh học tri bong hay da nhân tạo để ghép tự thân. Hiện nay, những vât liệu sinh học có bổ sung hoạt chất tự nhiên để tri bong với những ưu điểm như kháng viêm, kháng khuẩn, tinh sinh miễn dich thấp… trong việc tạo da nhân tạo bằng nuôi cấy tê bào da để ghép tự thân đang là tiêu chuẩn vàng để tạo vêt da đẹp và liên không có vêt sẹo. Trên thê giới, công nghệ này liên tục đươc nghiên cứu hoàn chỉnh vê quy trinh công nghệ nuôi cấy tê bào. Nhiêu nước đã đạt những tiên bộ vươt bâc trong điêu tri bong và tổn thương mất da, nhiêu nạn nhân bong sâu và rộng trên 70% diện tich đã đươc cứu sống cũng như giam thiểu các di chứng nặng do mất da để lại.

Tại Việt Nam là một nước rừng nhiệt đới nên có rất nhiêu loại cây co và hoạt chất ứng dụng trong tri bong. Hiện nay các nghiên cứu vê sử dụng hoạt chất thiên nhiên ứng dụng trong tri bong ngày càng nhiêu dựa theo các phương pháp dân gian thi các cây có ứng dụng tri bong giúp tri lành vêt thương như dâu mù u, cu nghệ, mơ trăn cây sống đời…. Trong các loại cây, thi chỉ có vài cây đươc khoa học nghiên cứu và khăng đinh tinh năng tri bong như dâu mù ứng dụng trong việc tạo màng sinh học trong tri bong , cucurmine trong cu nghệ ứng dụng trong mỹ phẩm có chức năng tri lành vêt thương. Tuy nhiên, cây sống đời một loại cây cũng đươc dân gian sử dụng nhiêu trong tri bong lại chưa có đê tài và sự nghiên cứu vê công dụng tri bong cua nó chinh vi vây chúng tôi tiên hành đê tài : “Khảo sát sự ảnh hưởng của dịch chiết từ lá cây sống đời (Kalanchoe pinnata) lên quá trình tăng sinh tế bào nguyên bào sợi da chuột nhắt trắng (Mus muscullus var.albino)” .

Mục tiêu nghiên cứu

Khao sát kha năng tách cua tê bào bằng hai phương pháp trypsin ấm và trypsin lạnh.

Khao sát kha năng bám và tăng sinh cua tê bào sau thời gian nuôi cấy trong môi trường có bổ sung dich chiêt.

2

Xác đinh nồng độ dich chiêt tối ưu cho kha năng bám dinh cua tê bào nguyên bào sơi chuột trong giai đoạn nuôi sơ cấp.

Từ những yêu tố trên chúng tôi sẽ xây dựng đươc quy trinh phân lâp, và nuôi cấy tê bào nguyên bào sơi da có bổ sung dich chiêt cây sống đời trong môi trường nuôi cấy.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1 Đại cương vê mô da động vât [3]Da là mô lát tâng, là một loại mô liên kêt biểu bi. Cấu trúc cua da có một điểm đặc

biệt là chúng có nhiêu lớp tê bào, trong đó các lớp ngoài luôn bi thoái hóa, bong ra và thay thê bằng các lớp tê bào bên dưới. Nguồn gốc cua sự thay mới thường xuyên này là do một lớp tê bào cua da ở vi tri tiêp giáp với mô liên kêt có kha năng thường xuyên tạo tê bào mới. Đây chinh là tê bào mâm cua cơ thể trưởng thành, có kha năng tạo thành những dong tê bào ổn đinh phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng. Chinh vi vây, da có tiêm năng lớn trong công nghệ tê bào.

1.1.1 Các loại tế bào của mô da1.1.1.1 KeratinocyteTê bào keratin (keratinocyte) thường thấy ở lớp biểu bi – lớp ngoài cùng cua da.

Keratinocyte chiêm đa số trong biểu bi. Các keratinocyte trưởng thành khi nó di chuyển từ tâng dưới lên để hinh thành tâng mới bên trên. Keratinocyte xây dựng một khung tê bào rất vững chăc nhờ thay đổi sự biểu hiện cua các loại vi sơi keratin từ keratin 5 và 14 thành keratin 1 và 10. Keratinocyte có kha năng san xuất ra protein có vo keratin như involucrin và loricrin cho việc chuẩn bi hinh thành tê bào sừng (corneocyte). Keratin do keratinocyte tạo ra luôn có xu hướng tich lũy theo hướng lên trên, do đó các tê bào ở phia trên cua lớp biểu bi thường tich lũy nhiêu keratin và tạo thành tâng sừng. Sự tich lũy chất keratin trong các tê bào cua lớp biểu bi tạo nên sự sừng hóa tê bào.

1.1.1.2 Fibroblast (nguyên bào sơi)Fibroblast là những tê bào có kha năng tạo sơi. Fibroblast thường thấy ở lớp da

chinh thức.1.1.1.3 Melanocyte (hăc tố bào)Melanocyte là loại tê bào có trong mô biểu bi với mât độ khá it, thường tâp trung ở

tâng sinh san. Melanocyte tạo màu cho da, lông, tóc nhờ tạo ra các hạt săc tố melanin và ngấm vào keratin.

1.1.1.4 Tê bào LangerhansTê bào Langerhans là những đại thực bào (macrophage) có hinh sao, có vai tro

trong miễn dich.1.1.1.5 Tê bào MerkelTê bào Merkel là những tê bào it phân bố trong mô biểu bi, chúng tâp trung chu yêu

ở lớp da chinh thức. Tê bào Merkel là loại tê bào thân kinh làm nhiệm vụ thụ quan cam giác, có kha năng tra lời các kich thich nhiệt độ, áp suất, xúc giác…

4

1.1.2 Cấu trúc mô da [3]Da do mô liên kêt và biểu mô tạo nên, có cấu tạo nhiêu lớp:

Hình 1.1.2 Cấu tạo da1.1.2.1 Lớp biểu biLớp ngoài cùng cua da, gồm nhiêu lớp tê bào mô xêp dinh chặt với nhau, dày từ

0,07 đên 1,8mm. Lớp biểu bi gồm 5 lớp tê bào: lớp mâm, lớp gai, lớp hạt, lớp bóng và lớp tê bào sừng.

Lớp mâm (stratum germinatum)Lớp mâm đươc tạo thành bởi một hàng tê bào khối vuông và trụ có kha năng phân

chia liên tục, san sinh ra các tê bào cho lớp biểu bi. Gồm các loại tê bào: tê bào sừng, tê bào hăc săc tố, tê bào Langerhans và tê bào Merkel.

Lớp gai (stratum spinosum hoặc filamentosum)Gồm các tê bào có hinh khối đa điện, nhân tron, nằm trên lớp đáy, có 7 – 15 tâng tê

bào. Những kẽ trống giữa các tê bào này chứa dich nuôi đươc tạo ra từ lớp nhú cua trung bi để trao đổi dinh dương với tê bào biểu bi. Các khe trống này bao đam cho sự chuyển hóa, tăng trưởng và biệt hóa cua các tê bào sừng. Các đâu tân cùng cua dây thân kinh nhân cam giác đau cũng nằm rai rác trong các khe này.

Lớp hạt (stratum granulosum)

5

Gồm những tê bào dẹt có nhân chứa các chất sừng trong suốt. Các tê bào này không chỉ tổng hơp, biên hóa và nối tiêp chéo các protein mới trong quá trinh sừng hóa mà con làm nhiện vụ tự huy theo chương trinh để biên từ tê bào hạt thành tê bào sừng.

Lớp bóng (stratum lucidum)Là lớp tê bào trong suốt, đươc hinh thành tạo nên từ lớp đáy, các lớp tê bào già

đươc đẩy dân ra khoi môi trường nuôi dương và sự biệt hóa cũng hoàn thành. Lớp bóng nằm ngay dưới lớp tê bào sừng, có chức năng giữ cho da không bi mất nước và bao vệ lớp tê bào phia dưới đối với các tác động cơ học.

Lớp sừng (stratum corneum)Là lớp ngoài cùng có 15 – 20 tâng tê bào, có hinh khối dẹt rộng, hoặc hinh đa điện.

Các tê bào này đã mất kha năng sống, hoàn toàn sừng hóa. Chúng dinh chặt vào lớp tê bào trong suốt tạo thành một lớp bao vệ ngoài cùng cua da.

Hình 1.1.2.1 Cấu trúc lớp biểu bì

1.1.2.2 Lớp trung bi (dermis)Trung bi nằm dưới lớp biểu bi, dày từ 0,7 – 7mm, dày hơn chiêu dày cua biểu bi từ

15 – 40 lân. Trung bi là một lớp xơ rất chăc, đươc tạo nên từ các chất nên (chất gian bào), các tê bào liên kêt, bó sơi liên kêt, sơi đàn hồi, các tuyên ống, cơ dựng nang lông, mạch máu và dây thân kinh. Nguyên bào sơi đươc coi là tê bào chu cua trung bi, chúng san sinh ra chất keo mạng lưới (reticular collagen), các sơi đàn hồi và các chất nên cua trung bi. Trung bi gồm hai lớp: lớp nhú và lớp lưới.

Lớp nhú

6

Là một lớp tê bào mong, nằm sát ngay dưới màng nên và lớp tê bào mâm cua lớp đáy hinh thành nhiêu gai nhú gồ lên hinh làn sóng. Lớp nhú có các sơi tơ tạo keo, sơi tơ đàn hồi, chất keo đặc giữa các sơi tơ và các tê bào liên kêt, bạch câu, tê bào Langerhans… Lớp nhú là nơi trao đổi các yêu tố tăng trưởng, cytokine và các chất cơ ban cua trung bi găn kêt với các tê bào biểu bi qua thụ cam xuyên màng.

Lớp lưới (reticular dermis)Có chiêu dày 4 – 5mm, có it tê bào và mạch hơn lớp nhú. Lớp lưới chứa các bó sơi

liên kêt gồm các sơi tạo keo, sơi đàn hồi, các sơi băt màu bạc. Lớp lưới chia làm hai vùng: vùng trên (nông) có nhiêu tê bào liên kêt, nguyên bào sơi, tê bào viêm, các bó keo, các sơi chun dãn xêp theo hướng ngang và vùng dưới (sâu).

Chức năng cua lớp lưới là làm nên cho da bên chăc.

Hình 1.1.2.2 Mô liên kết trung bì1.1.2.3 Lớp hạ bi (hypodermis, subcutis)Là một lớp mô liên kêt – mơ, dày 0,25mm đên vài cm. Hạ bi gồm 3 lớp: lớp mơ,

lớp chân nông và lớp tê bào dưới da.- Lớp mơ: các bó xơ dày to hinh nón quây thành những khoang chứa các tê bào

mơ. Chúng góp phân tạo hinh, dự trữ năng lương và cách nhiệt.- Lớp chân nông: có chỗ dày tới 1mm.- Lớp tê bào dưới da: là mô liên kêt long lẻo, làm cho da dễ dàng di động trên cơ,

gân, xương. Các tổ chức tê bào long lẻo này có kha năng thấm nước và các chất hoa tan cua dich.

7

1.2 Sơ lươc vê nuôi cấy tê bào1.2.1 Lịch sử nuôi cấy tế bào [7, 10, 21]

Năm 1883, người ta có thể duy tri đươc các tê bào phôi gà trong dung dich nước muối.

Năm 1709, Harrison đã tách tê bào thân kinh êch và nuôi trong môi trường bạch huyêt. Sau vài tuân nuôi cấy, ông thấy có sự xuất hiện và tăng trưởng những tê bào này trên mẫu cấy.

Năm 1910, Roux tiêp tục nghiên cứu trên những tê bào ung thư ở gà.Năm 1913, Carrel và công sự đã làm nhiêu thi nghiệm chứng minh đươc tê bào

động vât hoàn toàn có thể sống đươc một khoang thời gian dài trong điêu kiện in vitro, nêu thường xuyên cung cấp các chất dinh dương vô trùng cân thiêt. Đên năm 1923, ông thiêt kê ra hộp chuyên sử dụng để nuôi cấy mô động vât trong điêu kiện vô trùng gọi là hộp Carrel.

Năm 1948, Earle đã tiên hành phân lâp các tê bào và nuôi cấy chúng trong điêu kiện môi trường đặc biệt.

Năm 1952, Grey đã tách và nuôi thành công tê bào ung thư cổ tử cung người (HeLa). Đây là một trong những dong tê bào tốt nhất đươc tạo ra đâu tiên trên thê giới từ khối u cổ tử cung cua một phụ nữ 31 tuổi tên Henrietta Lacks.

Năm 1954, Levi – Moutalcini đã nghiên cứu sự anh hưởng cua các chất điêu hoa tăng trưởng lên kha năng phát triển cua tê bào trong nuôi cấy in vitro.

Năm 1955, Eagle và năm 1965, Ham đã tim đươc môi trường và quy trinh nuôi cấy thich hơp cho nhiêu loại mô khác nhau cua người và động vât.

Năm 1961, I.A.Macpherson và M.G.P. Stoker tạo đươc dong nguyên bào sơi thân chuột đồng con (BHK-21). Dong tê bào đươc sử dụng rộng rãi là dong 13 từ thân cua 5 con chuột một ngày tuổi chưa xác đinh giới tinh, những chú chuột đồng này thuộc loài Mesocriteus auratus. Công việc nuôi cấy tiên hành liên tục trong 84 ngày và dong 13 đươc phân lâp từ tê bào đơn.

Năm 1962, George Todaro và Howard Green đã tạo đươc dong nguyên bào sơi phôi chuột (3T3) từ mô phôi cua chuột Mus. musculus. Dong tê bào này đươc ứng dụng trong nghiên cứu các protein cơ ban cua sơi myelin.

Năm 1964, J. Ponten và E. Saksela đã tạo ra dong tê bào ung thư xương người (U-2 OS), có nguồn gốc từ dong 2T đươc phân lâp từ mô xương cua một bé gái 15 tuổi bi bệnh vê xương.

8

Năm 1966, J.P. Jacobs tạo ra dong nguyên bào sơi phổi bào thai người (MRC-5) từ khối u mô phổi thai nhi 14 tuân tuổi. Dong tê bào này đươc sử dụng trong việc phát triển vaccine, trong chuyển nhiễm tê bào chu để nghiên cứu virus và kiểm tra cytotoxic in vitro.

Năm 1972, D.J. Giard và cộng sự đã tạo đươc dong tê bào ung thư biểu mô phổi người (A-549) từ khối u cua biểu mô phổi ở một nam giới người Caucasian 58 tuổi. Dong tê bào này đươc dùng để nghiên cứu vê những bệnh có liên quan đên hệ hô hấp.

Từ năm 1970 – 1980, san xuất đươc kháng thể lai đơn dong.Từ năm 1987 – 1995, kỹ thuât tái tổ hơp DNA đã tạo ra nhiêu loại san phẩm sinh

học từ các tê bào biên đổi di truyên.Sự phát triển cua nuôi cấy mô như là một kĩ thuât tinh vi hiện đại nhờ vào sự cân

thiêt cua hai nhánh chinh nghiên cứu vê y học: tạo vaccine kháng virus và nghiên cứu vê ung thư. Sự tiêu chuẩn hóa các điêu kiện và các dong tê bào để san xuất và thi nghiệm virus rõ ràng đã thúc đẩy sự phát triển cua kỹ thuât nuôi cấy mô hiện đại, cụ thể là tạo ra một lương lớn tê bào phù hơp cho các phân tich sinh hóa. Cùng với sự phát triển cua những kỹ thuât khác đã tạo nên những san phẩm môi trường và huyêt thanh đáng tin cây đươc thương mại hóa, và kiểm soát tốt hơn vê ngoại nhiễm với các kháng sinh và thiêt bi làm sạch không khi, làm nuôi cấy mô có thể đươc quan tâm rộng rãi.

1.2.2 Đặc điểm của tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào1.2.2.1 Sự điêu hoa trao đổi chất [11]Quá trinh trao đổi chất cua cơ thể đươc tâp trung chu yêu ở trong từng tê bào. Sự

chuyển hóa vât chất chu yêu xay ra trong tê bào và có tinh quyêt đinh đên sự tồn tại cua cơ thể sống.

Ở vi sinh vât, quá trinh trao đổi chất là quá trinh xay ra giữa tê bào và môi trường sống. Do đó, ngoài các yêu tố anh hưởng từ bên ngoài (nhiệt độ, pH, nồng độ các chất dinh dương, các chất độc…), tê bào con phụ thuộc rất nhiêu vào các hoạt động cua enzyme.

Ở tê bào thực vât, ngoài tác động cua enzyme, quá trinh trao đổi chất con chiu tác động rất mạnh bởi hệ dich bao quanh tê bào.

Ở tê bào động vât, ngoài tác động cua enzyme, hệ dich quanh tê bào như ở thực vât, chúng con bi tác động rất mạnh cua hệ thân kinh. Hệ thân kinh thu nhân những phan xạ phong phú từ bên ngoài và bên trong tê bào, điêu khiển một cách hài hoa toàn bộ quá trinh trao đổi chất ở tê bào. Sự rối loạn quá trinh trao đổi chất ở tê bào có liên quan rất

9

chặt chẽ với sự điêu khiển từ hệ thân kinh. Do đó, việc điêu khiển trao đổi chất cua tê bào động vât trong cơ thể sống trở nên hêt sức phức tạp.

Tuy nhiên, việc điêu khiển dinh dương tê bào trong nuôi cấy in vitro khác quá trinh dinh dương tê bào trong cơ thể. Khi nuôi cấy tê bào in vitro, các quá trinh trao đổi chất cua tê bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm cua một tê bào độc lâp, không tuân theo quy luât cua mô và cua cơ thể đa bào. Việc nuôi cấy tê bào động vât đươc thực hiện trên cơ sở điêu khiển quá trinh tổng hơp enzyme và các hoạt động cua enzyme, đây cũng là hai yêu tố quyêt đinh kha năng phát triển cua tê bào, kha năng tạo ra những san phẩm trao đổi chất cua tê bào, cũng như kha năng phân chia tê bào.

Trong quá trinh phát triển cua tê bào, có hai vấn đê anh hưởng quyêt đinh đên kêt qua:

- Ban chất tự nhiên cua tê bào, hay nói cách khác là nguồn gốc cua tê bào.- Những yêu tố môi trường quyêt đinh đặc trưng riêng biệt cua tê bào.

Sự hiểu biêt nguồn gốc cua tê bào giúp ta đinh hướng san phẩm cuối, con sự hiểu biêt vê đặc trưng riêng biệt giúp ta điêu chỉnh (hay điêu khiển) để tinh trạng đó đươc biểu hiện ra trong quá trinh nuôi cấy.

Trong nuôi cấy tê bào in vitro có những yêu tố hoàn toàn khác với sự phát triển cua chinh tê bào đó trong cơ thể. Mọi yêu tố tác động lên tê bào nuôi cấy in vitro là những tác động trực tiêp. Con khi phát triển trong cơ thể, các tê bào này không chỉ chiu tác động trực tiêp mà con chiu những tác động gián tiêp. Do đó, mọi tác động cua môi trường đên tê bào nuôi in vitro xay ra rất nhanh và mãnh liệt, cân tạo ra sự hài hoa trong mọi tác động đên sự trao đổi chất cua tê bào đươc nuôi cấy.

1.2.2.2 Tinh chất cơ học yêu [8]Ở tê bào vi sinh vât, tê bào đươc bao bọc bởi thành tê bào – đươc cấu tạo từ những

hơp chất hữu cơ khá bên, khó bi phân huy khi tê bào con đang phát triển. Ở tê bào thực vât, thành tê bào con đươc cấu tạo bởi hơp chất lignocellulose hay pectinocellulose, các hơp chất này tạo ra tinh chất cơ học, hóa học, vât lý khó bi phân huy hơn rất nhiêu so với cấu trúc thành tê bào cua vi sinh vât.

Tê bào động vât hoàn toàn không có thành tê bào, mà chúng chỉ đươc bao bọc bởi một màng tê bào – thành phân duy nhất ngăn cách giữa tê bào với các tê bào khác trong mô. Mặt khác, kich thước tê bào động vât thường rất lớn, trung binh khoang 10 μm, lại không có vách nên tê bào động vât có tinh chất cơ học yêu. Do đó, khi nuôi cấy cân nhẹ nhàng, tránh sự phá vơ tê bào (Phan Kim Ngọc, 2002).

10

1.2.2.3 Kha năng phân chia và tốc độ tăng trưởng rất châm [7]Do đặc điểm di truyên, các tê bào vi khuẩn thường phân chia với tốc độ rất nhanh,

khoang 20-50 phút. Ở động vât và thực vât, một chu kỳ tê bào thường kéo dài 20-70 giờ (Nguyễn Đức Lương và Lê Thi Thuy Tiên, 2002). Nêu trong một điêu kiện nào đó, một loại tê bào trong cơ thể đa bào lại tăng số lương một cách bất thường, cơ thể sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý.

1.2.2.4 Cân giá đơ trong quá trinh phát triển, nhân đôi [8]Trừ tê bào máu và một số giai đoạn cua tê bào sinh dục, hâu hêt các mô và tê bào

động vât cân bám vào giá đơ để có thể sống và phân chia. Tê bào sẽ ngừng phân chia khi đã hinh thành một lớp đơn liên tục trên bê mặt cua dụng cụ nuôi. Tuy vây, một số dong tê bào như tê bào ung thư hoặc dong tê bào liên tục từ mô binh thường (sau khi đươc thuân hóa) có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng, không cân bám vào giá đơ.

1.2.2.5 Chiu anh hưởng rất mạnh bởi san phẩm trao đổi chất cua chúng [11]Đây là cơ chê kiêm hãm ngươc bởi san phẩm cuối (negative feed – back). Bất kỳ tê

bào sinh vât nào cũng biểu hiện cơ chê này, điểm khác biệt cua tê bào động vât là ở chỗ quá trinh tổng hơp san phẩm thừa it xay ra và thường thi các san phẩm trao đổi chất thoát ra khoi tê bào rất châm.

1.2.2.6 Kha năng tiêp nhân gene lạ [11]Xét vê cấu trúc tê bào, tê bào động vât đươc xem như một loại tê bào trân tự nhiên.

Chúng đươc bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do đó, trong trường hơp chúng tồn tại ở trạng thái tự do, chúng có kha năng nhân dong thông tin di truyên lạ (từ virus…) hoặc khi cho những tê bào động vât có thông tin di truyên khác nhau ở gân nhau, sẽ xay ra hiện tương trao đổi vât chất di truyên tạo ra các tê bào lai.

1.2.2.7 Kha năng bao quan trong điêu kiện nhân tạo [11]Khác với tê bào vi sinh vât và tê bào thực vât, tê bào động vât cân phai đươc bao

quan trong những điêu kiện hêt sức đặc biệt mới có thể giữ đươc những đặc tinh riêng cua nó.

Bằng cách sử dụng Nitrogen long (-1960C), tê bào động vât vẫn duy tri đươc đặc tinh cua chúng trong thời gian rất dài. Phương pháp này đươc áp dụng nhiêu ở các ngân hàng giống động vât trên thê giới.

Khi sử dụng, tê bào động vât đươc tiên hành giai đông và đươc hoạt hóa để phục hồi kha năng tăng trưởng và phân chia như trước khi đem bao quan.

11

Ngoài ra, tê bào động vât rất kém thich nghi với điêu kiện môi trường, rất nhạy cam với kim loại. Trong quá trinh phát triển trong môi trường nhân tạo, chúng rất cân huyêt thanh, hormone.

1.2.3 Các phương pháp tách tế bào từ mô sống [3, 20 ]Các tê bào trong mô sống thường găn kêt chặt chẽ với nhau nên không thể nuôi cấy

trong môi trường nhân tạo. Chinh vi vây cân phai tách rời các tê bào tạo thành dich tê bào trước khi chuyển sang nuôi cấy. Có hai phương pháp để tách tê bào từ mô sống:

- Phương pháp cơ học: Sử dụng để tách các mô có liên kêt giữa các tê bào tương đối long lẻo như mô tuy xương, các mô mêm như mô não. Nguyên tăc để tách tê bào bằng phương pháp cơ học là dùng lực cơ học đẩy mô qua các rây kin loại có đường kinh lỗ tương ứng với kich thước tê bào cân tách. Phương pháp cơ học có ưu điểm là không tốn kém, dễ thực hiện tuy nhiên chỉ thich hơp với một số loại mô.

- Phương pháp enzyme: Các liên kêt giữa các tê bào mô sống cua động vât đêu có ban chất protein. Phương pháp tách tê bào bằng enzyme sử dụng các protease để phân căt protein cua các liên kêt này từ đó tách rời các tê bào.

1.2.4 Enzyme sử dụng trong tách tế bào [3]Vê nguyên lý, tất ca các enzyme thuy phân protein đêu có thể tham gia tách tê bào.

Một số protease như dipase I và II, pronase, papain… đã đươc sử dụng trong tách tê bào. Ưu điểm cua các enzyme này là chúng có nguồn gốc không phai từ động vât và có thể sử dụng chúng với sự hiện diện cua huyêt thanh. Nhưng chúng lại không bi bất hoạt bởi huyêt thanh, dẫn đên phai loại bo chúng thông qua việc rửa tê bào sau khi tách – quá trinh này có thể làm tổn thương tê bào.

Trypsin là enzyme có thể khăc phục đươc các nhươc điểm kể trên do sau khi sử dụng nó có thể bi bất hoạt dễ dàng bằng huyêt thanh. Phương pháp trypsin hóa đươc Litwin (1971) tiêu chuẩn hóa trong sự tách tê bào và nuôi cấy fibroblast lương bội ở người.

1.2.4.1 Cấu trúc cua enzyme trypsin

Trypsin là một serine protease gồm một chuỗi polypeptide gồm 249 acid amin, trọng lương phân tử khoang 22 680 – 23 400 Dalton. Serine protease thuộc họ enzyme proteolyse, sử dụng cơ chê phan ứng xúc tác nucleophile (ưa hạt nhân), với gốc serine như là nucleophile phan ứng.

12

Hình 1.2.4.1 Cấu trúc không gian của enzyme trypsin

Các thành viên cua họ này đươc biêt đên nhiêu nhất là ba enzyme trypsin, chymotrypsin và elastase. Chúng tạo thành một nhóm thực hiện nhiệm vụ tiêu hóa trong cơ thể động vât.

Môi trường thich hơp cho hoạt động cua trypsin là môi trường acid yêu, có pH từ 6,9; tối ưu ở 8,9. Hoạt tinh cua trypsin bi kiêm hãm bằng huyêt thanh thai bo hoặc di – isopropyl fluoro phosphate (DFP). Canxi đươc xem như chất bao vệ cho trypsin, hoạt tinh xúc tác cua trypsin giam 50% khi thiêu Ca2+.

1.2.4.2 Cơ chê tác động cua trypsin trong quá trinh tách tê bàoVi tri tác động cua enzyme trên phân tử proteinTrypsin, chymotrypsin và elastase đêu là các endopeptidase, căt chuỗi protein tại

các nối peptide bên trong mạch.Mỗi enzyme có vi tri căt ưa thich tại mạch nối kê cân với kiểu gốc amino acid đặc

trưng. Trypsin căt nối peptide ngay tại các nhóm carbonyl cua gốc amino acid base (lysine hay arginine)

Tác động cua enzyme tách tê bào lên tê bào nuôi cấyTrypsin không tách tê bào từ bê mặt nhưng dẫn đên sự cuộn tron tê bào. Nó khởi

đâu hoạt động trên khung tê bào cũng như trên các thành phân bê mặt cua phức màng tê bào – khung tê bào.

Các nghiên cứu cua Bailey và cộng sự (1980) cho thấy trypsin làm phân tán các sơi căng nhằm thay đổi hinh dạng tê bào. Khi tê bào co lại, màng tê bào trở nên bi nhúm lại với nhiêu lỗ rỗng và vi sơi. Quá trinh này dân dân làm tê bào cuộn tron. Trong quá trinh cuộn tron, vi tri và sự hơp nhất cua các vi tri dinh đươc duy tri. Bê mặt chất nên đươc bao phu bởi các chất con lại cua các sơi co lại và các cấu trúc giống như tấm nho.

13

Các tê bào đươc làm tron này đươc găn kêt rất long lẻo và cuối cùng có thể dễ dàng tách ra bằng các biện pháp cơ học.

Tuy nhiên sự kéo dài xử li trypsin sẽ tạo tổn thương cho tê bào. Ngoài tổn thương bê mặt, trypsin con tạo sự tổn thương bên trong chăng hạn như sự thuy phân polyribosome. Các nghiên cứu cua Hodges và cộng sự (1973) trên tê bào Hela và tê bào thân CBM17 ở chuột cho thấy trypsin đánh dấu có thể tim thấy bên trong tê bào chất, nhân và hạch nhân cua tê bào nuôi cấy. Để giam tiêm năng gây tổn thương tê bào cua trypsin, McKeehan (1977) đã nghiên cứu và đê ra biện pháp giam nhiệt độ trong quá trinh trypsin hóa. Nói chung, trypsin đươc sử dụng ở khoang nồng độ từ 0,01% - 0,5%. Thường nồng độ sử dụng là 0,25% trong thời gian là 5 – 15 phút.

Quá trinh trypsin hóa cũng chiu anh hưởng cua pH, pH thuân lơi cho hoạt động cua trypsin trong quá trinh tách tê bào ở khoang 7,4 – 8,0.

Tê bào bi tổn thương do quá trinh trypsin hóa có thể phục hồi sau khi bất hoạt trypsin. Tuy nhiên, khi sử dụng môi trường không huyêt thanh việc bất hoạt trypsin có thể đươc thực hiện bằng việc sử dụng chất ức chê trypsin hoặc rửa tê bào nhiêu lân.

1.2.5 K ỹ thuật nuôi cây tế bào động vật [17]Phương pháp chinh trong nuôi cấy tê bào động vât có vú để san xuất các san phẩm

sinh - dươc là dựa trên cơ sở nuôi cấy dich huyên phù trong hệ lên men. Từ lâu, hệ lên men đã đươc sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men. Đâu tiên, sự lên men là thuât ngữ dùng cho san xuất cồn. Sau đó, các nhà vi sinh vât học ứng dụng các nguyên tăc trên để tách chiêt các vitamin, các acid hữu cơ và các kháng sinh… Kêt qua dẫn đên sự phát triển nhanh chóng các phương pháp và các hệ thống lên men khác nhau.

Các nguyên lý tương tự sau đó đươc ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối tê bào động vât và thực vât. Tuy nhiên, nuôi cấy các tê bào động vât và thực vât khó khăn hơn nhiêu so với vi sinh vât, cái chinh là do quá trinh trao đổi chất trong các loại tê bào này diễn ra châm, điêu này cũng phan ánh tốc độ sinh trưởng châm cua tê bào. Các tê bào động vât có nhu câu dinh dương phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm men, chúng không có thành tê bào như vi khuẩn vi thê rất dễ biên dạng và vơ. Do đó, các hệ thống khuấy và sục khi đươc thiêt kê khác với nuôi cấy vi khuẩn. Mặc dù có một số điểm không thuân lơi, nhưng hệ thống lên men đã đươc sử dụng để nuôi cấy tê bào động vât it nhất cũng vài chục năm trước đây. Các dong tê bào khác nhau như BHK-21, LS, các tê bào Namalwa… đã đươc sinh trưởng trong hệ lên men theo phương thức nuôi cấy chim ngâp trong môi trường để san xuất các viral vaccine và các san phẩm khác.

14

Đặc điểm dễ biên dạng và dễ vơ cua tê bào động vât đã đươc khăc phục bằng cách đưa vào các cánh khuấy có dạng hinh mái chèo. Việc cung cấp khi trực tiêp có thể tạo ra bọt khi dễ làm vơ tê bào, vi thê cân cung cấp khi bằng cách khuêch tán thông qua ống silicone. Môi trường chứa nhiêu protein huyêt thanh có kha năng gây ra hiện tương tạo bọt nên cân khuấy châm và nhẹ. Đối với nuôi cấy mât độ cao, cân cung cấp thêm oxygen. Phương pháp dùng ống silicone để sục khi có nhiêu ưu điểm do không tạo ra bọt khi và tốc độ truyên oxygen là thoa đáng.

Như vây, các hệ lên men vi sinh vât đươc cai tiên thich hơp có thể dùng để nuôi cấy sinh khối các tê bào động vât sinh trưởng trong dich huyên phù. Nêu muốn nuôi cấy một dong tê bào dinh bám thi nên dùng một hệ thống chất mang như là microcarrier.

Các dong tê bào động vât có vú thường đươc sử dụng trong nuôi cấy là CHO4, NS05, BHK6, HEK-2937 và tê bào võng mạc cua người.

Người ta có thể sử dụng tê bào tự do (bạch câu, limpho,…) hoặc tê bào cua mô để nuôi cấy. Mô đươc phẫu thuât trong môi trường vô trùng, căt thành manh nho và đươc xử lý bằng enzyme kêt hơp với kỹ thuât nghiên mô để tách thành tê bào riêng biệt ở dạng huyên phù. Trong môi trường nuôi cấy, các tê bào tự do thường ở dạng huyên phù, con tê bào mô thường bám vào đáy binh thành lớp. Người ta sử dụng buồng đêm hoặc máy đêm tự động để tinh toán số lương tê bào theo từng giai đoạn phát triển.

Người ta có thể thực hiện các mẻ cấy liên tục bằng cách trich một phân mẻ cấy trước để cấy chuyên vào môi trường mới, nêu là mẻ bám thi phai sử dụng enzyme để tách riêng tê bào và phai làm rất nhanh trong vong 15 phút vi enzyme có thể gây hại cho tê bào.

Nuôi cấy sơ cấpNuôi cấy sơ cấp là quá trinh nuôi cấy tê bào trực tiêp từ mô trước lân cấy chuyên

đâu tiên (subculture).Trong nuôi cấy sơ cấp, các tê bào ban đâu thường là một hỗn hơp các dong tê bào

khác nhau, hoặc chứa một kiểu tê bào trội nhất, trong đó có những tê bào quan tâm và những tê bào khác (đươc gọi là tê bào nhiễm). Có thể loại bo các tê bào nhiễm bằng cơ học hay enzyme khi tách mô hay bằng cách duy tri các điêu kiện chọn lọc dương tinh cho sự sống sót cua một kiểu tê bào quan tâm cân thu nhân.

Qui trinh nuôi cấy sơ cấp gồm:- Bước 1: Thu nhân mô (tươi hoặc đông lạnh) có chứa tê bào sống.- Bước 2: Phẫu tich và (hoặc) tách rời tê bào, xác đinh nồng độ.- Bước 3: Nuôi cấy tê bào.

15

16

Tái huyền phù

Dòng tế bào

Cấy chuyền

Nuôi sơ cấp

Li tâm

CollagenaseTrypsin ấmTrypsin lạnh

Nuôi mảnh mô thứ cấp

Thu nhận tế bào mới

Nuôi mẫu mô sơ cấp

Tách TB bằng enzyme

(u,…)

Tách TB bằng cơ học

(nghiên, ép)

Cắt nhỏ

(Manh nho để nuôi)

Cắt nhỏ

(Chọn lọc mẫu mô quan tâm, căt bo phân mô chêt)

Thu nhận mẫu mô

Sơ đồ 1.2.5 Quy trình nuôi cấy sơ cấp

Thu nhân mẫu và xử li sơ bộ

Các mẫu thu nhân có thể bao gồm bất kỳ mô nào cua cơ thể, trước khi lấy phai làm sạch mô tại vi tri lấy, đưa mô vào bao quan trong dung dich DPBS, nhanh chóng chuyển vê phong thi nghiệm.

Xử li mẫu sơ bộ bao gồm rửa nhiêu lân bằng dung dich PBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm, sau đó căt bo các phân mô chêt, phân thừa,… mẫu mô cân đươc căt nho thành từng manh 2-3 mm2

Tách rời các tê bàoCó thể sử dụng nhiêu phương pháp khác nhau như:

- Tách tê bào bằng cơ học: nghiên, ép- Tách tê bào bằng cách u với enzyme trypsin hay collagenase- Tách tê bào bằng phương pháp li tâm theo gradient tỷ trọng- Tách tê bào bằng phương pháp dựa vào marker bê mặt.

Kêt qua cua giai đoạn này thu đươc dich tách tê bào.Nuôi cấy

- Dùng pipetman hút vào bốn eppendorf, mỗi cái 1 ml dich tách tê bào.- Li tâm 1000 vong/ph trong 10 phút, loại bo dich nổi.- Cho vào mỗi eppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyên phù tê bào bằng vortex.- Hút dich huyên phù tê bào ở bốn eppendorf cho vào một binh nuôi cấy (binh

Roux) và bổ sung 1ml môi trường.- Ủ ở 37,50C trong tu nuôi, sau 24h thay môi trường mới và tiêp tục u.

Sau lân nuôi cấy sơ cấp sẽ thu đươc các tê bào sơ cấp. Đối với trường hơp lương mẫu mô quá it, người ta nuôi cấy nguyên manh mô để thu nhân tê bào sơ cấp.

Đời sống tê bào động vât trong nuôi cấyTê bào mô động vât, đặc biệt là động vât có vú có đặc điểm là khi nuôi cấy, dù là

cấy chuyên chỉ qua đươc 50 thê hệ, sau đó chúng thoái hóa và chêt. Số thê hệ tê bào tùy thuộc vào độ biệt hóa cua mô mà ta lấy tê bào. Đối với tê bào gốc thi kha năng sinh trưởng sẽ dài hơn so với tê bào biệt hóa, tê bào gốc phôi có kha năng sinh trưởng dài hơn tê bào gốc cơ thể trưởng thành. Tuy vây, người ta đã tạo ra đươc các dong tê bào “bất tử” tức là tê bào có kha năng sinh trưởng liên tục trong môi trường cấy chuyên. Đó chinh là các tê bào ung thư cua cơ thể hoặc là dạng tê bào đươc làm chuyển dạng “ung thư hóa” với những biên đổi di truyên. Sự chuyển dạng thường đươc thực hiện nhờ tác nhân gây đột biên, nhờ virut, nhờ gen ung thư,… Ngày nay, người ta đã nuôi cấy và cất

17

giữ nhiêu dong tê bào “bất tử” nhân tạo như các dong tê bào chuột, chuột Hamster TQ, khỉ,… hoặc lấy từ cơ thể từ các mô ung thư tê bào Hela (tê bào ung thư cổ tử cung) hay tê bào Namalwa (tê bào ung thư limphoma cua một phụ nữ có tên là Namalwa).

Sự sinh trưởng cua tê bào động vât trong nuôi cấy.Sự sinh trưởng cua tê bào động vât in vitro thường trai qua 3 pha:

- Pha châm (Lag phase) là giai đoạn khi tê bào đươc đưa vào môi trường nuôi cấy cho đên khi tê bào băt đâu phát triển. Thời gian này dài hay ngăn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa cua mô đươc trich tê bào.

- Pha tiên triển (exponential phase) là giai đoạn tê bào phân chia liên tục, tăng nhanh số lương tê bào trong khoang thời gian từ 15 – 25 giờ với số lương tê bào đạt 1-2 x 106/cm3, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ.

- Pha dừng (Stationary phase) là giai đoạn sau pha tiên triển, trong đó số lương tê bào không thay đổi, tức là khi môi trường dinh dương nghèo dân và băt đâu tich lũy các san phẩm trao đổi chất độc hại. Băt đâu xuất hiện tự hoại tê bào thể hiện ở chỗ nhân bi đứt chẻ và trên bê mặt tê bào tạo thành các manh khối có thể quan sát đươc dưới kinh hiển vi. Muốn cho tê bào tiêp tục sinh trưởng cân thực hiện các mẻ cấy chuyên với môi trường mới.

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào [19, 15]1.2.6.1 Môi trường và các yêu tố bổ sungẢnh hưởng cua môi trường bên ngoài lên quá trinh nuôi cấy tê bào biểu hiện qua 4

con đường:1. Tinh tự nhiên cua giá thể rất có ý nghĩa trong quá trinh nuôi cấy, nơi tê bào

sẽ găn bám và tăng trưởng. Giá thể phù hơp thi tê bào tăng trưởng mạnh – điêu này tạo ra tinh đồng nhất trong tăng trưởng, có thể nuôi cấy lớp đơn trên nhiêu giá thể khác nhau như: trên đĩa plastic, giá thể bán răn (trong một loại gel, collagen, ager hoặc trong dung dich nuôi cấy dich treo).

2. Sự cấu thành cua các yêu tố lý hóa và sinh lý cua môi trường.3. Sự thiêt lâp vê giai đoạn pha khi.4. Ảnh hưởng cua nhiệt độ u.

Việc nuôi những tê bào từ những manh mô có thể đươc cấy chuyên và tăng sinh in vitro dẫn đên việc thử nghiệm tạo ra nhiêu môi trường hơn để duy tri sự tăng trưởng cua dong tê bào liên tục và thay thê môi trường tự nhiên như: dich chiêt phôi, dich thuy phân protein, lympho…

18

Sự tiêp cân để phát triển một môi trường mới băt đâu với một môi trường giàu chất dinh dương như: Ham’s F12 hoặc môi trường 199 đươc bổ sung với nồng độ cao cua huyêt thanh (20%) và dân dân thử nghiệm giam bớt huyêt thanh bởi sự thay đổi nồng độ cua các thành phân tồn tại trong môi trường và thêm vào các yêu tố mới.

1.2.6.2 Yêu tố bê mặt cua chai nuôi – giá thểPhân lớn tê bào động vât có xương sống có kha năng tăng trưởng thành từng lớp

đơn trên bê mặt nhân tạo trong điêu kiện nuôi in vitro. Từ những cố găng sớm nhất, thuy tinh đã đươc sử dụng như là giá thể, khởi đâu do đặc tinh quang học cua nó, nhưng do tê bào cân dàn trai, găn bám lên trên một bê mặt giá thể thich hơp cho sự tăng trưởng nên để khăc phục tinh trạng này người ta đã dùng nhựa plastic do chúng có đặc tinh quang học tốt và bê mặt tăng trưởng bằng phăng, tạo ra đươc các đơn vi tăng trưởng tê bào và sự tái tạo trong nuôi cấy.

Hiện nay, đa số người ta thich dùng polystyrene. Ngoài ra con có các loại giá thể bán thấm, các loại vi giá thể và các giá thể nhân tạo khác. Sự lựa chọn giá thể đươc quyêt đinh dựa vào:

- Kha năng sinh san cua tê bào.- Sự tăng cua tê bào trong dich treo hoặc tạo lớp đơn.- Việc nuôi nên để thông khi hay bit kin.- Mẫu chuẩn và mẫu thi nghiệm đươc thực hiện hay không.- Giá ca hơp li.

1.2.6.3 Yêu tố vât lýÁp suất thẩm thấuHâu hêt tê bào đươc nuôi có một giới hạn chiu đựng khá rộng vê áp suất thẩm thấu.

Trong thực tê, áp suất thẩm thấu giữa 260 mOsm/kg và 320 mOsm/kg thường đươc chấp nhân cho hâu hêt những tê bào, nhưng nên có một sự chọn lựa và nên giữ ở mức sai số ±10 mOsm/kg.

Nhiệt độNhiệt độ anh hưởng trực tiêp lên sự tăng trưởng cua tê bào vi nó làm anh hưởng đên

pH do sự thay đổi vê ion và pKa cua dung dich đệm. pH nên đươc điêu chỉnh thấp hơn 0,2 đơn vi ở nhiệt độ phong hơn là ở 36,50C.

Nhiệt độ tối ưu cho tê bào nuôi phụ thuộc vào:- Nhiệt độ cơ thể cua động vât nơi tê bào đươc thu nhân.- Tùy thuộc vào các vùng khác nhau vê nhiệt độ cơ thể (như da và tinh hoàn

có nhiệt độ thấp hơn các vùng khác trong cơ thể).

19

Tất ca yêu tố an toàn theo sau trong điêu kiện nuôi cấy:- Nhiệt độ đươc quan tâm đối với người và dong tê bào động vât máu nóng tốt

nhất là 36,50C. Gân với nhiệt độ cơ thể nhưng thấp hơn để đam bao an toàn, nhiệt độ quá cao anh hưởng nghiêm trọng hơn nhiệt độ thấp.

- Tê bào nuôi có thể dừng tăng trưởng dựa vào điêu khiển nhiệt độ, có thể tồn tại một vài ngày ở 40C và có thể bi đông lạnh, ngừng hoạt động sinh lý ở nhiệt độ lạnh sâu -1960C, nhưng không thể tồn tại ở nhiệt độ 20C trong điêu kiện binh thường khoang một vài tiêng và chêt khá nhanh ở nhiệt độ 400C và cao hơn.

Tinh nhớtTinh nhớt cua môi trường bi anh hưởng bởi các thành phân cua huyêt thanh và

trong một số trường hơp, anh hưởng một it lên sự tăng trưởng tê bào. Tinh nhớt trở nên đặc biệt quan trọng khi mà nuôi dich treo đươc lăc hoặc khi dich nuôi cấy đươc khuấy hoặc khi tê bào đươc tách ra sau khi bi trypsin hóa.

Áp lực sức căng bê mặt và sự tạo bọtÁp lực sức căng bê mặt đươc sử dụng để kiểm soát sự bám dinh cua manh mô đươc

cấy nguyên phát với giá thể. Trong nuôi cấy dich treo với 5% CO2 trong không khi thi bọt đươc tạo ra trong môi trường chứa huyêt thanh. Sự thêm vào cua một Silicone kháng bọt (Dow chemical) hoặc Plunoric F68 (Wyandotte) giúp cai thiện điêu này bởi làm giam áp lực sức căng bê mặt.

Ảnh hưởng cua sự tạo bọt đên sự biên tinh protein và nguy cơ cua việc nhiễm gia tăng vẫn chưa đươc xác đinh rõ ràng, nêu sự tạo bọt gia tăng đên cổ cua lọ nuôi, tốt nhất là nên tránh.

Yêu tố hóa học- Oxygen: Phân quan trọng trong cấu tạo cua pha khi là O2 và CO2. Áp lực O2 phù

hơp với hâu hêt các loại tê bào nuôi, cơ quan, đặc biệt là gia đoạn muộn cua phôi, cá thể mới sinh hoặc trưởng thành đêu cân đên 95% O2 trong pha khi.Chiêu sâu cua môi trường có anh hưởng đên tỉ lệ khuêch tán oxy hoa tan cua tê bào, thich hơp nhất nên giữ độ sâu cua môi trường trong khoang 2 – 5mm.

- Dioxide carbon (CO2): CO2 có nhiêu vai tro quan trọng như: anh hưởng đên nồng độ CO2 hoa tan, pH và nồng độ HCO3

-. Rất khó để xác đinh chinh xác áp lực CO2 không khi để kiểm soát nồng độ CO2 hoa tan.Đây là một phan ứng thuân nghich diễn ra:

H 2O+C O2↔ H2C O3 ↔ H+¿+HC O3−¿¿ ¿ (1)

20

Kêt qua cua việc gia tăng CO2 không khi là làm giam pH. Vi thê, hiệu qua cua việc gia tăng áp lực CO2 đươc trung hoa bởi sự gia tăng nồng độ bicarbonate:

NaHC O3 ↔ N a+¿+HC O3−¿ ¿¿ (2)

Sự gia tăng HCO3- làm cân bằng (1) cho đên khi có sự cân bằng pH ở 7.4:

NaOH +H 2 C O3↔ NaHC O3+H 2O ↔Na+¿+HC O3−¿+H 2O ¿¿ (3)

Tóm lại, nuôi tê bào ở nồng độ thấp trong chai mở cân u trong CO2 không khi nơi mà nó đươc cân bằng với sodium bicarbonate trong môi trường. Ở tại nồng độ tê bào rất thấp cân thêm CO2 vào pha khi cua binh khi kin đối với hâu hêt việc nuôi. Khi nồng độ tê bào cao, không cân thiêt để thêm CO2 vào pha khi trong chai kin và cũng không cân đối với chai mở.

- pH: Hâu hêt các dong tê bào đêu tăng trưởng tốt ở pH 7.4. Mặc dù điêu kiện thuân lơi vê pH đối với sự phát triển cua tê bào sẽ thay đổi liên quan đên các kiểu tê bào khác nhau. Phenol red thường đươc sử dụng như là một chất chỉ thi.

- Dung dich đệm: Môi trường nuôi phai đươc đệm bởi hai lý do:+ Đĩa, chai thường xuyên đươc mở ra, nơi tạo điêu kiện cho CO2 xâm nhâp và

làm gia tăng pH.+ Sự san sinh quá nhiêu CO2 và acid lactic trong dong tê bào bi biên đổi ở mât

độ tê bào cao, khi đó pH sẽ giam xuống. Một loại dung dich đệm phai đươc sử dụng để kêt hơp chặt chẽ trong moi trường để giữ pH không thay đổi nhưng trong phan ứng (1), san phẩm CO2 ngoại sinh có lẽ cân cho vài dong tê bào, đặc biệt ở nồng độ tê bào thấp, việc ngăn chặn tổng lương CO2 hoa tan mất đi là cân thiêt nêu không sẽ khiên Bicarbonate trong môi trường bi thất thoát.Dung dich đệm Bicarbonate đươc sử dụng thường xuyên hơn các dung dich đệm khác do chúng có kha năng đệm ở mức thấp hơn pH sinh lý, tạo ra it độc tố, giá thành thấp và giá tri kinh tê cho việc nuôi cấy tê bào.

Môi trường tu nuôiCân hạn chê mở cửa tu cấy nhất là trong trường hơp phong vô trùng thi nghiệm

không đạt chuẩn yêu câu.Tránh chồng các đĩa, chai tu cấy, dễ ngã đổ môi trường lên năp trong miệng chai

cấy, nêu không có thể làm tăng nguy cơ gây nhiễm và gây nhiễm ca môi trường bên trong tu cấy. Tránh sự rung lăc, dao động tu cấy làm anh hưởng đên kêt qua thi nghiệm.

Nhiệt độ tu cấy nên ổn đinh không đổi trong khoang 36,5 ± 0,50C.

21

1.2.7 Tỉ lệ môi trường với mật độ tế bào đem nuôi, lượng mô đem cấy [19]Đối với cách tách tê bào bằng trypsin, người ta thường sử dụng: 5ml môi trường/

chai cấy loại 25cm2 và mât độ tê bào từ 106 – 107 tê bào/ml.- Với môi trường giàu dinh dương có bổ sung sẵn chất bổ trơ như

AMNIOMAXTM – C100 20% FBS thi thường sử dụng 1ml ứng với 1 ngày sau thay, 5ml ứng với 5 ngày thay.

- Với môi trường nghèo dinh dương như: DMEM 20% AHS, EMEM 20% AHS thi thường sử dụng 5ml tương ứng với 2 ngày sau thay.

Đối với cách tách bằng cơ học, nuôi cấy nguyên phát, người ta thường sử dụng cách thay và liêu lương thay môi trường như sau:

+ 1ml môi trường/ chai cấy (1 ngày thay) ứng với chai cấy loại 25cm2.+ 2ml môi trường/ chai cấy (2 ngày thay) ứng với chai cấy loại 25cm2.+ 3ml môi trường/ chai cấy (3 ngày thay) ứng với chai cấy loại 25cm2.+ 5ml môi trường/ chai cấy (5 ngày thay) ứng với chai cấy loại 25cm2.

1.2.8 Môi trường nuôi cấy [8]1.2.8.1 Môi trườngThành phân môi trường nuôi cấy tê bào động vât phức tạp hơn rất nhiêu so với môi

trường nuôi cấy vi sinh vât và tê bào thực vât. Trong các công trinh đâu tiên vê nuôi cấy tê bào động vât người ta thường dùng hỗn hơp dung dich muối sinh lý, huyêt thanh và chiêt phẩm phôi gà làm môi trường nuôi cấy. Do thành phân huyêt thanh và chiêt phẩm phôi gà rất phức tạp, khó ổn đinh nên người ta dân quan tâm đên việc nghiên cứu chê tạo các môi trường tổng hơp để có thể chu động bao quan, sử dụng, điêu chỉnh thành phân môi trường và ổn đinh môi trường trong những lân nuôi cấy khác nhau.

Hiện nay, trừ những dong tê bào đã thiêt lâp đươc thuân hóa với môi trường tổng hơp hoàn toàn, đa số các dong tê bào đươc nuôi cấy trong môi trường tổng hơp có bổ sung 5 – 10% huyêt thanh (có dong tê bào cân bổ sung 20% huyêt thanh). Thông thường huyêt thanh bê đươc sử dụng phổ biên hơn ca, nhưng có một số loại tê bào cân phai sử dụng huyêt thanh bào thai bo (Fetal bovine serum: FBS).

1.2.8.2 Một vài loại môi trường thông thường đươc sử dụng trong nuôi cấy tê bào và mô động vât [8]

Môi trường BM (Basal Medium): đây là môi trường cơ ban do H. Eagle thiêt lâp, khi dùng phai bổ sung 5 – 10% huyêt thanh và amino acid, vitamin với chung loại và số lương tùy loại tê bào. Thường sử dụng nuôi cấy tê bào HeLa, tê bào L.

22

Môi trường E’MEM (Eagle Minimun Essential Medium): con gọi là môi trường tối thiểu, do H. Eagle thiêt lâp. Đây là môi trường BM có chứa nồng độ cao hơn các amino acid và vitamin, cũng cân bổ sung 5 – 10% huyêt thanh khi nuôi cấy tê bào.

Môi trường D’MEM (Dulbecco – Modifiled Eagle Medium) là môi trường E’MEM do Dulbecco cai tiên với thành phân một số amino acid cao gấp 2 lân và một số vitamin cao gấp 4 lân so với môi trường khác để nuôi đươc nhiêu loại tê bào hơn.

Môi trường F10, F12: do R.G. Ham thiêt lâp dùng cho nguyên bào sơi, trong môi trường này huyêt thanh đươc thay bằng 20µg/ml albumin huyêt thanh hoặc bằng 3.10-7

M acid linoleic.Môi trường Iscove: do N.N. Iscove thiêt lâp trên cơ sở tiêp tục cai biên môi trường

D’MEM.Môi trường 5A: do T.A. Mc. Coy thiêt lâp, thường đươc dùng cho tê bào bệnh bạch

huyêt.Môi trường RPMI – 1640: đươc G.E. Moore thiêt lâp tại viện nghiên cứu Roswell

Part Memorial Institute, đươc dùng để nuôi cấy tê bào và mô bạch huyêt.Môi trường 199: do R.C. Parker thiêt lâp dùng để nuôi cấy tê bào mô cơ phôi gà

trong san xuất vaccine phong bệnh bại liệt.Trong hâu hêt các loại môi trường nuôi cấy tê bào động vât đêu có mặt huyêt thanh

vi nó có những vai tro quan trọng như sau:+ Cung cấp chất dinh dương quan trọng cho tê bào như các amino acid thiêt yêu,

tiên chất cua nucleic acid, các nguyên tố vi lương…+ Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kich thich cho tê bào tăng trưởng và phân

chia.+ Kich thich sự phục hồi các tổn thương cua tê bào khi cấy chuyên và các

protein trong huyêt thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzyme gây tổn thương tê bào.

+ Cai thiện tinh tan cua các chất dinh dương.+ Cai thiện tinh dinh cua tê bào lên bê mặt binh nuôi cấy nhờ các yêu tố làm

tăng độ dinh cua tê bào lên giá đơ.+ Chống oxy hóa: huyêt thanh có tinh kháng oxy hóa mạnh và ức chê độc tinh

cua oxy.Huyêt thanh rất cân cho việc nuôi cấy tê bào động vât, tuy nhiên huyêt thanh làm

tăng giá thành nuôi cấy lên rất nhiêu (chiêm 90% giá thành cua môi trường nuôi cấy). Ngoài ra huyêt thanh con dễ bi nhiễm virus, mycoplasma và khó ổn đinh chất lương

23

cua những lô môi trường khác nhau cũng như con chứa những thành phân gây ức chê sự phân bào cua một số tê bào đặc biệt (do đó cân chọn loại huyêt thanh phù hơp không chứ yêu tố ức chê đối với dong tê bào nuôi cấy). Vi các lý do đó mà nhiêu nhà nghiên cứu đã xây dựng môi trường nuôi cấy tê bào động vât không dùng huyêt thanh hay dùng với lương thấp.

Có 2 phương pháp điêu chê môi trường không có huyêt thanh là phương pháp cua G. Sato và phương pháp cua R.G. Ham. Ca 2 phương pháp này đêu thay huyêt thanh bằng những yêu tố khác như: kich thich tố, nhân tố tăng trưởng, protein vân chuyển, nhân tố kêt dinh và kéo dài, các chất dinh dương, khoáng…

1.2.9 Ðánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy [11]Ước lương trạng thái sức khoe nói chung hay sự “happy” cua tê bào nuôi cấy

thường dựa trên 4 đặc điểm: hinh thái, tỷ lệ phát triển, năng suất che phu và biểu hiện chức năng đặc biệt.

- Dựa vào hinh thái học (hinh dạng tê bào) là dễ xác đinh nhất nhưng thường it đươc sử dụng nhất. Tuy đặc điểm này đươc theo dõi thường xuyên khi nuôi cấy nhưng rất khó đưa ra kêt luân dựa vào những quan sát này. Ngoài ra, đặc điểm này không thể hiện một số lương hay đo lường chinh xác nào. Phương pháp này thỉnh thoang sai khi quan sát tê bào bằng kinh hiển vi và vi trường quan sát xấu hay có biểu hiện bất thường. Khi nghi ngờ, có thể nhuộm những tê bào đó với crystal violet hoặc các chất nhuộm mô khác để xác đinh vấn đê bất thường.

- Đêm tê bào để ước lương số lương tê bào, cho phép xác đinh tỷ lệ phát triển – tỷ lệ này nhạy cam với những thay đổi cơ ban cua điêu kiện nuôi cấy. Dựa vào đó để thiêt lâp các thi nghiệm xác đinh điêu kiện (môi trường, chất nên, huyêt thanh…) tốt hơn cho tê bào.

- Năng suất che phu là phương pháp kiểm tra dựa trên số lương nho tê bào (từ 20 – 200) bám trên binh nuôi cấy và số lương các cụm tê bào đặc trưng đươc xác đinh. Phân trăm các cụm tê bào đặc trưng biểu hiện cho kha năng tồn tại, trong khi kich thước cụm tê bào đặc trưng cho tỷ lệ phát triển. Phương pháp này tương tự phương pháp phân tich tỷ lệ phát triển, nhưng nhạy cam hơn với sự khác biệt nho cua điêu kiện nuôi cấy.

- Đặc điểm cuối cùng là sự biểu hiện chức năng đặc biệt: thường khó quan sát và đo lường nhất, đươc xác đinh bằng các xét nghiệm hóa sinh và miễn dich.

1.3 Đại cương vê nguyên bào sơi1.3.1 Nguồn gốc [2, 13, 14]

24

Nguyên bào sơi có nguồn gốc từ trung mô, tồn tại hai dạng là nguyên bào sơi (fibroblast) và tê bào sơi (fibrocyte).

Tê bào sơi: khi chúng ở trạng thái nghỉ thi nhân có màu đâm, it bào tương, có kich thước nho hơn so với nguyên bào sơi.

Nguyên bào sơi: chúng sẽ ở trạng thái hoạt động trong suốt quá trinh làm lành vêt thương. Nguyên bào sơi có thể tồn tại 6 – 7 tháng trong quá trinh nghiên cứu in vitro. Vong đời tăng trưởng cua các dong nguyên bào sơi phụ thuộc vào các cơ quan khác nhau trên cơ thể.

1.3.2 Đặc điểm của nguyên bào sợi [2, 13]Hinh dạng cua tê bào có thể bi thay đổi do những yêu tố vât lý (bê mặt) nơi mà

chúng găn bám. Dưới kinh hiển vi điện tử, nguyên bào sơi là những tê bào non, it biệt hóa. Nguyên bào sơi thường có dạng hinh thoi, it nhánh và ngăn, kich thước không quá 20 – 25µm, nhân bâu dục hoặc hinh câu có một hoặc vài hạt nhân. Nhân cua nguyên bào sơi cô đặc đươc kéo dài ra. Bào tương cua base hạt, lưới nội bào, ti thể phát triển. Nguyên bào sơi có kha năng phân chia mạnh, tê bào có thể di động yêu nhờ siêu sơi actin và myosin ở ngoại vi bào tương. Tê bào có những nhánh là chân gia dạng sơi.

Hình 1.3.2 Cấu trúc nguyên bào sợi1.3.3 Chức năng của nguyên bào sợi [6, 13, 15]

Hinh dáng cấu trúc vât lý cua tê bào đem lại những chức năng đặc biệt đối với việc tổng hơp và tiêt ra các đại phân tử, đam nhân nhiêu chức năng quan trọng trong cơ thể như:

25

- Tổng hơp các chất như phân tử collagen, proteoglycans, glycoprotein và sơi elastin bằng quá trinh ngoại tiêt để tạo sơi liên kêt, tổng hơp glycosaminoglycan, tổng hơp một phân glycoprotein.

- Tham gia vào quá trinh tái tạo.- Tạo tê bào sơi trưởng thành, tê bào mơ, tê bào sụn, tê bào xương.- Kha năng thực bào cua nguyên bào sơi rất thấp.

Tâm quan trọng cua nguyên bào sơi chưa thể đánh giá hêt đươc. Chúng hiện diện ngay trong trạng thái phát triển binh thường, và ngay ca lúc hàn găn và sửa chữa vêt thương. Ngày ngày, chúng tham gia hoạt động sinh lý cua các mô và các cơ quan trong cơ thẻ. Nguyên bào sơi đam nhiệm nhiêu chức năng. Nó có thể khử biệt hóa để trở vê trạng thái ở giai đoạn sớm trong tiên trinh phát triển và sau đó lặp lại sự biệt hóa đó (tái biệt hóa) để tạo ra một số loại tê bào khác. 1.3.4 Sơ lược về kinh nghiệm nuôi cấy nguyên bào sợi trên thế giới [19]

Ngoài môi trường dinh dương cơ ban, nhu câu chinh yêu cua tê bào dạng nguyên bào sơi cũng như nguyên bào sơi là cân giá bám để mọc lan ra, những tê bào này có tinh linh động yêu và tinh độc lâp khi mât độ tê bào con thấp. Để hiện diện đươc, nó cũng như những tê bào biểu mô cân có sự cam ứng trực tiêp giữa tê bào với tê bào mới sống sót và phát triển đươc tối ưu để tạo thành cụm tê bào.

Ba nhóm protein chuyển biên màng chinh yêu đươc thể hiện liên quan đên tinh cam ứng giữa tê bào với tê bào, giữa tê bào với giá thể:

+ Phân tử cam ứng găn bám giữa tê bào với tê bào là: CAMs (độc lâp với Ca2+) và Cadherins (phụ thuộc vào Ca2+) – nó thể hiện tương tác cơ ban giữa các tê bào đồng loại. Tinh tự cam ứng như: những phân tử giống nhau thi mọc đối xứng tương tác lẫn nhau. Điêu này đươc phát hiện bởi: Edelman, 1986, 1988; bởi Roseman và Gallatin, 1991.

+ Mối tương tác giữa tê bào và giá thể trong môi trường nuôi cấy đươc thể hiện qua đoạn dinh găn (integrins) cua tê bào, thụ thể cua tê bào găn bám với những phân tử chất nên như là: fibronectin, laminin, collagen, những sơi này sẽ liên kêt với các tê bào tạo ra đường nối rõ ràng đặc hiệu, thường chứa đựng trong những sơi này gồm có: RGD (arginine, glycine, aspartic acid). Điêu này đươc phát hiện bởi: Yamada, 1991. Mỗi đoạn đinh (integrins) gồm có: tiểu đơn vi α và tiểu đơn vi β. Ca hai sơi này đêu có tinh đa dạng cao, đươc sinh ra nhiêu đáng kể, tạo ra sự đa dạng giữa các đoạn dinh găn (integrins).

26

+ Nhóm thứ ba cua phân tử găn bám tê bào là: sự chuyển biên những proteoglycans màng, cũng như dựa trên sự tương tác giữa các thành tố chất nên với nhau, như là: tương tác với những proteoglycans khác hoặc collagen nhưng không găn kêt đặc hiệu với sơi RGD.

Có một số sự kiện chuyển biên proteoglycans màng có chức năng hoạt động như là: cơ quan cam thụ nhân tố tăng trưởng với ái lực yêu. Điêu này đươc phát hiện bởi: Klagsbrun và Baird, 1991.

Sự kiện không kêt tụ cua mô có nghĩa là: thể hiện một sự găn bám thành lớp đơn trong nuôi cấy. Do trong quá trinh tăng sinh có sự hiện diện cua protease tiêu huy một số chất nên ngoại bào, thâm chi có lẽ làm suy thoái sự chuyển biên protein màng, mà protein màng đó sẽ cam ứng với chất nên ngoại bào. Khi đó, nó sẽ cho phép các tê bào tách biệt thành mỗi cái riêng rẽ.

Những tê bào ngoại bi và nội bi thường đê kháng với sự không kêt tụ hơn, có nghĩa là: chúng có khuynh hướng mọc chồng chéo lên nhau, tạo ra dạng tê bào phức hơp hoặc chèn lấp lẫn nhau thành đám.

Trong khi những tê bào trung bi thi phụ thuộc vào sự tương tác với chất nên hơn là sự liên kêt gian bào. Vi lý do đó nên dễ dàng mọc tách riêng biệt ra thành lớp đơn. Chinh vi li do này mà tê bào phai tái tổng hơp protein chất nên trước khi chúng găn bán, hoặc là phai đươc cung cấp một giá thể có chất nên đươc lót bọc sơi liên kêt.

Trong nuôi cấy sơ cấp, quan sát những tê bào lớp đơn, Hence đã lâp ra sự liên hệ giữa tỉ lệ mât độ và sự chuyển đổi cua tê bào, liên quan đên cách sử dụng chất nên để bám.

Trong nuôi cấy lớp đơn, nêu tê bào con môi trường sử dụng và giá thể để bám thi chúng sẽ không khép kin sự tiêp xúc với những tê bào khác. Khi môi trường và không gian nuôi cấy đã hêt, nêu để lâu hơn vài giờ thi những bước chọn lọc khuynh hướng phát triển khác nhau sẽ xay ra:

+ Những tê bào mà nó nhạy cam với giới hạn, mât độ phát triển thi sẽ ngừng phân chia.

+ Những tê bào nào bi chuyển dạng thi sẽ không cam nhân đươc giới hạn mât độ phát triển. Chúng sẽ có khuynh hướng phát triển vươt bâc, phát triển quá giới hạn.

+ Khi giữ mât độ tê bào ở mức thấp, bằng cách tạo ra sự cấy chuyên thường xuyên sẽ giúp ich cho việc giữ ổn đinh kiểu hinh binh thường cua tê bào trong môi trường nuôi cấy, như là trường hơp nuôi nguyên bào sơi chuột nêu cấy chuyên thường xuyên sẽ giúp không rơi vào trạng thái dễ dàng chuyển dạng. Khi mà mât độ tê bào ở mức độ

27

quá cao thi tại thời điểm đó, ở nơi đó, sự chuyển dạng tự phát sẽ làm cho tê bào có khuynh hướng phát triển quá giới hạn.

Một vài diễn biên chức năng chuyên biệt đươc hiểu rõ ràng trong nuôi cấy sơ cấp, đặc điểm này thể hiện khi nuôi cấy trở nên nhâp dong (các dong tê bào khác nhau hoa hơp cùng phát triển trên cùng môi trường nuôi cấy). Ở giai đoạn này, nuôi cấy sẽ thể hiện trạng thái khép kin dày đặc nhất và vẫn con tinh trạng đa dạng vê thể loại tê bào.

Sau lân đâu tiên cấy chuyên, nuôi cấy nguyên phát trở nên - đươc biêt gân như là một dong tê bào và có lẽ sẽ đươc nhân lên sau vài lân cấy chuyên nữa. Sau mỗi lân cấy chuyên thành công, thành phân cua quân thể sẽ có kha năng tăng sinh mạnh mẽ hơn, hâu như nhanh hơn và tăng dân đên một mức độ tối ưu nào đó và rồi không tăng sinh nữa; hoặc các tê bào tăng sinh châm chạp lại, trong trường hơp này mât độ tê bào sẽ bi loãng ra và thưa đi. Điêu này là sự kiện nổi bât nhất sau lân đâu tiên cấy chuyên. Ở những vùng khác nhau sẽ cho kha năng tăng sinh khác nhau. Và xu hướng là: những tê bào bi tổn thương bởi trypsin sẽ có khuynh hướng chuyển dạng tê bào.

Mặc dù vây, một sự chọn lọc dong vê kiểu hinh và kiểu gen tiêp tục đươc thực hiện trong môi trường nuôi. Bởi lẽ, sau lân cấy chuyên thứ ba, chỉ các loại tê bào điển hinh có kha năng chiu đựng cao thi mới tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ. Trong trường hơp có sự hiện diện cua huyêt thanh mà không có điêu kiện chọn lọc chuyên biệt thi những dong tê bào trung mô đươc dẫn xuất từ mô liên kêt như nguyên bào sơi và những nhân tố thuộc mạch máu thường phát triển mạnh mẽ, tăng lên quá mức trong môi trường nuôi cấy. Từ những nghiên cứu này đã đưa ra một số dong tê bào rất hữu dụng:

+ W138: Nguyên bào sơi từ phổi phôi người.+ BHK21: Nguyên bào sơi chuột đồng con.

Phân lớn các dong tê bào có thể nhân lên không làm thay đổi hiện trạng cua tê bào, do có sự giới hạn số lương thê hệ tê bào. Bên cạnh đó, chúng có thể chêt hoặc nhân lên thành dong tê bào liên tục. Kha năng một dong nào đó phát triển thành dong tê bào liên tục có thể phan ánh kha năng biên đổi di truyên cua nó. Qua đó cho phép ta chọn lọc dong tê bào theo trinh tự cấy chuyên nối tiêp nhau.

Nguyên bào sơi người duy tri số lương thể bội chỉnh áp đao, đánh giá thông qua tuổi đời nuôi cấy cua chúng và không bao giờ cho ra dong tê bào liên tục. Trong khi đó, nguyên bào sơi cua chuột và những tê bào nuôi cấy từ những mô bướu cua người và những động vât khác thi thường cho ra thể bội không chỉnh; song song đó, cho ra dong tê bào liên tục trong nuôi cấy với tân số hoàn toàn cao. Sự biên đổi trong nuôi cấy

28

và cho ra dong tê bào liên tục phổ biên gọi là: “sự chuyển dạng trong nuôi cấy thi nghiệm (in vitro transformation)”. Có nhiêu loại tê bào không cho ra dong tê bào liên tục. Trong số những loại tê bào này có nguyên bào sơi người; là loại tê bào duy tri thể bội chỉnh trong suốt tuổi đời thê hệ (khoang 50 thê hệ).1.3.5 Nguyên bào sợi trong các nghiên cứu và ứng dụng

1.3.5.1 Điêu tri vêt thương [14, 23]

Nguyên bào sơi là thành phân cua manh ghép tự thân trong điêu tri tổn thương, rút ngăn thời gian lành hóa. Manh ghép tự thân gồm hai lớp tê bào, tê bào keratin và nguyên bào sơi, ca hai đêu đươc phân bố và tăng sinh trên hai chất nên khác nhau, chu yêu từ acid hyaluronic.

Một trong những chức năng sửa chữa vêt thương nổi bât cua nguyên bào sơi đươc ứng dụng nhiêu chinh là kha năng sửa chữa vêt rách đơn gian ở da. Việc sửa chữa mô hoặc hàn găn vêt thương xay ra theo hai cách thức chinh: sự tái sinh và sự xơ hóa.

Tái sinh là sự thay thê mô bi phá huy bằng những loại tê bào tương tự hoặc giống như những tê bào trước đó.

Ở những nơi mà sự xơ hóa xay ra, nó sẽ bọc lấy vi tri cân sửa chữa bằng mô liên kêt có sơi, đó chinh là sự hinh thành mô sẹo. Trước khi những sự kiện này xay ra thi con phụ thuộc vào:

(1) Loại mô bi hư hại.(2) Độ nghiêm trọng cua sự tổn thương (tùy loại vêt thương).

Vêt rạch thi mô sẽ hàn găn vêt thương dễ dàng hơn là mô bi rách. Mô tổn thương sẽ thiêt lâp thành dãy bằng phăng trong vùng bi tổn thương, khi đó vùng bi tổn thương sẽ trở thành vùng vân động. Bê mặt ngoại bi băt đâu tái sinh bằng cách mọc lan xuyên qua bên dưới mô hạt. vừa sát khit bên dưới sẹo và tách rời ngay sau đó. Kêt qua cuối cùng là tái sinh đây bê mặt ngoại bi mà ở đó mô sẹo đươc lót ở bên dưới.

1.3.5.2 San xuất san phẩm và vât liệu sinh học [6]Thu nhân collagenỞ Nhât, người ta đã thu hồi sinh khối collagen từ nguyên bào sơi người. Collagen

này có ưu điểm là không gây di ứng. Nguyên bào sơi đươc nuôi cấy trên vât liệu đặc biệt để san xuất sinh khối, chất nên là giàn giáo để nguyên bào sơi bám và phát triển trong cấu trúc không gian ba chiêu.

San xuất interferon và vaccine

29

Thử nghiệm dùng nguyên bào sơi để san xuất interferon: mục đich cua việc này là để phân lâp và năm đươc đặc tinh cua dong tê bào lương bội mới, thich hơp cho việc san xuất interferon với số lương lớn.

Thu nhân chất nên ngoại bào (ECM)Thu nhân chất nên ngoại bào từ nguyên bào sơi đươc ứng dụng trong kĩ thuât nuôi

cấy tê bào trên màng thấm. Màng bổ sung chất nên ngoại bào để cai tiên hệ thống nuôi cấy in vitro bằng cách cung cấp cho tê bào các thành phân vi môi trường.

Tạo lớp tê bào nên (feeder) trong nuôi cấy tê bào gốcNguyên bào sơi san xuất một loạt các yêu tố cân thiêt và thành phân chất nên ngoại

bào cân cho sự sinh trưởng và tăng sinh cua các loại tê bào khác nhau.Tạo da nhân tạoNguyên bào sơi là tê bào trung mô có tinh năng liên lạc với hâu hêt vât liệu trong

cơ thể. Nguyên bào sơi cua động vât có vú đươc sử dụng trong nghiên cứu này. Sự bám dinh, tương tác cua các tê bào có tinh tương hơp và an toàn sinh học cao. Chúng đươc ứng dụng làm vât liệu sinh học, không gây phan ứng phụ hay nguy hiểm nào đối với bệnh nhân. 1.4 Sơ lươc vê cây sống đời (Kalachoe pinata)

1.4.1 Nguồn gốc, phân bố và danh pháp cây sống đờiCây sống đời hay cây thuốc bong danh pháp có 2 loài là Kalanchoe pinnata, và

syn. Bryophyllum calycinum, Bryophyllum pinnatum, là loài cây ban đia cua Madagascar. Cây sống đời có kha năng sinh san sinh dương bằng lá rất tốt, đây cũng là đặc điểm chung cua nhóm Bryophyllum thuộc chi Kalanchoe. Cây sống đời đươc nhiêu người dân nước ta trồng làm kiểng vi có hoa màu săc đẹp, dễ trồng, vừa dùng làm thuốc chữa bệnh cho gia đinh. Cây đươc trồng và mọc tự nhiên tại nhiêu vùng thuộc Châu Á, Thái Binh Dương và Caribe. Cây có rất nhiêu công dụng tuy nhiên nổi bât nhất là kha năng chữa lành vêt thương cua cây. Cây sống đời thuộc:

Phân loại khoa học

30

Giới (regnum) Plantae

Bộ (ordo) Saxifragales

Họ (familia) Crassulaceae

Chi (genus) Kalanchoe

Đoạn (section) Bryophyllum

Loài (species) K. pinnata

Hình 1.4.1 Cây sống đời1.4.2 Đặc điểm hình thái [24]Cây sống đời là loài thao mộc thân nhẵn, cao từ 0,3 – 1,2m.

- Thân cây: tron, nhẵn, mọng nước, có đốm tia.- Lá: mọc đôi, chéo chữ thâp, các lá ở tâng thấp thường có kich thước từ 6 –

12cm, những lá ở tâng cao có kich thước từ 3 – 5 cm. Lá hinh trứng hoặc hinh elip, mọc đơn hoặc gồm 3 – 4 lá chét dây; mép lá khia răng cưa tron. Đặc biệt cây sống đời con có kha năng tạo cây non từ kẽ lá cua các khia cua mép lá.

- Hoa: Hoa màu đo hay vàng cam, ru xuống trên một cán dài ở ngọn thân hay ở lá bên cạnh.

- Qua: đươc bao bọc bởi búp hoa phia ngoài.- Hạt: nho, trơn nhẵn, thuôn dài hoặc có hinh elip.

31

1.4.3 Công dụng của cây sống đời1.4.3.1 Công dụng cua cây sống đời trên thê giới [24]

Bảng 1.4.3.1 Công dụng chữa bệnh của cây sống đời

Công dụng dân gian trên thê giới

Brazil

chữa áp- xe, viêm họng, viêm khớp, mụn nhọt, viêm phê quan, chữa bong, vêt chai, vêt côn trùng đốt, các vấn đê vê đường ruột, ngứa, soi thân, rối loạn bạch huyêt, căng thăng, nhiễm trùng đường hô hấp, đau răng, bệnh lao, ung thư, viêm loét,

suy tiêt niệu và đóng vai tro như một thuốc an thân.Ecuador vêt bâm tim, gãy xương

Guatemala nhức moi, tiêu chay, đau, vấn đê vê da

Ấn Độmụn nhọt, vêt bâm tim, bệnh ta, bệnh tiểu đường, tiêu chay,

kiêt lỵ, đây hơi, đau đâu, soi thân, côn trùng căn, ghẻ, lở loét, suy tiêt niệu, làm lành vêt thương.

Mexiconhiễm trùng măt, đau đâu, viêm nhiễm, rối loạn kinh nguyệt,

mụn nhọt, làm lành vêt thương.

Nicaraguađau nhức, bong, cam lạnh, ho, sốt, nhức đâu, nhiễm trùng

đường hô hấp.Nam Mỹ hen suyễn, cam lạnh, đau tai, đau đâu, loét, các khối u.

Mỹ thuy đâu, sốt, đau bụng.Việt Nam kháng khuẩn và kháng viêm.

Các vùng khác

viêm khớp, hen suyễn, vêt bâm tim, bong, táo bón, tiểu đường, đau tai, đau đâu, suy dinh dương, đau nửa đâu, viêm thân, tê

liệt, viêm đường hô hấp, bệnh thấp khớp, bong gân, sưng, loét, ói ra máu, chữa lành vêt thương.

1.4.3.2 Giới thiệu một số bài thuốc dùng lá cây sống đời ở nước ta- Mất ngu: Chiêu và tối ăn mỗi lân 8 lá sống đời, giấc ngu sẽ đên sớm.- Viêm xoang mũi: Giã nát 2 lá sống đời, lấy nước thấm vào bông, nút hố mũi

bên viêm. Ngày làm 4-5 lân. Nêu viêm ca 2 bên thi sáng nút một bên chiêu nút một bên.

- Trĩ nội: Mỗi ngày dùng 10 lá sống đời (sáng 4 lá, chiêu 4 lá, tối 2 lá) nhai nuốt bớt nước, bã bo vào gạc vai, đăp lên hâu môn. Trước khi đăp thuốc phai làm vệ sinh hâu môn bằng nước pha muối. Sau 20-45 ngày sẽ khoi.

32

- Kiêt lỵ (viêm đại tràng): Mỗi ngày ăn 20 lá sống đời (sáng 8 lá, chiêu 8 lá, tối 4 lá). Trẻ 5-10 tuổi dùng liêu bằng nửa người lớn. Ăn 5 ngày là khoi.

1.4.4 Thành phần hóa học trong cây sống đời [24, 25, 26, 27]Bảng 1.4.4 Các hợp chất hữu cơ trong cây sống đời

Lá cây

P-coumaric acid, Ferulic acid, Syringic acid, Caffeic acid, citric acid, isocitric acid, malic acid, P-hydroxybenzoic acid.

Flavnoids như quercetin, kaem pferol. Quercetin-3-diarabinoside, Kaempferol-3-glucoside, Quercetin-3-

L-rhamnosido-L-arabino furanoside. η-hentricontane, η-tritriacontane. Sitosterol Hai dẫn xuất phenanthrene tương đồng: 2 (9-decenyl)

phenanthrene (I) và 2 (undecenyl) phenanthrene (II). Năm dẫn xuất Bufadienolide: Bryophyllin B, Bryophyllol,

Bryophollone, Bryophollenone, Bryophynol.

Đỉnh ngọn

18 oleanane α ψ-taraxasterol Alpha và β-amyrins và các acetate cua chúng. 24 epiclerosterol [24 (R) stigmasta-5, 2-dien-3 β-oi]; 24 (R) 5 α-

stigmasta-7, 25-dien-3 β-oi; 5 α-stigmast-24-en-3 β-oi; 25-methyl-5-α stigmast-24-en-3 β-oi và 25-methyl-5α-ergost-24 (28)-en-3 β –oi.

Axit glutamic, methionine, phenylalanine và tryrosine.

33

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

34

2.1 Vât liệu

2.1.1. Dụng cụ - thiết bịDụng cụ

- Binh đinh mức 50ml, 500ml- Chai thuy tinh 50ml,

100ml,250ml,500ml - Bơm tiêm 1ml, 3ml, 5ml,10ml- Bercher 50ml, 100ml, 250ml,

500ml, 1000ml - Cá từ - Erlen 50ml,100ml - Erlen 250ml có nút mài - Dao mổ, kéo mổ, banh kẹp 4 bộ - Buồng đêm hồng câu - Đâu côn 0,1ml, 1ml - Đĩa petri

- Đèn cồn - Binh roux 25 cm2 - Khay inox- Đĩa nuôi cấy tê bào 4 giêng- Màng lọc vô trùng 0.2 và

0.45µm - Pipetteman 100µl, 1000µl - Eppendopf 1.5ml, 2ml- Giấy nhôm - Bông không thấm nước- Bông thấm nước- Parafin- Phễu lọc- Giấy lọc

Thiêt bi

- Tu lạnh- Tu cấy vô trùng - Tu nuôi cấy - Tu ấm - Kinh hiển vi quang học- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Máy ly tâm- Máy chuẩn ph- Nồi hấp khử trùng- Máy vortex- Máy anh kỹ thuât số

2.1.2 Hóa chất- Methanol 98 % - Cồn 960

- NaCL

- KCL- KH2PO4

- Na2HP04.12H2O- Dung dich PBS - Trypsine 0,25%- EDTA 1%

- Kháng sinh- Trypan blue 0,4%- DMEM 5% huyêt thanh

35

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp thu nhận dịch chiết cây sống đời 2.2.1.1 Nguồn mẫu

Mẫu cây sống đời đươc hái từ cây trồng tại vườn nhà.

Giờ lấy mẫu: 9 giờ

Thao tác trên mẫu: từ ngày lấy mẫu đên 10 ngày sau.

2.2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Thu nhân dich chiêt từ lá sống đời tươi.

2.2.1.3 Quy trinh thu nhân dich chiêt từ lá sống đời

Thu nhân mẫu

Lá sống đời đươc thu hái, rửa sạch, loại bo lá héo, căt bo gân lá, căt nho.

Tiên hành chiêt và thu nhân dich chiêt

- Lá sống đời căt nho đươc cho vào chày giã cho nát và ra nước.- Cho phân lá đã giã vào vai màng, bóp lấy dich tươi cua lá. Loại bo xác lá sau

khi bóp hêt nước, lọc dich lá bằng giấy lọc đên khi hêt cặn.- Bao quan lạnh dich chiêt trong chai nâu có năp đây kin, tránh ánh sáng. Trước

khi sử dụng phai đươc sang chiêt và lọc vô trùng qua màng lọc 0,2μm.

36

Sơ đồ 2.2.1 Quy trình thu dịch chiết từ lá cây sống đời

37

Nguyên liệu: lá sống đời tươi (1kg)

Lá sống đời giã nát

Dich chiêt lá sống đời tươi

Văt lấy dich tươi

Lọc qua vai màng, giấy lọc

Lọc với màng lọc vô trùng

Bao quan lạnh ở 40C

2.2.2. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nguyên bào sợi chuột từ da chuột2.2.2.1 Nguồn mẫu

Mẫu da chuột con mới sinh lấy từ lô chuột đươc nuôi tại vườn Thực vât – Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM.

Giờ lấy mẫu: 9 giờ.

Tuổi chuột: 1 – 7 ngày tuổi.

Thao tác trên mẫu từ 9 giờ tới 12 giờ cùng ngày.

2.2.2.2 Nội dung nghiên cứu

Nuôi cấy sơ cấp tê bào đơn từ da chuột sơ sinh.

Xác đinh phương pháp phù hơp để tách tê bào đơn (phương pháp trypsin ấm hay trypsin lạnh).

Khao sát kha năng tăng sinh cua tê bào trong thời gian nuôi cấy.

Khao sát mât độ tê bào sống sau thời gian nuôi cấy.

Xác đinh nồng độ dich chiêt tối ưu cho kha năng bám dinh cua tê bào biểu bi trong giai đoạn nuôi sơ cấp sau 48h.

2.2.2.3 Tiên hành thao tác vô trùng

Dụng cụ

- Dụng cụ bằng thuy tinh và kim loại đươc vô trùng bằng cách hấp khử trùng hơi nước ở 1210C, 1atm trong 30 phút.

- Dụng cụ bằng nhựa: lau bằng cồn 700, để khô tự nhiên và chiêu tia UV 1 tiêng trước khi sử dụng.

Hóa chất

- PBS, nước cất: hấp khử trùng hơi nước.- Enzyme trypsin, môi trường D’MEM: vô trùng bằng cách lọc qua màng lọc

có đường kinh 0,2μm.

38

Khu vực thao tác- Tiên hành lau cồn bê mặt nơi làm việc (bê mặt tu cấy) và chiêu tia UV khử

trùng tu cấy trong vong 30 phút.- Đặt dụng cụ thao tác thi nghiệm vào tu cấy: đèn cồn (đã khử trùng xung

quanh bê mặt bằng cồn), dụng cụ thi nghiệm, hóa chất (hấp khử trùng hoặc lọc vô trùng).

- Chiêu khử trùng UV tu cấy thêm 1 tiêng sau khi đã đặt các dụng cụ, hóa chất vào trong tu cấy.

- Sau khi tăt UV thi bât đèn cồn trong tu cấy lên và để khoang 30 phút rồi mới tiên thành thu mẫu.

Đồ bao hộ thi nghiệmÁo blouse (giặt sạch), găng tay, khẩu trang sử dụng khi thao tác đêu đươc cho vào

tu cấy chiêu UV cùng với dụng cụ.

2.2.2.4 Quy trinh thi nghiệm thu nhân mẫu da

Thu nhân mẫu

- Chuột con từ 1 - 7 ngày tuổi, đươc băt bo vào đĩa pertri có chứa sẵn cồn 70o.- Sau đó chuyển chuột sang đĩa petri để rửa 1- 2 lân bằng dung dich đệm PBS có

chứa kháng sinh ( 4000UI/ ml) nhằm khử trùng.- Đưa chuột đã khử trùng vào tu cấy.- Tiên hành căt 1 vêt ngay gáy chuột và kéo lột da ở sống lưng chuột để thu nhân

mẫu da dọc sống lưng.- Mẫu da đươc rửa 3 lân qua các đĩa petri chứa dung dich đệm PBS không kháng

sinh để loại sạch các tê bào máu.- Tiên hành căt nhuyễn manh da nhằm tăng diện tich tiêp xúc cua trypsine lên tê

bào để tạo tê bào đơn tốt nhất.

Tách tê bào đơn

Phương pháp trypsin ấm: - Cho các manh da đã căt nhuyễn vào một binh tam giác chứa 10 ml trypsin

0,25%.- Ủ các manh da với trypsine đươc khuấy trên máy khuấy từ với tốc độ 120 vong/

phút ở nhiệt độ 37oc trong vong 30 - 60 phút.

39

- Để các manh mô ổn đinh lại, thu lấy phân dich lẫn cặn đem ly tâm với tốc độ 1000vong/phút trong 10 phút.

Phương pháp trypsin lạnh: - Cho các manh da đã căt nhuyễn vào một binh tam giác chứa 15 ml trypsin

0,25%.- Đặt mẫu ở 40C trong vong 18 – 24 giờ.- Ủ các manh da với trypsine đươc khuấy trên máy khuấy từ với tốc độ 120 vong/

phút ở nhiệt độ 37oC trong vong 20 - 30 phút.

Xác đinh mât độ tê bào bằng phương pháp đêm mât độ tê bào bằng buồng đêm hồng câu, tỷ lệ % tê bào sống chêt bằng thuốc nhuộm Trypan blue.

Bảng 2.2.2.4 Thí nghiệm khảo sát nồng độ trypsin và phương pháp phù hợp để tách tế bào đơn.

Phương pháp Nồng độ (%)Tổng mât độ tê bào

(x104 tb/ml)Mât độ tê bào sống

(x104 tb/ml)

Trypsin ấm

0,200,250,300,35

Trypsin lạnh

0,200,250,300,35

Nhuộm Trypan blue

Phương pháp này sử dụng Trypan blue nhuộm tê bào để phân biệt tê bào sống và tê bào chêt. Trypan blue là một loại thuốc nhuộm màu xanh dương chỉ có thể đi xuyên qua màng tê bào chêt.

Do vây, khi dich tê bào đươc hoa với Trypan blue, những tê bào sống có kich thước nho, tron, màng con nguyên vẹn sẽ không hấp thu đươc thuốc nhuộm Trypan blue nên khúc xạ ánh sáng. Những tê bào chêt, màng bi vơ, sẽ hấp thu đươc thuốc nhuộm nên phồng lên, lớn hơn và có màu xanh sẫm.

40

- Rửa sạch buồng đêm và lamelle bằng nước cất, bằng cồn rồi để khô.- Đặt 1 miêng lamelle lên trên buồng đêm và ép dinh nó vào buồng đêm.- Lấy dich huyên phù tê bào cho vào một eppendoff, bổ sung Trypan blue 0,4%

vào eppendoff theo tỉ lệ 1:1 với dich huyên phù, hoa đêu bằng micropipette, rồi hút dich tê bào này cho vào buồng đêm.

- Đêm số tê bào sống có trong 5 ô lớn ở vùng trung tâm cua buồng đêm trong vong 10 – 15 phút. Mỗi mẫu thực hiện đêm 3 lân.

Đêm tê bào bằng buồng đêm hồng câu

Hình 2.2.2.4 Buồng đếm hồng cầu loại 25 ô lớn

* Quy tăc đêm: đêm tê bào trong mỗi ô theo phương pháp : cân ria trên – trái thi đêm, áp dụng cho ca 5 ô đêm ; cân ria phai – dưới thi bo không đêm.

Công thức tinh

Mât độ tê bào trong 1ml là: C = N × d× 104

5 tê bào/ml.

Trong đó:

C: số tê bào trong 1 ml dich nuôi.

N: số tê bào trong 5 ô vuông lớn.

d: nồng độ pha loãng.

2.2.2.5 Khao sát kha năng tăng sinh cua tê bào khi bổ sung dich chiêt sống đời.

41

- Tê bào sau khi tách rời đươc nuôi trong môi trường sơ cấp có bổ sung dich chiêt sống đời với mât độ tê bào 3 x 105 tê bào/ cm2 bê mặt chai nuôi, nuôi trong điêu kiện nhiệt độ 370C.

- Quan sát sự tăng trưởng cua tê bào dưới kinh hiển vi sau các mốc thời gian 1, 2, 3, 4, 5, 6 ngày.

- Tiên hành song song thi nghiệm quan sát sự tăng sinh cua tê bào trong môi trường không bổ sung dich chiêt và so sánh kêt qua.

2.2.2.6 Khao sát kha năng bám cua tê bào khi bổ sung dich chiêt sống đời.

- Tê bào sau khi tách rời đươc nuôi trong môi trường sơ cấp có bổ sung dich chiêt sống đời với mât độ tê bào 3 x 105 tê bào/ cm2 bê mặt chai nuôi, nuôi trong điêu kiện nhiệt độ 370C.

- Quan sát sự bám cua tê bào dưới kinh hiển vi sau các mốc thời gian 6, 7, 8 ngày.- Tiên hành song song thi nghiệm quan sát sự bám cua tê bào trong môi trường

không bổ sung dich chiêt và so sánh kêt qua.

2.2.2.7 Khao sát thể tich dich chiêt tối ưu cho kha năng tăng sinh và bám cua tê bào trong giai đoạn nuôi sơ cấp.

- Tiên hành thi nghiệm bổ sung các thể tich dich chiêt khác nhau vào môi trường nuôi để khao sát kha năng tăng sinh cua tê bào.

- Xác đinh thể tich dich chiêt tối ưu cho kha năng bám cua loại tê bào này.Trong thi nghiệm này, môi trường D’MEM đươc bổ sung lân lươt với các

thể tich 10μl, 20μl, 30μl, 40μl 50μl, 60μl dich chiêt cây sống đời. Mỗi thể tich ta lặp lại 3 lân ở các thời gian khác nhau sau đó quan sát dưới kinh hiển vi.

42

Sơ đồ 2.2.2 Quy trình phân lập và nuôi cấy nguyên bào sợi từ da chuột

2.2.3. Xử lý số liệuSố liệu thu nhân đươc xử lý bằng phân mêm STATGRAPHICS Centurion

XV.I, tinh toán thống kê sai số chuẩn và độ khác biệt có ý nghĩa nho nhất ở mức ý nghĩa 95% bằng phương pháp phân tich phương sai ANOVA theo chương trinh phân tich hồi quy tuyên tinh.

43

Tách lấy da chuột

Rửa da qua PBS bổ sung kháng sinh, căt nho manh da

Ủ mẫu bằng trypsin

Ly tâm loại trypsin (1000 vong/phút, 10 phút, 40C)

Đưa mô vào giêng nuôi và nuôi trong tu ấm 370C

Quan sát tê bào và thực hiện các chỉ tiêu khao sát

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

44

3.1 Thu nhân dich chiêt từ lá cây sống đờiDich chiêt đươc chiêt thô bằng phương pháp cơ học: nghiên nhuyễn lá tươi và văt

lấy dich. Dich tươi sau khi đươc lọc qua vai màng và giấy lọc chỉ con lại màu vàng xanh do các phân tử lớn như diệp lục tố đã bi loại bo. Các phân tử nho hơn như acid amin, vitamin, các hơp chất hữu cơ khác vẫn đươc giữ lại trong dich chiêt.

Ở đây, chúng tôi chọn phương pháp cơ học để chiêt dich thô nhằm để các hơp chất hữu cơ cân thiêt cho tê bào tăng trưởng và mọc bám không bi biên tinh bởi nhiệt độ và các yêu tố dung môi như khi chiêt bằng các phương pháp hóa học. Bên cạnh đó, khi chiêt bằng các phương pháp hóa học, dung môi trong dich chiêt nêu không đươc loại kiệt thi sẽ gây độc cho tê bào nuôi.

Hình 3.1 Dịch chiết lá sống đời tươi3.2 Khao sát kha năng tách tê bào đơn bằng phương pháp trypsin ấm và trypsin lạnh.

Chúng tôi tiên hành nhuộm trypan blue 0,4% và đêm tê bào bằng buồng đêm hồng câu để khao sát mât độ tê bào đơn sống, chêt đươc tách bằng các phương pháp trypsin ấm và lạnh.

Khi nhuộm trypan blue, tê bào sống sẽ không băt màu, tê bào chêt sẽ băt màu xanh cua thuốc nhuộm.

45

Hình 3.2 Tế bào được nhuộm với trypan blue

3.2.1 Trypsin ấmBang 3.2.1.1: Tổng mât độ tê bào đơn khi u với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau.

Nồng độ (%) 0,20 0,25 0,30 0,35Mât độ (x104 tê

bào/ml)25 ± 4,58a 45 ±10,82b 46 ±10,54b 27 ± 9a

Chỉ số Pvalue 0,0367

Bang 3.2.1.2: Mât độ tê bào đơn sống khi u với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau.

Nồng độ (%) 0,20 0,25 0,30 0,35Mât độ (x104tê

bào/ml)23 ± 4,00b 38 ±8,89c 34,67 ±10,02bc 8,33 ± 3,06a

Chỉ số Pvalue 0,0037

46

Biểu đồ 3.2.1 Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau.

Dựa vào bang 3.2.1.2 và biểu đồ 3.2.1, chúng tôi nhân thấy khi tách tê bào đơn từ da chuột bằng quy trinh trypsin ấm, số lương tê bào đơn cao nhất là 38 × 104 tê bào/ml ở nồng độ trypsin 0,25%, thấp nhất là ở nồng độ trypsin 0,35% với số lương tê bào đơn sống tách đươc là 8,33 × 104 tê bào/ml. Sự khác biệt này hoàn toàn có ý nghĩa xét vê mặt thống kê vi Pvalue < 0,05.

Số lương tê bào đơn sống ở nồng độ 0,35% là thấp nhất do nồng độ trypsin cao sẽ tác động mạnh hơn nhưng gây chêt hoặc vơ tê bào.

3.2.2 Trypsin lạnhBang 3.2.2.1: Tổng mât độ tê bào đơn khi u với trypsin lạnh ở các nồng độ khác

nhau.

Nồng độ (%) 0,20 0,25 0,30 0,35Mât độ (x104 tê

bào/ml)35,33 ± 6,11a 76 ±9,17b 94 ±7,21c 96,67 ± 8,08c

Chỉ số Pvalue 0,0000

Bang 3.2.2.2: Mât độ tê bào đơn sống khi u với trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau.

Nồng độ (%) 0,20 0,25 0,30 0,35Mât độ (x104 tê

bào/ml)27,33 ± 2,31a 61,33 ±6,11b 63,33 ±13,32b 50,67 ± 16,78b

47

Chỉ số Pvalue 0,0042

Biểu đồ 3.2.2.1 Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin lạnhở các nồng độ khác nhau.

Dựa vào bang 3.2.2.2 và biểu đồ 3.2.2.1, chúng tôi nhân thấy khi tiên hành phương pháp trypsin lạnh, số lương tê bào đơn sống cao nhất là 63,33 × 104 tê bào/ml ở nồng độ trypsin 0,3%. Nồng độ trypsin 0,2% cho hiệu qua tách tê bào đơn sống thấp nhất. Sự so sánh này là có ý nghĩa vi giá tri Pvalue < 0,05.

Bên cạnh đó, theo ý nghĩa thống kê, phương pháp trypsin lạnh có ba nồng độ cho kêt qua tách tê bào tốt như nhau là 0,25%; 0,3% và 0,35%. Tuy nhiên, chúng tôi chọn nồng độ trypsin tối ưu cho việc tách tê bào đơn là 0,25% vi tiêt kiệm đươc hóa chất.

Sau khi sử dụng 2 phương pháp tách tê bào là quy trinh trypsin ấm và quy trinh trypsin lạnh. Chúng tôi tiên hành đêm số lương tê bào sống thu đươc từ mẫu và so sánh. Kêt qua đươc trinh bày ở Bang 3.2.2.3 và Biểu đồ 3.2.2.2.

48

Bang 3.2.2.3: Xác đinh phương pháp phù hơp để tách tê bào đơn.

Phương pháp Nồng độ (%)Tổng mât độ tê bào

(x104 tb/ml)Mât độ tê bào sống

(x104 tb/ml)

Trypsin ấm

0,20 25 23 ± 4,00b

0,25 45 38 ±8,89c

0,30 46 34,67 ±10,02bc

0,35 27 8,33 ± 3,06a

Trypsin lạnh

0,20 35,33 27,33 ± 2,31a

0,25 76 61,33 ±6,11b

0,30 94 63,33 ±13,32b

0,35 96,67 50,67 ± 16,78b

Biểu đồ 3.2.2.2 So sánh mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm và trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau.

Nêu so sánh giữa hai phương pháp tách tê bào ở cùng nồng độ trypsin 0,25% thi số lương tê bào đơn sống trung binh thu đươc từ quy trinh trypsin lạnh (61,33 × 104tê bào/ml) cao hơn nhiêu so với quy trinh trypsin ấm (38 × 104 tê bào/ml). Sự khác biệt này là có ý nghĩa vi giá tri Pvalue < 0,05. Nguyên nhân có thể do ở phương pháp trypsin ấm, tê bào đươc tách bằng trypsin ở nhiệt độ 370C nên có một số tê bào bi chêt dưới tác

49

động cua trypsin; con ở phương pháp trypsin lạnh (40C) tê bào it bi anh hưởng hơn. [12, 20].

3.3. Khao sát kha năng tăng sinh và bám cua tê bào nguyên bào sơi chuột trong môi trường D’MEM có và không có bổ sung dich chiêt sống đời.

3.3.1 Quá trình tăng sinh và bám của tế bào nguyên bào sợi chuột trong môi trường D’MEM 5% huyết thanh thỏ.

Sau khi quan sát giêng nuôi tê bào trong vong 8 ngày, chúng tôi nhân thấy sau ba ngày nuôi có nhiêu tê bào di trú ra ngoài manh mô nhưng vẫn chưa bám vào đáy giêng nuôi và chưa có hinh dạng đặc trưng.

Hình 3.3.1.1 Tế bào nuôi ngày thứ nhất

Hình 3.3.1.2 Tế bào nuôi ngày thứ ba50

Đên ngày thứ năm, tê bào tăng trưởng mạnh, đây giêng. Tuy nhiên vẫn chưa có tê bào nào có hinh dạng đặc trưng cho nguyên bào sơi.

Hình 3.3.1.3 Tế bào nuôi ngày thứ năm

Hình 3.3.1.4 Tế bào nuôi ngày thứ bảy

51

Đên ngày thứ tám, xuất hiện một số tê bào bám có hinh thoi nhưng chưa kéo dài thành nhánh. Thời gian này tê bào trao đổi chất mạnh để tổng hơp các protein bám vào bê mặt giêng nuôi.

Hình 3.3.1.5 Tế bào nuôi ngày thứ tám

3.3.2 Quá trình tăng sinh của tế bào nguyên bào sợi chuột trong môi trường D’MEM 5% huyết thanh thỏ có bổ sung dịch chiết từ lá cây sống đời.

Ở giêng nuôi có bổ sung dich chiêt sống đời, tê bào tăng sinh mạnh hơn, đên ngày thứ ba đã đây giêng, mât độ tê bào dày đặc hơn so với giêng nuôi không đươc bổ sung dich chiêt.

Hình 3.3.2.1 Tế bào nuôi ngày thứ nhất

52

Hình 3.3.2.2 Tế bào nuôi ngày thứ ba

Đên ngày thứ tư, xuất hiện một số tê bào bám. Chúng tôi nhân thấy tốc độ bám cua tê bào trong môi trường dich chiêt nhanh gấp đôi so với tê bào đươc nuôi trong môi trường không bổ sung dich chiêt.

Hình 3.3.2.3 Tế bào nuôi ngày thứ tư

Đên ngày thứ năm đã có nhiêu tê bào bám vào bê mặt giêng nuôi. Lúc này các protein bám cua tê bào đã đươc tổng hơp đây đu nên tê bào có hinh dạng đặc trưng là

53

hinh thoi kéo dài.

Hình 3.3.2.4 Tế bào nuôi ngày thứ nămSau quá trinh nuôi song song tê bào đơn tách từ da chuột sơ sinh, chúng tôi nhân

thấy trong môi trường nuôi có bổ sung dich chiêt, tê bào tăng trưởng và bám nhanh hơn so với môi trường gốc do trong dich chiêt có chất Kaempferol – 3 – glucoside, một chất tương tự như collagen trong tê bào động vât. Chất này sẽ kich thich tê bào tăng trưởng và bám dinh [16, 22, 26]. 3.4. Khao sát thể tich dich chiêt tối ưu khi bổ sung dich chiêt lá cây sống đời vào môi trường nuôi cấy.

Chúng tôi tiên hành khao sát thể tich tối ưu cho kha năng bám cua tê bào nguyên sơi chuột trên môi trường D’MEM 5% huyêt thanh tho có bổ sung thêm dich chiêt từ lá cây sống đời. Quá trinh khao sát diễn ra trong vong 5 ngày.

Khi bổ sung dich chiêt vào môi trường nuôi với thể tich 10μl, tê bào nguyên bào sơi mọc và bám nhưng không nhiêu bằng lương tê bào bám ở giêng nuôi bổ sung 20 μl dich chiêt.

54

Hình 3.4.1 Tế bào nuôi ở thể tích dịch chiết 10μl

Hình 3.4.2 Tế bào nuôi ở thể tích dịch chiết 20μl

55

Ở nồng độ 30μl, 40μl các tê bào đơn đã tách không có sự tăng sinh.

Hình 3.4.3 Tế bào nuôi ở thể tích dịch chiết 30μl

Với giêng nuôi bổ sung 50μl dich chiêt, tê bào băt đâu bi tiêu biên và ở thể tich 60μl tê bào bi tiêu biên hoàn toàn.

Hình 3.4.4 Tế bào nuôi ở thể tích dịch chiết 60μl

56

Chúng tôi nhân thấy rằng thể tich dich chiêt tối ưu cho tê bào phát triển và bám là 20μl; con ở thể tich 30μl, 40μl xay ra hiện tương ức chê sự phát triển cua tê bào. Ở giêng nuôi bổ sung 50μl, 60μl dich chiêt, tê bào bi tiêu biên do nồng độ dich chiêt quá cao dẫn đên sốc nhươc trương gây chêt tê bào.

57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

58

4.1 Kêt luânThu nhân đươc dich chiêt thô từ lá cây sống đời tươi.Xác đinh đươc phương pháp phù hơp cho việc tách tê bào đơn, đó là phương pháp

trypsin lạnh.Ổn đinh đươc tê bào đơn trong nuôi cấy sơ cấp.Khao sát đươc thời gian tăng sinh và bám cua tê bào trong môi trường nuôi

D’MEM 5% huyêt thanh tho có bổ sung dich chiêt lá cây sống đời. Tê bào tăng sinh đây giêng trong ba ngày và đên ngày thứ tư thi băt đâu bám vào giêng.

Xác đinh đươc thể tich dich chiêt tối ưu bổ sung vào 0,3ml môi trường nuôi cấy là 20μl.4.2 Kiên nghi

Tiên hành tách và thu nhân dich chiêt tinh từ lá cây sống đời tươi. Cân khao sát việc nuôi cấy tê bào trong điêu kiện có sục khi CO2.Nêu có thêm thời gian, chúng tôi sẽ khao sát thêm sự tạo lớp cua tê bào khi bổ sung

dich chiêt lá cây sống đời.Cân khao sát sự tăng trưởng cua tê bào qua các mốc thời gian nuôi cấy bằng

phương pháp hóa học như phương pháp MTT.Tiên hành cấy chuyên tê bào sơ cấp, sau đó nuôi và thu nhân đươc đúng nguyên

bào sơi chuột. Phát triển quy trinh nuôi cấy cho nguyên bào sơi người.

59

TÀI LIỆU THAM KHẢO

60

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT[1] PGS. TS Trinh Binh (2003) Mô học, NXB Y học Hà Nội.[2] Phạm Phan Dich, Trinh Binh, Đỗ Kinh (1998) Mô học, NXB Y học Hà Nội.[3] Phan Thanh Hà (2002) Bước đầu nuôi cấy và thử nghiệm độc tính trên tế bào biểu bì chuột nhắt trắng (mus musculus var. Albino), Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM.[4] PGS. TS. Nguyễn Như Hiên (2007), Công nghệ sinh học, tập 1: Sinh học phân tử và tế bào, Cơ sở khoa học của công nghệ sinh học, NXB Giáo dục.[5] Trân Vân Hiên, Chu Quốc Trường (2005) Áp dụng kỹ thuât MTT để đánh giá tác dụng bao vệ tê bào lách chuột chiu stress oxy hoá cua các dich chiêt Hà thu ô, Cúc hoa vàng, Tạp chí của Bệnh Viện YHCT TW; Học Viện Quân Y – Viện dược liệu, Tâp 1. [6] Trân Thi Ngọc Lơi (2007), Khảo sát quy trình tạo dòng nguyên bào sợi người từ da bao quy đầu, Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM.[7] Nguyễn Đức Lương, Lê Thi Thuy Tiên (2006), Công nghệ tê bào, NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM. [8] Phan Kim Ngọc (2002), Giáo trình thực tập cơ sở Công nghệ sinh học Động vật, NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM.[10] Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ sinh học người và động vật, NXH Đại học Quốc Gia TP.HCM.[11] Nguyễn Ngọc Thanh Thao (2007), Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà, Đại học Nông Lâm TP.HCM.[12] Phạm Lê Bửu Trúc (2009), Khao sát kha năng biệt hóa tê bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người thành tê bào tiêt insulin bằng hóa chất và bằng dich tiêt tụy chuột, Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM.[13] Lê Thê Trung (2003) Bỏng – những kiến thức chuyên ngành, NXB Y học, chi nhánh TP.HCM.[14] Lê Thi Mộng Tuyên (2006), Thiết kế nguyên liệu phủ vết thương từ nguyên bào sợi và màng ối người, Đại học Khoa học tự nhiên, TP.HCM.[15] Tiên Văn Sên (2004), Thử nghiệm phân lập và tạo dòng nguyên bào sợi từ mô phôi thai người, Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM.[16] GS. TS. Vũ Văn Vụ, PGS. TS. Nguyễn Mộng Hùng (2006), Công nghệ sinh học, tập 2: CNSH tế bào, NXB Giáo dục.

61

TÀI LIỆU TIẾNG ANH[17] Subrata Kumar Biswas et al (2011) Literature review on pharmacological potentials of Kalanchoe pinnata (Crassulaceae), African Journal of Pharmacy and Pharmacology Vol. 5(10), pp. 1258-1262[18]Cheryl D., Helgason Cindy L., Miller (2005), Basic cell culture protocols, Jonh Wiley and Sons Inc.[19] Br J Dermatol , Hume WJ (1985) Keratinocyte proliferative hierarchies confer protective mechanisms in surface epithelia, vol 112 : 493 – 502.[20] R. Ian Fresney (1994) Culture of animal cells, a manual of basic techniques, Wiley-Liss Inc, page: 1 – 16, 71 – 101, 133 – 147, 170, 328.[21] Frizell LV, Ludmila IB, Isolation, purification and cultivation of murine and human keratinocytes, Methods in molecular biology, vol. 290 : basic cell culture protocols, third edition, 187-194. [22] John D. Griffin, Ph.D (2006), Fluorescense Digital Image Gallery – Cell in culture, National High Magnetic Field Laboratory, The Florida State University.[23] B. Joseph, S. Sridhar, et al (2011) Rare Medicinal Plant-Kalanchoe Pinnata. Research Journal of Microbiology, 6: 322-327.[24] Elaine N. Marieb (2000), Human Anatomy and Physiology, page: 135 – 196.[25]Quazi Majaz A., PhD. (2011) The Miracle plant (Kalanchoe Pinnata): A phytochemical and pharmacological review, IJRAP Journal 2 (5), page: 1478 – 1482[26] Shashank Matthew, K.K. Khosla et al (2013) Preliminary Phytochemical Studies of Kalanchoe Pinnata (Lam.) Pers, Journal of medicinal Plants Studies, 2, vol 1, 19 – 23.[27] B Shivananda Nayak, et al (2010) Wound healing potential of ethanolic extract of Kalanchoe pinnata Lam. Leaf, Indian Journal of Experimental Biology vol.48, 572 – 576.[28] Shazid M. Sharker, Mohammad K. Hossain et al (2012) Chemaical and biological studies of Kalanchoe pinnata (Lam.) growing in Bangladesh, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, S1317 – S1322. [29] Soosan G, Lorne BT ( 2005), Organization of stem cell and their progeny in human epidermis, Journal of Invest Dermatol, vol 124 : 367-372[30] Susan SY ( 2003) Current Protocols in cell biology, Jonh Wiley and Sons Inc., 155-160

62

PHỤ LỤC

63

Bang 2.1.3a : công thức pha dung dich PBS

Thành phân Hàm lương

NaCl 5g

KH2PO4 0,125g

Na2HP04.12H2O 1,803g

KCL 0,125g

Nước cất 2 lân vừa đu 500ml

pH 7,4Hấp khử trùng bằng autoclave ( 1210c, 1atm, 15p phút), bao quan nhiệt độ -40c.

Bang 2.1.3b : công thức pha dung dich trypsine 0,25%

Thành phân Hàm lương

Trypsine ( china) 0,25

PBS 100ml

Bang 2.1.3c : công thức pha EDTA 1%

Thành phân Hàm lương

EDTA ( china) 0.05g

PBS 50ml

Lọc qua màng lọc vô trùng đường kinh lỗ lọc 0,2µm. Bao quan lạnh.

64

Bang 2.1.3d : công thức pha kháng sinh

Thành phân Hàm lương

Penicillin ( 4000IU/ml) 4ml

Streptomycine ( 400µg/ml) 0.8ml

Gentamycine ( 400µg/ml) 4ml

PBS 191,2ml

Lọc qua màng lọc vô trùng 0,2µm

Bang 2.1.3e : công thức pha Trypan blue

Thành phân Hàm lương

Trypan blue bột 0,4g

PBS 100ml

Lọc lại bằng giấy lọc

Bang 2.1.3f: công thức pha DMEM 5% huyêt thanh

Thành phân Hàm lương

DMEM bột 15,6g

NaHCO3 1,2g

Phenol red 0,01g

Nước cất 2 lân 1000ml

pH 7,4

Lọc qua màng lọc vô trùng đường kinh lỗ lọc 0,2µm; bao quan lạnh.

65Nong do Count Average Standard

deviationCoeff. of variation

Minimum Maximum Range Stnd. skewness

0.2 3 25.0 4.58258 18.3303% 21.0 30.0 9.0 0.66130.25 3 45.0 10.8167 24.037% 33.0 54.0 21.0 -0.8146360.3 3 46.0 10.5357 22.9036% 36.0 57.0 21.0 0.2992990.35 3 27.0 9.0 33.3333% 18.0 36.0 18.0 0.0

66

Nong do Count Average Standard deviation

Coeff. of variation

Minimum Maximum Range Stnd. skewness

0.2 3 25.0 4.58258 18.3303% 21.0 30.0 9.0 0.66130.25 3 45.0 10.8167 24.037% 33.0 54.0 21.0 -0.8146360.3 3 46.0 10.5357 22.9036% 36.0 57.0 21.0 0.2992990.35 3 27.0 9.0 33.3333% 18.0 36.0 18.0 0.0

Nong do Count Average Standard deviation

Coeff. of variation

Minimum Maximum Range Stnd. skewness

0.2 3 25.0 4.58258 18.3303% 21.0 30.0 9.0 0.66130.25 3 45.0 10.8167 24.037% 33.0 54.0 21.0 -0.8146360.3 3 46.0 10.5357 22.9036% 36.0 57.0 21.0 0.2992990.35 3 27.0 9.0 33.3333% 18.0 36.0 18.0 0.0Total 12 35.75 12.8213 35.8638% 18.0 57.0 39.0 0.512347

Source Sum of Squares

Df Mean Square

F-Ratio P-Value

Between groups

1148.25 3 382.75 4.64 0.0367

Within groups 660.0 8 82.5Total (Corr.) 1808.25 11

Nong do Count Mean Homogeneous Groups

0.2 3 25.0 X0.35 3 27.0 X0.25 3 45.0 X0.3 3 46.0 X

Bang 3.2a: Tổng mât độ tê bào đơn khi u với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau.

Nong do Count Average Standard deviation

Coeff. of variation

Minimum Maximum Range Stnd. skewness

0.2 3 25.0 4.58258 18.3303% 21.0 30.0 9.0 0.66130.25 3 45.0 10.8167 24.037% 33.0 54.0 21.0 -0.8146360.3 3 46.0 10.5357 22.9036% 36.0 57.0 21.0 0.2992990.35 3 27.0 9.0 33.3333% 18.0 36.0 18.0 0.0Total 12 35.75 12.8213 35.8638% 18.0 57.0 39.0 0.512347

Source Sum of Squares

Df Mean Square

F-Ratio P-Value

Between groups

1148.25 3 382.75 4.64 0.0367

Within groups 660.0 8 82.5Total (Corr.) 1808.25 11

Nong do Count Mean Homogeneous Groups

0.2 3 25.0 X0.35 3 27.0 X0.25 3 45.0 X0.3 3 46.0 X

Bang 3.2.1.2: Mât độ tê bào đơn sống khi u với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau.

Nong do song

Count Mean Homogeneous Groups

0.35 3 8.33333 X0.2 3 23.0 X0.3 3 34.6667 XX0.25 3 38.0 X

67

Nong do song

Count Average Standard deviation

Coeff. of variation

Minimum Maximum Range

0.2 3 23.0 4.0 17.3913% 19.0 27.0 8.00.25 3 38.0 8.88819 23.39% 28.0 45.0 17.00.3 3 34.6667 10.0167 28.8942% 27.0 46.0 19.00.35 3 8.33333 3.05505 36.6606% 5.0 11.0 6.0Total 12 26.0 13.5848 52.249% 5.0 46.0 41.0

Source Sum of Squares

Df Mean Square

F-Ratio P-Value

Between groups

1620.67 3 540.222 10.56 0.0037

Within groups 409.333 8 51.1667Total (Corr.) 2030.0 11

Bang 3.2a: Tổng mât độ tê bào đơn khi u với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau.

Nong do Count Average Standard deviation

Coeff. of variation

Minimum Maximum Range Stnd. skewness

0.2 3 25.0 4.58258 18.3303% 21.0 30.0 9.0 0.66130.25 3 45.0 10.8167 24.037% 33.0 54.0 21.0 -0.8146360.3 3 46.0 10.5357 22.9036% 36.0 57.0 21.0 0.2992990.35 3 27.0 9.0 33.3333% 18.0 36.0 18.0 0.0Total 12 35.75 12.8213 35.8638% 18.0 57.0 39.0 0.512347

Source Sum of Squares

Df Mean Square

F-Ratio P-Value

Between groups

1148.25 3 382.75 4.64 0.0367

Within groups 660.0 8 82.5Total (Corr.) 1808.25 11

Nong do Count Mean Homogeneous Groups

0.2 3 25.0 X0.35 3 27.0 X0.25 3 45.0 X0.3 3 46.0 X

Bang 3.2.2.1: Tổng mât độ tê bào đơn khi u với trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau.

C.Nong do Count Mean Homogeneous Groups

0.2 3 35.3333 X0.25 3 76.0 X0.3 3 94.0 X0.35 3 96.6667 X

68

C.Nong do Count Average Standard deviation

Coeff. of variation

Minimum Maximum Range Stnd. skewness

0.2 3 35.3333 6.1101 17.2927% 30.0 42.0 12.0 0.66130.25 3 76.0 9.16515 12.0594% 68.0 86.0 18.0 0.66130.3 3 94.0 7.2111 7.67139% 88.0 102.0 14.0 0.8146360.35 3 96.6667 8.0829 8.36162% 88.0 104.0 16.0 -0.510608Total 12 75.5 26.4386 35.018% 30.0 104.0 74.0 -1.17696

Source Sum of Squares

Df Mean Square

F-Ratio P-Value

Between groups

7211.67 3 2403.89 40.29 0.0000

Within groups 477.333 8 59.6667Total (Corr.) 7689.0 11

Bang 3.2a: Tổng mât độ tê bào đơn khi u với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau.

Nong do Count Average Standard deviation

Coeff. of variation

Minimum Maximum Range Stnd. skewness

0.2 3 25.0 4.58258 18.3303% 21.0 30.0 9.0 0.66130.25 3 45.0 10.8167 24.037% 33.0 54.0 21.0 -0.8146360.3 3 46.0 10.5357 22.9036% 36.0 57.0 21.0 0.2992990.35 3 27.0 9.0 33.3333% 18.0 36.0 18.0 0.0Total 12 35.75 12.8213 35.8638% 18.0 57.0 39.0 0.512347

Source Sum of Squares

Df Mean Square

F-Ratio P-Value

Between groups

1148.25 3 382.75 4.64 0.0367

Within groups 660.0 8 82.5Total (Corr.) 1808.25 11

Nong do Count Mean Homogeneous Groups

0.2 3 25.0 X0.35 3 27.0 X0.25 3 45.0 X0.3 3 46.0 X

Bang 3.2.2.2: Mât độ tê bào đơn sống khi u với trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau.

Lanh nong do

Count Average Standard deviation

Coeff. of variation

Minimum Maximum Range

0.2 3 27.3333 2.3094 8.44903% 26.0 30.0 4.00.25 3 61.3333 6.1101 9.96212% 56.0 68.0 12.00.3 3 63.3333 13.3167 21.0263% 52.0 78.0 26.00.35 3 50.6667 10.0664 19.868% 40.0 60.0 20.0Total 12 50.6667 16.7838 33.126% 26.0 78.0 52.0

Source Sum of Squares

Df Mean Square

F-Ratio P-Value

Between groups

2456.0 3 818.667 10.19 0.0042

Within groups 642.667 8 80.3333Total (Corr.) 3098.67 11

Lanh nong do

Count Mean Homogeneous Groups

0.2 3 27.3333 X0.35 3 50.6667 X0.25 3 61.3333 X0.3 3 63.3333 X