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PATHOGENPATHOGENÈÈSE DES LSE DES LÉÉSIONS SIONS HHÉÉPATIQUES DU VHC :PATIQUES DU VHC :
MODMODÉÉLISATION ANIMALELISATION ANIMALE
HervHervéé LERATLERAT
INSERM U955INSERM U955DDéépartement de Virologie Molpartement de Virologie Molééculaire et Immunologieculaire et Immunologie
Physiopathologie et ThPhysiopathologie et Théérapeutique des Hrapeutique des Héépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)patites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)
Hôpital Henri Mondor, CrHôpital Henri Mondor, Crééteil, France.teil, France.
NNéécessitcessitéé de dde dééveloppement de veloppement de modmodèèles animauxles animaux
ContexteContexte dd’’un un organeorgane entierentierdansdans un animal vivant.un animal vivant.
Pathologies viro-induites: contribution du virus?
ModMod èèles animaux pour lles animaux pour l ’é’étude des tude des pathologies induites par le VHCpathologies induites par le VHC
�� Primates nonPrimates non--humainshumains�� ChimpanzChimpanzéé
�� OuistitiOuistiti
ModModèèlesles dd’’infectioninfection
�� ProblProblèème de disponibilitme de disponibilitéé et de coet de coûût.t.
�� RongeursRongeurs ((““humanishumanisééss””))�� uPAuPA/SCID/SCID
�� TrimeraTrimera
�� ratrat
ModMod èèles animaux pour lles animaux pour l ’é’étude des tude des pathologies induites par le VHCpathologies induites par le VHC
ModModèèlesles dd’’infectioninfection
ModModèèlesles dd’’infectioninfection ((rongeursrongeurs))
Adapted from Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007
�� Techniquement trTechniquement trèès complexes s complexes àà mettre en mettre en œœuvreuvre
uPA/SCID
Trimera mice
Rat
Rodent models HumanizationViremia
Copies/mLDuration of infection
(Months)
Human hepatocyte transplantation
Xenograft of humanliver tissues
Immunotolerization and transplantation of human
hepatoma cell line
104 to 8x107
7x104
1-2x104
Up to 9
Around 1
Up to 4
Peak viremia
1 month
18 days
3 months
�� TransgenTransgenèèsese murinemurine�� ClassiqueClassique
�� ConditionnelleConditionnelle ((systsystèèmeme CreCre/Lox)/Lox)
ModMod èèles animaux pour lles animaux pour l ’é’étude des tude des pathologies induites par le VHCpathologies induites par le VHCModModèèles dles d’’expression des protexpression des protééines viralesines virales
�� Avantages Avantages ::�� FacilitFacilitéé dd’é’élevage, technique rodlevage, technique rodééee
�� Expression chronique Expression chronique àà long termelong terme
�� Pas de rPas de rééponse immuneponse immune
�� Pas de rPas de rééplication virale plication virale
The full-length HCV ORF transgenic mouse model FL -N/35
Lerat et al., Gastroenterology 2002
RNA HCV +X C57BL6J
Liver
micro-injectionsC57Bl6J x C3H/HeJ
X C57BL6JDNA HCV +
FL-NE1 E2core
NS
4aNS3 NS4b NS5a NS5bNS2p7Albumin promoter SV40 PolyA
Genotype 1b
FL-N/35
The full-length HCV ORF transgenic mouse model FL -N/35
Lerat et al., Gastroenterology 2002
RNA HCV +X C57BL6J
Liver
micro-injectionsC57Bl6J x C3H/HeJ
X C57BL6JDNA HCV +
FL-NE1 E2core
NS
4aNS3 NS4b NS5a NS5bNS2p7Albumin promoter SV40 PolyA
Genotype 1b
SteatosisSteatosis
CarcinomaCarcinoma
CoCo--fibrogenicfibrogenic+CCl4+CCl4
Hepatocellular Carcinomas
A
Lerat et al., Gastroenterology 2002.
1 cm
1 cmFL-N/35-170UNC
FL-N/35-171UNC
1 cm FL-N/35-102CERFE
Visualisation en IRM des CHC chez la souris VHC
(H. Lerat, A. Luciani et T. Décaens, données personnelles.)
Tumeur
CHC induits par le VHC:
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?
CHC CHC viroviro --induitsinduits : : mméécanismescanismes molmol ééculairesculaires ??
Incorporation de BrdU
HCV TGNon TG
ARNmCyclin B1 MYC
1
3
5
7
9
mR
NA
(F
old
incr
ease
)
HCV TGNon TG HCV TGNon TG
Détection PCNA
HCV TGNon TG
Modulation du cycle Modulation du cycle cellulairecellulaire dans le foie des souris transgdans le foie des souris transgééniquesniques
-> Les mécanismes restent à définir.Lerat et al., Gastroenterology 2002.Keasler, Virology 2006.M. Higgs (données personnelles)
% a
popt
otic
hepa
tocy
tes
0
10
20
30
40
50
non TG
HCV TG
P<0.05
in vivo
P<0.01
ex vivo
HCV TGNon TG
Hoe
chst
+
-
Flu
ores
cenc
e in
tens
ity
Inhibition de Inhibition de ll’’apoptoseapoptose dans le foie des souris transgdans le foie des souris transgééniquesniques
(Disson et al., Gastroenterology, 2004)
BidBid
GAPDHGAPDH
LIVERLIVER KIDNEYKIDNEY
HCV HCV tgtg -- ++ -- ++
BidBid24 24 kDkD
ActivatedActivatedcaspasecaspase 88
BidBid --NN10 10 kDkD
BidBid --tt14 14 kDkD
CytochromeCytochrome CC
++
Apoptosis
WTWT HCV HCV tgtg00
0.40.4
0.20.2
0.60.6
0.80.8
11
1.21.2
Bi
Bi d
d p
rot e
inp
rot e
inle
vel
leve
l (A
U)
(AU
)
BidBid
N=13N=13N=10N=10
p<0.01p<0.01
(Disson et al., Gastroenterology, 2004)
Inhibition de Inhibition de ll’’apoptoseapoptose dans le foie des souris transgdans le foie des souris transgééniquesniques
APOPTOSEAPOPTOSE
caspase 3 caspase 9
cytochrome C
caspase 8
Fas
FasL
Bid
Membrane cellulaire
mitochondrie
VHC (NS2)
CIDE-B
fragmentation ADN
CIDE-B
Annexin V
HCV TG +-
Erdtmann et al., J Biol Chem 2003.
VHC (NS5A)
calpaïne
Etape vers le cancer
RRéésumsuméé : inhibition de la voie FAS dans le foie des souris VHC: inhibition de la voie FAS dans le foie des souris VHC
Bid (21 kD)
GAPDH
NT CHC NT CHC NT CHC
Patients #1 #2 #3
Tissus
NT= tissu adjacent au CHC
(Simonin et al., Hepatology 2009)
Diminution de lDiminution de l’’expression de expression de bidbid chez les patients infectchez les patients infectéés par le VHCs par le VHC
0
1
2
3
VHC
Cirrhose++-
--+ +
+--
-+
Tissus NT CHC
n 15 9 8 15 9 8
Bid
/GA
PD
H
*
Simonin et al., Hepatology, 2009
Diminution de lDiminution de l’’expression de expression de bidbid chez les patients infectchez les patients infectéés par le VHCs par le VHC
Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes(Disson et al., Gastroenterology, 2004)
Day 3
Day 21
non TG HCV TG
Ad βGal108 pfu/g
D +3 Liver biopsy
D +21(sacrifice)
Liver and spleen removal
β-gal histology
+ enzymatic assay
10+ 4
10+ 5
10+ 6
10+ 7
+3 +21 +3 +2110+ 3
10+ 4
10+ 5
10+ 6
ßG
AL
activ
ityin
the
liver
(RLU
)
ßG
AL
activ
ityin
the
sple
en (
RLU
)
LIVER SPLEEN
p<0.05
N.S.
Ad βGal108 pfu/g
D +3 Liver biopsy
D +21(sacrifice)
Liver and spleen removal
β-gal histology
+ enzymatic assay
Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes(Disson et al., Gastroenterology, 2004)
Non tg HCV tg
Rela
tive
RO
S leve
ls (%)
0
100
200
300
400
500
600
700
n=4n=4n=4n=4 n=4n=4n=4n=4
DNA damage
inflammation
fibrosis
NS3-NS5A
Nox4
(M. Higgs, H. Lerat, données personnelles)
Surcharge en FER
CHC
ROS
Electron transport Complex (1) CORE
Glutathion
HCV-tgNon tg
DHEDHEDHEDHE
Age= 17 mo
Production de ROS dans les souris VHC, implication sur la Production de ROS dans les souris VHC, implication sur la carcinogencarcinogenèèse hse héépatique.patique.
GADD45GADD45GADD45GADD45γγγγGADD45GADD45GADD45GADD45ββββGADD45GADD45GADD45GADD45ααααGADD153GADD34
Senseurs de stress
Q
M
G1G2
S
G0
CyclinB1
Cdc2
Arrêt du cycle Arrêt du cycle Arrêt du cycle Arrêt du cycle cellulaire (G2/M)cellulaire (G2/M)cellulaire (G2/M)cellulaire (G2/M)
GADD45GADD45GADD45GADD45LLLLéééésions de sions de sions de sions de llll’’’’ADNADNADNADN
Nucleotide excision repair
LLéésionssions de de ll’’ADNADN –– La La famillefamille GADDGADD
Gadd45Gadd45Gadd45Gadd45ββββ
P
P
P
Histone H3
Histone H1
Lamine
La surexpression de GADD45 entraine un arrêt de la transition G2/M.
Indexe mitotique des hIndexe mitotique des h éépatocytes VHC+patocytes VHC+
PhosPhosPhosPhos----histone H3 (histone H3 (histone H3 (histone H3 (SerSerSerSer 10)10)10)10)
+/+/+/+/---- Gadd45Gadd45Gadd45Gadd45ββββsiRNAsiRNAsiRNAsiRNA
wt FL-N/35
+/- UV-C
UVUVUVUV----CCCC
Gadd45Gadd45Gadd45Gadd45ββββ siRNAsiRNAsiRNAsiRNA
wt FL-N/35 wt FL-N/35 wt
++++ ++++ ++++
++++
p = 0.0001
NS
NS
% m
itosi
s% m
itosi
s% m
itosi
s% m
itosi
s
0
10
20
30
40
(Higgs, Lerat et al. Soumis)
RRéégulationgulation éépigpig ééniquenique du du promoteurpromoteur de GADD45b de GADD45b dansdans les les hhéépatocytespatocytes VHC+VHC+
PhosPhosPhosPhos----histone H3 (histone H3 (histone H3 (histone H3 (SerSerSerSer 10)10)10)10)
+/+/+/+/---- 5555----azaazaazaaza
wt FL-N/35
+ UV-C
UVUVUVUV----CCCC
Gadd45β siRNA
wt FL-N/35 FL-N/35 FL-N/35
++++ ++++ ++++ ++++
++++
5555----azaazaazaaza ++++++++
p = 0.0014
p = 0.0001
p = 0.0003
0
5
10
15
20
25
30
% m
itosi
s% m
itosi
s% m
itosi
s% m
itosi
s
(Higgs, Lerat et al. Soumis)
LL’’expression de GADD45b est diminuexpression de GADD45b est diminuéée dans le foie des patients e dans le foie des patients infectinfectéés par le VHCs par le VHC
HCV+
HBV+
HBV- HCV-
NT
T
NT
T
NT
T
Groupes de patients étudiés
Rela
tive
Gad
d45β
pro
tein
exp
ress
ion (%)
0
20
40
60
80
100
120
Non tumoral tissue
Tumoral tissue
HBV + HCV +HCV +HCV +HCV +HBV -HCV -
HBV +HBV -HCV -
HCV +HCV +HCV +HCV +
Gadd45β >
Actin >
HC
V +
HB
V +
HB
V -
HC
V -
NT T NT T NT T
(Higgs, Lerat et al. Soumis)
Chronicité infectionChronicité infection
Vers un mVers un méécanisme de la carcinogencanisme de la carcinogenèèse hse héépatique patique viroviro--induite?induite?
CANCER du FOIECANCER du FOIE
Expression VHCExpression VHC
Inhibitionréponse immune
Inhibitionréponse immune
Multiplication cellulaire
Multiplication Multiplication cellulairecellulaire
Surexpression des cyclines et oncogènes
Surexpression des cyclines et oncogènes
Inhibition apoptoseInhibition Inhibition apoptoseapoptose
Diminution de protéines pro apoptotiques
Diminution de protéines pro apoptotiques
Lésions ADNLLéésions ADNsions ADN
production ROS production ROS
Réparation ADNRRééparation ADNparation ADN
Stéatose induite par le VHC:
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?
Stéatose micro-vésiculaire
Non TGNon TG VHC TGVHC TG
VHC TGVHC TG VHC TGVHC TG
Lerat et al., Gastroenterology 2002.
Stéatose micro-vésiculaire
coloration Oil Red O
analyse in silico
HCV TGNON TGM
F
M
0
5
10
15
20
25
12.5 ± 0.4
13 ± 0.8 14.4 ± 0.8
14.1 ± 0.3
n=12
n=12 n=10
n=7
p<0.001
% d
e l’a
ire to
tal
HEPATOCELLULAR STEATOSISHEPATOCELLULAR STEATOSIS
de novo TG synthesis
TG secretion default
Increased TG serum uptake
TG degradation default (oxydation)
ER Stress?
VIRALPROTEINS
? ?
?
?
StStééatoseatose viroviro --induitinduit ee: : mméécanismescanismes molmol ééculairesculaires ??
Défaut d’exportation des triglycérides.La sécrétion des VLDL hépatiques chez la souris à jeun a été mesurée par l’augmentation des triglycérides plasmatiques (A et B) et de l’apolipoprotéineB (C) après inhibition de la lipoprotéine lipase par le triton WR1339 (B et C).
Pla
smat
ic T
G (
g/L)
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
A
WT HCV-tg
14 14n
4
6
8
10
12
14
Pla
smat
ic T
G (
g/L)
B
WT HCV-tg
13 13n
1
2
3
4
5
6
Pla
smat
ic A
poB
(g/L
)
C
WT HCV-tg
13 13n
Inhibition de la « Microsomal Transfer Protein »
WT HCV-tg150
200
250
300
350
400
450
500
pmol
es/1
00µ
g/4h
Activité MTP
Stimulation de la lipogenèse
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
* p=0.01
** p=0.02WT
HCV-tg
AR
Nm
(aug
men
tatio
n re
lativ
e)
n 11
FAS SCD1
0
2
4
9
EMACCACL
11 14 11 118 8 16 8 8
*
**
**
** p=0.02
RT-qPCR
* p=0.01
FA
S/G
AP
DH
WT HCV-tg
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
4 9n
Western Blot
Stimulation de la lipogenèse
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
Régulation de la lipogenèse
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
Régulation de la lipogenèse
SREBP1c (clivé)
SREBP1c (précurseur)
Lamine A/C
Actine
noyau
microsomes
WT HCV-tg
Western Blot
AR
Nm
(aug
men
tatio
n re
lativ
e)
n 14 16
0
1
2
3
4
WT HCV-tg
RT-qPCR
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
Régulation de la lipogenèse
Lipogenèse induite par le stress du RE?
PERK ATF6IRE-1
Stress RERE
Epissage ARNm XBP1P-eiF2α
Arrêt traduction Dégradation protéique
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
Lipogenèse induite par le stress du RE?
PERK ATF6IRE-1
Stress RERE
Epissage ARNm XBP1P-eiF2α
Arrêt traduction Dégradation protéique
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
eIF
2-P
/eIF
2
0
1
2
3
4
WT HCV-tg
Western blot
Non-épisséEpissé
Non-Tg HCV Tg +
ARNm XBP1
RT-PCR
Lipogenèse induite par le stress du RE?
PERK ATF6IRE-1
Stress RERE
Epissage ARNm XBP1P-eiF2α
Arrêt traduction Dégradation protéique
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
1
2
3
0
4 9
Phospho-Perk
Pho
spho
-Per
k / P
ER
K
Western Blot
Lipogenèse induite par le stress du RE?
PERK ATF6IRE-1
Stress RERE
Epissage ARNm XBP1P-eiF2α
Arrêt traduction Dégradation protéique
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
EDEM7 4
PDI11 8
WTHCV-tg
CHOP TRB315 187 4n
GRP7816 15
AR
Nm
(aug
men
atio
nre
lativ
e)
0
2
4
6
12
RT-QPCR
PERK ATF6IRE-1
Stress RERE
Epissage ARNm XBP1P-eiF2α
Arrêt traduction Dégradation protéique
RRéésumsum éé
SREBP1cDomaine de transactivation
(Noyau)
SREBP1c Précurseur
(RE puis Golgi)
Citrate
Acetyl-CoA
ATP-CL
Malonyl-CoA
Acyl-CoAs
TG
Lipo
genè
se ACC
FAS
SCD1
VLDLMTPExportation TG
ApoB
Accumulation TG intracellulairesSTEATOSE HEPATIQUE
=
=
NO
YESYES
de novo TG synthesis
TG secretion default
Increased TG serum uptake
HEPATOCELLULAR STEATOSISHEPATOCELLULAR STEATOSIS
TG degradation default (oxydation)
ER StressVIRAL
PROTEINS
?
?
Towards mechanismTowards mechanismss for HCVfor HCV--inducedinduced steatosissteatosis??
Fibrose induite par le VHC?
Mécanismes Moléculaires?
Rôle direct des protéines virales?
Non-Tg HCV-Tg
anti-αSMA antibody
Stellate cell activationand absence of fibre deposition in HCV mice
Non Non TgTg
HCVHCV--TgTg
Picrosirius red staining
Enhanced fibre deposition in CCl4-treated HCV mice
Non Non TgTg + CCl4+ CCl4 HCVHCV--TgTg + CCl4+ CCl4Non Non TgTg
in in silicosilico AnalysisAnalysis
NonNon --Tg + CCl4Tg + CCl4 Tg + CCl4Tg + CCl4
PicrosiriusPicrosirius RedRed StainingStaining
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
TgNon-Tg
+ CCl4+ CCl4-- CCl4CCl4
TgNon-Tg
P=0.0036*
Are
a of
A
rea
of f
iber
sfib
ers
(%)
(%)
nn 55 55 1313 1717
* = Mann Whitney test
Quantification of fibre deposition
� Modèle reproduisant les principales pathologies induites par le VHC� Niveau d’expression similaire à l’infection chronique chez l’homme� Absence de réponse immunitaire (pas d’inflammation ni de cirrhose)
� La cirrhose n’est pas un pré requis au développement de CHC : en accord avec données cliniques (méta-analyse, Maisonneuve 2009)
� Démonstration d’effets cytopathiques directs des protéines virales en absence de cirrhose.
� Inhibition de l’apoptose (voie FAS)� Inhibition de l’expression du suppresseur de tumeur GADD45b� Inhibition de la sécretion des VLDL (MTP)� Stimulation de la lipogenèse� Action co-fibrogène
Conclusions