Upload
dama-kamelijama
View
199
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Laktat dehidrogenaza
Predavanja iz Kliničke enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija-
medicinska biohemija Školska 2014/2015. godina
Laktat dehidrogenaza
• Enzim anaerobne faze glikolize • EC 1.1.1.127 • L-laktat: NAD+ oksidoreduktaza; LD ili LDH • Katalizuje reakciju oksidacije L-laktata u piruvat • NAD+ je akceptor vodonika
Uloga koenzima NAD u reakciji laktat dehidrogenaze
Katalitički ciklus laktat dehidrogenaze Vezivanje koenzima za enzim i pomak petlje 98-111
• Katalitička trijada:
arginin 171 histidin 195 i arginin 109
• Vezivanje supstrata za aktivni centar
• Redoks reakcija:
transfer vodonika sa NADH na piruvat
transfer protona
• Oslobađanje laktata
• Pomak petlje i oslobađanje NAD+
Izoenzimi LDH
• 5 izoenzima
• LD-1 (HHHH; H4);
• LD-2 (HHHM; H3M) ;
• LD-3 (HHMM; H2M2);
• LD-4 (HMMM; HM3) i
• LD-5 (MMMM; M4).
Obeležavanje prema elektroforetskoj pokretljivosti LD-1 najveća anodna pokretljivost
Struktura LD: H i M subjedinice Kinetičke karakteristike
• M-muscle mišićni – Sadrži više bazne aminokiseline
– Putuje sporije
– Tkiva sa visokom glikolitičkom aktivnošću
– Anaerobni uslovi
– LD M4 ima nisku Km za piruvat
– Favorizuje redukciju piruvata
– Visoka konc piruvata ne inhibira M4 izoenzim
• Genski lokus na hromozomu 11
• H-heart srčani – Sadrži više kisele ostatke aminokiselina
– Negativno naelektrisan
– Putuje brže anodno
– Tkiva sa povećanom potrošnjom kiseonika
– Aerobna tkiva (srčani mišić)
– LD H4 ima višu Km za piruvat
– Višak piruvata alosterno inhibira LDH4
– Više oksidacija laktata
• Genski lokus na hromozomu 12
Dva gena su specijalizovana za različita tkiva Razlike H i M subjedinica u afinitetu za supstrat, vrednostima Km i inhibiciji piruvatom
Distribucija LD i izoenzima LD
• LD aktivnost je prisutna u svim ćelijama organizma
• Citoplazmatični enzim
• Koncentracija enzima u svim tkivima je 1500 do 5000 puta veća nego u serumu
• Svako oštećenje ćelije pa i minimalno značajno povećava aktivnost LD u serumu
• Mala dijagnostička specifičnost ovog serumskog enzima
• Serumski izoenzimski profil:
• LD 2 >LD 1> LD 3 > LD 4 > LD 5
Distribucija LD i izoenzima LD
• Različita tkiva pokazuju različit izoenzimski profil
• Srčani mišić, bubrezi i eritrociti – Elektroforetski brži izoenzimi
– Anodni izoenzimi
– LD-1 i LD-2 dominiraju
• Jetra i skeletni mišići – Elektroforetski sporiji izoenzimi
– Katodni izoenzimi
– LD-4 i LD-5 dominiraju
– Mada u slučaju oštećenja mišića javljaju se i anodni izoenzimi
• Izoenzimi intermedijarne pokretljivosti se nalaze u mnogim tkivima: slezini, pluća, limfne žlezde, leukociti i trombociti
Distribucija izoenzima laktat dehidrogenaze u različitim organima
Distribucija izoenzima laktat dehidrogenaze u serumu
Serumski izoenzimski profil laktat dehidrogenaze: LD 2 >LD 1> LD 3 > LD 4 > LD 5
Distribucija izoenzima LD u testisima
• Neki genski lokusi mogu biti eksprimirani samo u jednom tkivu, kao rezultat određenog stupnja razvoja.
• Pored dva genska lokusa koji određuju dve uobičajene subjedinice laktat dehidrogenaze, treći lokus je aktivan samo u zrelim testisima.
• Treći tip subjedinica, X ili C, koji daje specifičan izoenzim, LD-X ili LD-C koji se nalazi u testisima
• Šesti izoenzim
• Sedmi izoenzim ili LD-6 je identifikovan u serumu teško obolelih.
Promene u distribuciji izoenzima kod fetusa i beba
Moj glavni izoenzim LD je HM3 ??
• Kod fetusa srce je u anaerobnim uslovima
• Dominira M4 izoenzim • Prelaz postepeni u HM3 • Bebe imaju na rođenju HM3 • Posle H2M2 • 1.godina H3M • 2.godina H4
Primeri razlika u distribuciji izoenzima laktat dehidrogenaze u srcu i jetri kod odraslih i fetusa
Kinetičke karakteristike LD
Specifičnost prema supstratima → HBD izoenzim Inhibicija LD 1. LD je inhibiran reagensima koji deluju na SH grupe
– Merkuri jon i p-hloromerkuribenzoat – Reverzibilna inhibicija – Dodatak cisteina ili glutationa
2. Kompetitivni inhibitori za supstrat ili produkt reakcije • Borat i oksalacetat
– Kompeticija sa laktatom za vezivanje za isto mesto na enzimu • Oksamat
– Kompeticija sa piruvatom za isto mesto vezivanja.
3. Inhibicija supstratima – Piruvat i laktat u višku inhibiraju enzimsku reakciju – Piruvat više inhibira – Inhibicija supstratom se smanjuje ako se poveća pH
4. EDTA inhibira enzim verovatno vezujući Zn.
Klinički značaj LD i izoenzima
• Obzirom na široku rasprostranjenost u svim tkivima, povećane vrednosti aktivnosti LD u serumu se javlja u raznim kliničkim stanjima: – infarktu miokarda
– hemolizi
– bolesti jetre, bubrega, pluća i mišića
• Određivanje aktivnosti serumske LD u dijagnostici: – infarkta miokarda, hemolitičke anemije, tumora ovarijuma i tumora
germinalnih ćelija testisa.
• Za praćenje bolesti LD je relevantna kao prediktor preživljavanja kod – Hodčkinsonove bolesti i non-Hodčkinovog limfoma i za praćenje
disgerminoma.
Klinički značaj LD
Akutni infarkt miokarda • Ukupna LD
• Izoenzimski profil
• Izoenzimi LD – LD-1 i LD-2 (α-HBD)
– Specifičnost prema supstratu α-hifroksibutirat
• Dinamika promena LD i izoenzima α-HBD u akutnom infarktu miokarda
• Porast enzima posle AIM u satima ili danima
• Poređenje sa ostalim srčanim markerima
18
Biohemijski markeri akutnog infarkta miokarda
Neenzimski • Mioglobin • Troponin I • Troponin T
Enzimski • CK • CK MB aktivnost • CK MB masa • AST • LD • HBD • Glikogen fosforilaza BB
Rani markeri Do 6 sati od simptoma
Kasni markeri 6 sati od simptoma i ostaju nekoliko dana
19
Biohemijski markeri akutnog infarkta miokarda
Specifični • cTnT • cTnI • CK-MB masena • CK-MB aktivnost
• Novi markeri • Glikogen fosforilaza bb • Laki lanci miozina LMC • LMC-myosin light chains
Nespecifični • Mioglobin • AST • LD • CK
20
Kriterijumi za kardijačne biomarkere
• Kardijačni biomarkeri su biološki analiti koji se mogu detektivati u cirkulaciji u toku KVB ili posle oštećenja miokarda
Idealni kardijačni marker se karakteriše • Visoko specifičan za tkivo srčanog mišića i odsutan u drugim ne-srčanim tkivima • Visoku dijagnostičku senzitivnost
– Biomarker da bude lako dostupan
• Biomarkeri rane dijagnoze – Mali solubilni molekuli sa bržom kinetikom oslobađanja i brzim klirensom iz oštećenog tkiva
se smatraju odgovarajućim biomarkerima rane dijagnoze
• Biomarkeri kasnije dijagnoze – Stabilan biomarker sa dugim poluživotom u plazmi
• Pik vrednosti (maksimalne vrednosti biomarkera) se moraju brzo dostići i da ostanu visoke vrednosti u cirkulaciji nekoliko sati
– Ovo je karakteristika cTnI i cTnT
• Brz klirens biomarkera je važan za povratna oštećenja – reinfarkt
Dinamika u promenama enzimske aktivnosti izoenzima LD i HBD u odnosu na druge enzime u
infarktu miokarda
LD
HBD
Rani markeri Kasni markeri
LD i izoenzim LD-1 u dijagnostici akutnog infarkta miokarda
Kasni markeri AIM
LD LD-1 Porast posle AIM 12-18 h 10-12 h Pik aktivnosti 48-72 h 72-144 h Pad na URL 6-10 dana 10 dana Dug poluživot izoenzima Doprinosi dijagnostičkoj osetljivosti posle 24 h → 90 % Pomak LD-1 u odnosu na LD-2 LD-1/LD-2 > 1 Specifičnost ovog koeficijenta je 75 % Izoenzimi LD-1 i LD-2 → HBD alfa-hidroksibutirat dehidrogenaza
22
Akutni infarkt miokarda
LD-2
LD-1
Normalan uzorak
LD i izoenzim LD-1 u dijagnostici akutnog infarkta miokarda Elektroforetsko razdvajanje izoenzima LD
Pomak LD-1 u odnosu na LD-2 LD-1/LD-2 > 1
Klinički značaj LD
Hemolizne anemije • Različiti uzroci:
– urođeni defekti membrane eritrocita, urođeni nedostaci enzima, talasemije, hemoglobinopatije, paroksizomalna noćna hemoglobinurija, antitela, splenomegalije, mehanička trauma i direktni toksični efekti
• Hemoliza, ukoliko je velika, produkuje izoenzimski profil koji je sličan kao kod infarkta miokarda
• Megaloblastna anemija – posledica nedostatka vitamina B12
– raspadanje prekurzora eritrocita u koštanoj srži (neefektivna eritropoeza)
– oslobađanje velikih količina LD-1 i LD-2 izoenzima
– LD se povećava u megaloblastnoj anemiji i do 50 X URL – Primena adekvatne terapije brzo snižava LD na normalu
Klinički značaj LD
Oboljenja jetre • LD je povećan u bolestima jetre
• Povećanja nisu tako velika kao povećanje aminotransferaza
• Velika povećanja kod toksičnog hepatitisa sa žuticom i do 10x
• Malo povećanje kod virusnog hepatitisa i infektivne mononukleoze gde je obično povećan LD 3
• Kod ciroze jetre i opstruktivne žutice LD je normalna ili dva puta uvećana u odnosu na URL
• Izoenzim LD-5 je značajno povećan kod pacijenata sa primarnim oboljenjem jetre ili kod hipoksije jetre sekundarno zbog snižene perfuzije kiseonikom
Klinički značaj LD
Maligniteti • LD je povećan kod 70 % pacijenata sa metastazama na jetri
• 20 do 60 % pacijenata sa drugim nehepatičnim metastazama imaju povećanu ukupnu LD
• LD-1 je povećan kod tumora germ ćelija (61% slučajeva)
• Kod pacijenata sa seminomima LD-1 je povećan u 63% slučajeva u odnosu na 60% koji nemaju ovaj tip tumora
• Broj pacijenata sa povećanim LD-1 zavisi od stupnja bolesti
• Pokazalo se da je LD-1 koristan prediktor ishoda kod pacijenata sa tumorom na germitivnim ćelijama testisa
• LD kao tumorski marker
• Mala specifičnost
Poređenje aktivnosti laktat dehidrogenaze u normalnoj ćeliji i u kanceroznoj ćeliji
LD i malignitet Aktivnost LD u kanceroznim ćelijama
Promene u distribuciji izoenzima LD u bolestima
Onkofetalni enzimi • Pojava fetalnih uzoraka distribucije izoenzima je pojava maligne
transformacije u mnogim tkivima. • Prvi enzim koji je izučavan je laktat dehidrogenaza • Maligni tumori u načelu pokazuju značajan pomak u ravnoteži
izoenzima ka elektroforetski više katodnim formama poput LD-4 i LD-5
• Pad aktivnosti izoenzima LD-1 i LD-2 rezultuje pojavom profila koji je reminiscencija enzimskog profila u embrionalnom tkivu
• Tumori prostate, cerviksa, dojki, mozga, želuca, kolona, rektuma, bronha i limfnih žlezdi pokazuju ove transformacije.
• Benigni gliomi pokazuju relativni porast u anjonskim izoenzimima.
Klinički značaj LD
LD u likvoru • Kod zdravih osoba LD u likvoru je mnogo niža od serumske LD
• Obično LD-4 i LD-5 se ne mogu detektovati
• Uzorak je teško protumačiti ako je prisutna i hemoragija ili oštećenje moždane barijere bolešću pri čemu LD iz cirkulacije prelazi u likvor
• Izoenzimi LD se mogu osloboditi iz ćelija koje su infiltrirane u likvor
• Bakterijski meningitis - granulocitoza dovodi do povišenja LD-4 i LD-5
• Virusni meningitis - limfocitoza dovodi do viših izoenzima od LD-1 do LD-3
• Malignitet – metastaze dovode do povišenja LD-5
Makro LD
• Stvaranje autoantitela - enzimski kompleks
• Povećava aktivnost enzima u cirkulaciji
• Učestalost 1: 10000
• Dodatna abnormalna traka na elferogramu
• Značaj određivanja makroenzima: – da se izbegnu dodatna ispitivanja
Reakcija je reverzibilna i reakciona ravnoteža favorizuje reversnu reakciju redukcije piruvata u laktat (P → L). Uslovi Reakcija L → P pH optimum 8,8 do 9,8 u optimiziranoj reakcionoj smesi za LD-1 temp 370 C. NAD+ 9 mmol/L L-laktat 80 mmol/L Reakcija P → L pH optimum 7,4 do 7,8; temperatura 370 C NADH 300 umol/l piruvat 0,85 mmol/L
Laktat dehidrogenaza: određivanje aktivnosti
Optimalan pH varira u zavisnosti od •dominantnog izoenzima u uzorku •temperature •koncentracije supstrata •pufera Specifičnost prema supstratu pojedinih izoenzima: Supstrati: laktat, 2-hidroksi kiseline ili 2-oksokiseline Katalitička oksidacija 2-hidroksibutirata, sledećeg višeg homologa laktata, u 2-oksobutirat odgovara izoenzimu 2-hidroksibutirat dehidrogenazi (HBDH ili α-HBDH). LD ne deluje na D-laktat NAD+ služi kao koenzim
Laktat dehidrogenaza: određivanje aktivnosti
Metode određivanja aktivnosti LD
Supstrati • Rutinske metode koriste i piruvat i laktat kao supstrat • Reakcija L→ P ili • Reversna reakcija P →L
Referentna metoda • Poslednjih godina više se koristi reakcija L → P kao kontinuirana
referentna metoda • Optimizirana za LD-1 • Preporučena od strane IFCC komiteta za enzime • Referentna metoda za određivanje ukupne LD je ova metoda na 370C
• Warburgov optički test • Merenje porasta apsorbancije NADH na 340 nm • 334 nm, 340 nm i 366 nm
Biološki materijal
• Prednost se daje serumu za određivanje aktivnosti LD
• Plazma može biti kontaminirana trombocitima koji sadrže puno LD
• Serum se mora odvojiti odmah od koaguluma
• Hemolizovan serum se ne može koristiti jer eritrociti sadrže čak 150 puta više LD (uglavnom LD-1 i LD-2)
Stabilnost enzima i izoenzima i čuvanje uzoraka
• Izoenzimi se međusobno razlikuju po osetljivosti na hladnoću, pri čemu LD-4 i LD-5 su posebno labilni i njihova se aktivnost gubi ukoliko se čuvaju na -200 C
• Najbolje je serum čuvati na 40C u toku 3 dana
Referentne vrednosti
• Zavise od direkcije reakcije tj od supstrata
• RV za IFCC metodu na 370C su 125 do 220 U/L
• RV su više kod dece 180-360 U/L i postepeni pad u toku detinjstva
Metode određivanja aktivnosti LD
Metode separacije i kvantifikacije izoenzima LD 1. Elektroforeza na agaroznom gelu i celuloza acetatu • Metoda koje se najčešće koristi za razdvajanje izoenzima LD • Nakon razdvajanja izoenzima LD elektroforezom reakciona smesa se preliva
preko potpornog medijuma • Reakciona smesa obično sadrži L-laktat 500 mmol/L, NAD+ 13 mmol/L obično
rastvoreno u puferu pH 8,0 • Oslobođeni NADH u zonama LD aktivnosti se detektuje: 1. fluorescencijom detektuje se UV 365 nm 2. redukcijom tetrazolijum soli u obojeni formazan
Bojenje tetrazolijum solima plavi formazan
Detekcija razdvojenih izoenzima LD
redukcijom tetrazolijum soli u obojeni formazan
Elektroforetsko razdvajanje izoenzima LD Denzitometrijska kvantifikacija izoenzima LD
Referentne vrednosti • LD-1 4-26% • LD-2 29-39% • LD-3 20-26% • LD-4 8-16% • LD-5 6-16 %
Normalan uzorak Akutni infarkt miokarda
LD-1 LD-2
Malignitet
LD-3 Kongestivno oštećenje srca sa povećanim LD-5 zbog kongestije jetre i hipoksije
LD-5
Metode separacije i kvantifikacije izoenzima LD
2. Selektivna inhibicija LD-2 do LD-5 i omogućavaju određivanje samo izoenzima LD-1 • Inhibitori su:
– 1,6-heksandiol, natrijum perhlorat, gvanidin tiocijanat
3. Imunoprecipitacija • Antiserum (kozji) na LD-5 se koristi za merenje LD-1 • Antiserum precipitira LD-2 do LD-5 • U supernatantu ostaje LD-1