1. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 1 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADA INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS MANUAL DE PRCTICASDELLABORATORIO DE INMUNOLOGIA APLICADAProfesores de LaboratorioDra. Mara del Carmen Oliver SalvadorM. en C. Paola B. Zrate SeguraDr. Luis Gilberto Torres BustillosM. en C. Rodrigo Balam Muoz SotoIBT Hctor Molina JimnezIBT Hernn Corts ArroyoOCTUBRE 2008

2. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL2UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADANDICE GENERALPRCTICA 1. TIPIFICACIN DE GRUPOS SANGUNEOS4PRCTICA 2. ESQUEMAS DE INMUNIZACIN 8PRCTICA 3. REACCIONES DE PRECIPITACIN14PRCTICA 4. DETERMINACIN DE PROTENA POR EL MTODO DE BRADFORD 18PRCTICA 5. DETERMINACIN DE REACCIN Ag-Ac PORELECTROTRANSFERENCIA 20 3. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 3 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADAREGLAMENTO DEL LABORATORIOEl laboratorio representar el 30% de la calificacin final de la materia de InmunologaAplicada.La calificacin de laboratorio se distribuir de la siguiente manera:1. TRABAJO PRCTICO 40% - Asistencia al laboratorio. - Puntualidad. Se dar un mximo de tolerancia de 10 minutos. - Manutencin de los conejos. Se evaluar la limpieza del bioterio as comoel cumplimiento y la responsabilidad de los conejos diariamente. - Cada alumno deber presentarse a la sesin de laboratorio con bata y conel manual de prcticas engargolado en el cual debern anotar todos los resultadosobtenidos en las prcticas.No se permitir el acceso al laboratorio si no se cumple este requisito. - El material se entregar una vez llenado de manera correcta el valecorrespondiente. - El comportamiento del alumno dentro del laboratorio estar regido por elreglamento general del laboratorio de biotecnologa.2. INFORME POR EQUIPO 40%Este porcentaje se divide en:- Introduccin 10%- Objetivo- Resultados 15%- Discusin de resultados 20%- Cuestionario 20%- Conclusiones 30%- Referencias 5%(diferentes a las mencionadas en la prctica)3. EXAMEN DE LABORATORIOConsistir en una evaluacin del conocimiento adquirido durante las prcticas 4. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL4 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADA PRCTICA 1 TIPIFICACIN DE GRUPOS SANGUNEOS1. INTRODUCCINSISTEMA ABO Los eritrocitos poseen en su membrana sustancias antignicas determinadasgenticamente, las cuales pueden identificarse mediante anticuerpos especficos. Elprimer grupo de estas sustancias fue identificado por Landsteiner en 1901, y le llamsistema ABO, el cual consiste en que un individuo tiene en sus glbulos rojos uno, dos oninguno de los dos antgenos (A y/o B) pertenecientes a este sistema. As, los individuospueden ser del tipo A, si solamente poseen el antgeno A; del tipo B, si nicamente tienenel antgeno B; del tipo AB si poseen ambas, o del tipo 0 si no tienen ninguno de los dos.La naturaleza qumica de los determinantes antignicos es polisacardica. Aproximadamente el 85% de la poblacin posee sustancias con caractersticasantignicas y estructurales similares a las presentes sobre las membranas de loseritrocitos en prcticamente todas las secreciones corporales. A estos individuos se lesllama secretores. Los carbohidratos que forman estructura antignica A y B en la membrana de losglbulos rojos, tambin estn presentes en otros materiales biolgicos como bacterias,alimentos y otros agentes ampliamente distribuidos que constituyen un persistenteestmulo. Los humanos reaccionan a este estmulo produciendo anticuerpos contraaquellos antgenos que no forman parte de su propia estructura celular. Por esta razn, elanticuerpo anti-A se produce en personas del grupo AB, que contienen ambos antgenos,no forman dichos anticuerpos. A estos anticuerpos se les llama isohemaglutininas.Sistema Rh En 1939. Levine y Stetson reportaron el caso de una mujer con severa reaccinhemoltica despus de la transfusin sangunea proveniente de su esposo. El antgenoresponsable fue diferente de los ya conocidos en la poca. En 1940, Landsteiner y Winier inmunizaron conejos y cobayos con eritrocitos demonos Macacus rhesus, basandose en la suposicin de que en los eritrocitos de estosmonos podran existir antgenos similares a los de los humanos. El suero obtenidoaglutinaba los glbulos rojos de los monos rhesus y del 85% de la poblacin humanablanca. Hasta ese momento todo sugera que el supuesto antgeno hallado porLandsteiner y Wiener en monos, y el supuesto antgeno descrito por Levine y Stetson enhumanos, era el mismo. Posteriores investigaciones demostraron que los supuestosantgenos eran diferentes; se determin que la mayora de los humanos tienen el antgenodel mono rhesus y adems otro diferente, pero relacionado. A sugerencia de Levine, seconserv la demostracin del factor Rh para el antgeno humano, y se le asign el nombrede LW al antgeno comn al hoimbre y al mono. A mediados de la dcada de los 40, se haban identificado cinco antgenos comopertenecientes al actualmente denominado Rh. Estos cinco antgenos (C, c, D, E, e) secombinan entre s, dando lugar a diversos patronesantignicos. El D tiene dominanciaantignica. Los individuos que presentan el antgeno D en sus eritrocitos se denominanRh(+), y aquellos que no tienen el antgeno D se denominan Rh(-). 5. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL5 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADAAdems de los sistemas AB0 y Rh pueden ser detectados otros sistemasantignicos de la membrana de los eritrocitos (Lewis, Duffy, MN, Ss. Li, etc). Estossistemas se consideran secundarios.El conocimiento de los antgenos sanguneos ABO y Rh. Como antgenoscelulares importantes en transfusiones sanguneas, en medicina legal y en laisoinmunizacin materno-fetal.Los anticuerpos del sistema ABO son principalmente de clase IgM. Por lo que sonaltamente aglutinantes y fijadores de complemento. Por este motivo, la determinacin deeste sistema es de gran relevancia en transfusiones sanguneas.2. OBJETIVOS2.1 OBJETIVO GENERAL Determinar el sistema ABO y Rh de diferentes muestras.2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS2.2.1 Realizar la extraccin sangunea por jeringa2.2.2 Realizar la tipificacin sangunea del sistema ABO3. MATERIALES Y REACTIVOS3.1 Material por grupoCentrfuga clnicaBao mara a 37C3.2 Material por equipo1 Frasco de torundas de alcohol2 portaobjetos3 pipetas PasteurJeringa desechable de 5 mL con aguja de 21x32mm2 tubos de ensaye de 13x 100mL1 pipeta serolgica de 5 mL1 pipeta serolgica de 1 mL5 palillos de maderaSueros tipificadotes anti-A, anti-B, anti-ABSolucin de albumina bovina al 25%Eritrocitos humanos tipo A, B y 0, en suspensin al 5%2 tubos de ensaye 10 x 75mmTubo con tapn de roscaSuero tipificador anti-D comercialSolucin salina al 0.85%Suero de Coombs4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1. Tipificacin Sangunea 1. Obtener aproximadamente 5 mL de sangre venosa y colocarla en un tubo sinanticoagulante, permitir que se retraiga el cogulo incubando a 37C 10 min y centrifugarpara separar el suero del paquete celular. 6. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 6 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADA 2. Rotular una placa o portaobjetos de la siguiente manera: anti-A, anti-B, anti-AB ytestigo. Rotular otra placa diferente con: A, B y 0. 3. Del mismo tubo donde se dej coagular la sangre, con una pipeta pasteur tomareritrocitos del fondo (de los no atrapados en el cogulo). Colocar una gota de estasuspensin en el portaobjetos que tiene las marcas anti A, anti-B, anti-AB y testigo. 4. Cerca de cada gota, adicionar una gota de suero comercial anti-A, anti-B y anti-AB, segn corresponda y en el lugar marcado como testigo, colocar una gota de lasolucin de albmina al 25%. Mezclar primero suavemente con un palillo y despus conmovimientos rotatorios. 5. Buscar la presencia de aglutinacin antes de 25 seg.Por ejemplo, si se observa el siguiente resultado: Anti-AAnti-BAnti-AB TestigoAglutinacin - + + - Esto indicara que los eritrocitos probados corresponden al grupo sanguneo B. 6. Para buscar las isohemaglutininas, en la otra placa marcada como A, B y 0,colocar una gota del individuo frente a las marcas y agregar cerca una gota de eritrocitospreviamente tipificados de tipo sanguneo A, B y 0, segn corresponda. 7. Mezclar suavemente, primero con ayuda de un palillo y despus conmovimientos rotatorios. 8. Buscar la presencia de aglutinacin.Resultados. De acuerdo al ejemplo anterior, los resultados esperados para confirmar el gruposanguneo seran:A B0Aglutinacin+ --Por lo que el individuo correspondera al tipo B.En el sistema ABO el grupo sanguneo esta dado por la siguiente tabla.Reaccin de los eritrocitos con antisueros Reaccin con el suero con antgenos Grupocomercialesconocidos sanguneoAnti-AAnti-BAnti-ABA B O+ - +- + - A- + ++ - - B+ + +- - - AB- - -+ + - OEn caso de que se presente aglutinacin en el testigo, se debe a que existenautoanticuerpos antieritrocitos y esto DEBE de ser reportado inmediatamente.4.2. Sistema RhDe este sistema por su mayor inmunogenicidad, slo se determina de formarutinaria el antgeno D en caso de requerirse una transfusin sangunea. Por lanaturalez proteica del antgeno, los anticuerpos inducidos son de clase IgG quepueden atravesar placenta y causar hemlisis intrauterina en caso de incompatibilidadmaterno-fetal. 7. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL7 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADA1. Con una pipeta Pasteur colocar cuatro gotas de sangre en un tubo con tapn derosca que contenga 2 mL de SS.2. Marcar dos tubos: Rh y Testigo, colocar una gota de eritrocitos en cada uno.3. Al tubo Rh adicionar una gota de suero anti-D y agitar suavemente.4. Al testigo adicionar SS y agitar suavemente.5. Centrifugar 1000 rpm 60seg6. Buscar aglutinacin, en caso de que el tubo Rh presente es Rh(+)7.Si no hay en ninguno incubar a 37C, 20 min y lavar 3 veces con SS centrifugando a1500 rpm 2 min. Despus de la ltima centrifugacin remover el sobrenadante yadicionar al paquete celular dos gotas de suero de Coombs.8. Resuspender suavemente y centrifugar ambos tubos a 1000 rpm 60 seg.Resultados.Presencia de aglutinacin.Rh con aglutinacin corresponde al grupo Du Rh(+), en caso negativo Rh(-).Testigo debe ser negativo, en caso opuesto es autoinmune. Para transfusin el sujetoclasificado como Du, se considera como donador Rh (+) y receptor Rh (-).5. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.1. Bird, G. W.G. and Cunningham, J. 1977. Agglutination and agglutination-inhibition. Techniques in Clinical Immunology. R.A. Ed. Thompson, Black ScientificPublications. Oxford.2. Dodd, B.E. and Lincoln, P.J. 1975. Blood Group Topics. John Turk Editor. YearBook Medical Publishers, Inc.Chicago. 8. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 8 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADAPRCTICA 2 ESQUEMAS DE INMUNIZACIN1. INTRODUCCIN.La Inmunizacin es el proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuocompetente desarrolla una respuesta inmune al entrar en contacto con un inmungeno. Eltipo y magnitud de la respuesta producida se deben a mltiples variables entre ellas seencuentra: la inmunogenicidad de un antgeno, que depende de su complejidadestructural, peso molecular, conformacin y naturaleza qumica, dosis, va deadministracin etc.La sntesis de anticuerpos (Ac) es dirigida contra molculas especficas que el organismono reconoce como propias (determinantes antignicos), para que esta sntesis ocurra,primero debe existir un contacto entre las clulas encargadas de la sntesis y eldeterminante antignico, contacto que es mediado por algunas clulas involucradas en larespuesta celular.Cuando un organismo se expone a un antgeno desconocido, el sistema inmune puederequerir mucho tiempo para producir cantidades apreciables de anticuerpos. Al final de lainfeccin la concentracin alcanzada de anticuerpos declina. A tal respuesta se le llamaprimaria. Cuando el organismo se expone posteriormente al antgeno, la respuesta ocurremucho ms rpido y la concentracin alcanzada, es apreciablemente mayor, en este casose habla de respuesta secundaria.La aplicacin prctica de los antisueros es muy diversa, pues se puede utilizar con finesteraputicos (inmunizacin pasiva), en diversos estados infecciosos o txicos (neumonalobar, ttanos, etc.). Adems son tiles en la identificacin de microorganismos aisladosde procesos infecciosos y en la clasificacin taxonmica de diversas especies. Tambinhan servido como herramienta de trabajo para dilucidar mecanismos inmunolgicosbsicos (especificidad inmunolgica, activacin del complemento, fagocitosis,citotoxicidad, etc.) y en la determinacin rpida y especfica de la naturaleza de diversassustanciasqumicas(protenas,carbohidratos,haptenos, etc).ADYUVANTES INMUNOLGICOSSon sustancias inmunomoduladoras que constituyen una familia muy heterogneasi se toman en consideracin su origen, naturaleza qumica y actividad biolgicaespecfica; Como los agentes inmunopotenciadores, a los cuales se les atribuyen 2funciones fundamentales: la estimulacin de la resistencia no especfica del huspedcontra las enfermedades infecciosas y el cncer; y, por otra parte, la potenciacin de lainmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la respuesta de los animales delaboratorio durante la inmunizacin experimental con vistas a la produccin de antisueros.Los adyuvantes son sustancias o preparados que incorporados al antgeno o inyectadossimultneamente con l, hacen ms efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se lograuna economa de antgeno y de tiempo, as como un mayor nivel de anticuerposespecficos. El aumento de la inmunogenicidad puede estar mediado por uno o varios delos siguientes procesos: a) Incremento de la produccin de anticuerpos especficos frente a un antgeno vacunal. 9. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 9 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADA b) Aumento de la afinidad de los anticuerpos inducidos con una potenciacin de su funcin neutralizante, germicida, opsonizante etc. c) Incremento de la magnitud y/o efectividad de la respuesta mediada por clulas T. d) Generacin de una respuesta humoral y/o celular de mayor duracin. e) Generacin de una respuesta incrementada de memoria inmunolgica.Algunos adyuvantes son en si antignicos (endotoxinas de bacterias gramnegativas,como Bordetella pertussis, o algunas bacterias grampositivas y el gnero de lasmicobacterias, etc.) mientras que otros no lo son (tartrato de alumnico de potasio oalumbre, fosfato de calcio, aceite mineral, lanolina, diversos agentes tensodepresores,polinucletidos y otros).El adyuvante incompleto de Freund es una mezcla de aceite mineral (Drakeol, Bayol oNujol) con un detergente (Falba, Arlacel, Aquafor) en diferentes proporciones, porejemplo, Arlacer-Drakeol (1:9); Arlacel-Bayol (3:17). El adyuvante completo de Freud(FCA) contiene adems del aceite y el detergente, una micobacteria (M. tuberculosis, M.bovis u otras) cuya cantidad es variable (de 1 a 5 mg de la bacteria, peso seco, por cadamL de la mezcla incompleta de Freund). Este ha sido utilizado durante ms de 50 aos enla produccin de antisueros en animales y es empleado con frecuencia cuando se disponede cantidades limitadas de antgenos o cuando presentan una baja inmunogenicidad. Lagravedad de su toxicidad fue reconocida inmediatamente, pero los esfuerzos porencontrar opciones igualmente efectivas y menos txicas no han resultado del todoexitosos. Con los avances alcanzados en numerosas reas de las ciencias biolgicas y elcreciente inters por el bienestar de los animales de experimentacin, existe unaconsiderable presin para restringir el uso del FCA, y aunque no se cuenta en laactualidad con alternativas definitivas para este adyuvante, en diferentes estudioscomparativos se informan resultados estimulantes en cuanto a eficiencia, menor nmerode efectos adversos y mayor facilidad en la manipulacin.En los humanos no se recomienda el uso de este tipo de adyuvante Freund completo eincompleto ya que frecuentemente su aplicacin conduce al desarrollo de granulomasseveros.VAS DE INMUNIZACIN.Se pueden emplear vas tales como la oral, nasal, intramuscular, intravenosa,intracardiaca, intraperitoneal, intradrmica, subcutnea, etc.El estado fsico del antgeno (particulado o soluble) debe tenerse en cuenta para escogerla ruta de inmunizacin; es decir, los antgenos particulados por lo general sonintroducidos por va intravenosa, mientras que los antgenos en solucin puedenintroducirse por otras vas como la intramuscular, la intraperitoneal, la subcutnea o laintradrmica. En estas dos ltimas vas preferentemente se utiliza al antgenoacompaado con adyuvante.La mayora de las veces slo se logra una respuesta adecuada llevando a cabo ms deun estmulo antignico, asegurando as que se obtendrn ttulos altos de anticuerpos o elnmero deseado de clulas especficas estimuladas.2. OBJETIVOS.2.1. OBJETIVO GENERAL. Desarrollar diferentes esquemas de inmunizacin en animales. 10. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL10UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADA2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS.2.2.1. Desarrollar esquema de inmunizacin en conejos raza Nueva Zelanda2.2.2. Desarrollar el esquema de inmunizacin para diversos antgenos3. MATERIALES Y REACTIVOS.3.1 Material por Grupo. Centrfuga clnica. Bao Mara a 37C.3.2. Material por Equipo. Antgeno suficiente para inmunizar a conejos, de acuerdo al protocolo de inmunizacin. Un conejo que no rebase 5 Kg. de peso (de preferencia de color blanco, para facilitar la localizacin de la vena marginal de la oreja). Adyuvante incompleto de Freund. Jeringas de 1 mL con aguja de 25x16 (5/8) mm. Un lienzo para sujetar al conejo. Un frasco con torundas de algodn y alcohol al 70%. Frasco de solucin salina fisiolgica estril (0.85%). Mechero Bunsen.4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.4.1 TOMA DE MUESTRA SANGUNEAPara todos los antgenos el sangrado se hace antes y despus de la ltima inmunizacin,tratando de extraer la mayor cantidad de sangre posible. El sangrado previo esindispensable para contar con un suero testigo. Venosa.1. Inmovilizar al animal.2. Tomar la oreja.3. Limpiar la zona de la vena lateral con alcohol al 70%.4. Sujetar y colocar una torunda con agua tibia para ayudar a la exposicin del avena.5. Hacer un corte con una navaja de bistur estril de 2mm de longitudinalmente ala vena y colectar 2 mL por goteo en un tubo sin anticoagulante.6. Una vez colectados los 2mL, colocar un vendolete en la oreja.Antes de iniciar el esquema de inmunizacin correspondiente. Dejar coagular lamuestra sangunea y separar el suero por centrifugacin. Este suero, ser eltestigo, debe ser conservado en un tubo de ensayo, sellado y rotuladoadecuadamente, en congelacin, hasta que se concluya con el esquema.4.2. ESQUEMAS DE INMUNIZACIN.A. mexicaina (Proteasa de origen vegetal, extrada, tratada y purificada)Inyeccin Tiempo Dosis Va (Das)(mg) 11. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 11UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADA 1 0 0.5 El antgeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85% emulsificando con 0.5 mL de adyuvante incompleto de Freund va intradrmica o subcutnea. 2 150.5 Se sigue el mismo procedimiento de la primera inmunizacin pero usando el adyuvante incompleto de Freund, por va subcutnea o intradrmica.3300.5 En SS 0.85%, por va subcutnea o intradrmica. Sangrado39 -- Va intravenosa o intracardaca para la obtencin del antisuero. SS = Solucin SalinaNota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificacin pordensitometra y por la concentracin final obtenida por la tcnica de Bradford. A. Papana (Proteasa de origen vegetal, extrada, tratada y purificada) InyeccinTiempo Dosis Va (Das)(mg) 1 00.5El antgeno se disuelve en 0.5 mL de SS al 0.85% emulsificando con 0.5 mL de adyuvante incompleto de Freund va intradrmica o subcutnea. 2 150.5 Se sigue el mismo procedimiento de la primera inmunizacin pero usando el adyuvante incompleto de Freund, por va subcutnea o entradrmica. 3 300.5 En SS 0.85%, por va subcutnea o intradrmica. Sangrado39 -- Va intravenosa o intracardaca para la obtencin del antisuero. SS = Solucin SalinaNota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificacin pordensitometra y por la concentracin final obtenida por la tcnica de Bradford. B. Salmonella entrica transformada con plsmidos pL-STPN.Las cepas fueron sembradas en tioglicolato durante 10h para inducir laexpresin de las protenas, la inoculacin se realizara en concentraciones de1x 10 5 celulas/mL. 12. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL12UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADAInyeccinTiempoDosis Va(Das) (mg)1 00.5El antgeno se disuelve en 0.5mL de SS al 0.85%emulsificando con 0.5mL de adyuvante incompletode Freund va intradrmica o subcutnea.2 15 0.5Se sigue el mismo procedimiento de la primerainmunizacin pero usando el adyuvante incompletode Freund, por va subcutnea o intradrmica.3 30 0.5En SS 0.85%, por va subcutnea o intradrmica.Sangrado39--Va intravenosa o intracardaca para la obtencindel antisuero. SS = Solucin SalinaNota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificacin pordensitometra y por la concentracin final obtenida por la tcnica de Bradford.4.2. Una vez terminado el esquema de inmunizacin en cada caso, realice un gel deelectroforesis de poliacrilamida utilizando muestras del suero testigo, del suero obtenidodespus de terminado el esquema de inmunizacin y de los antgenos utilizados. Colocarel siguiente orden en el gel.1. Marcador de peso molecular.2. Antisuero del conejo antes de iniciar el esquema de inmunizacin.3. Antisuero del conejo una vez concluido el esquema de inmunizacin.4. Antgeno inyectado.5. Estandar de IgG de conejo.4.3. Cuantificar por medio de densitometra la proporcin de IgG obtenidas. (% pureza).4.4. Reportar el gel final como resultado de esta prctica.5. CUESTIONARIO. 5.1 Qu es un antgeno soluble y qu es un antgeno partculado? 5.2 Por qu se utilizan las diferentes vas de inmunizacin para los antgenos? 5.3 Investigue la importancia del uso de adyuvantes en la vacunacin, los principales tipos de adyuvantes y su mecanismo de accin, as como restricciones de uso. 5.4 Cite 5 tipos de antgenos utilizados para la inmunizacin de animales, describiendo la naturaleza del antgeno, la va de inmunizacin que se utiliza y especie de animal en que se desarrolla. 5.5 . Investigue las nuevas vas de administracin de protenas para generar respuesta inmune. 5.6 . Explique de que depende el desencadenamiento un tipo especfico de respuesta inmune (no especfica, humoral o celular) en un organismo. 5.7 . Investigue el peso molecular de las IgG y compare los resultados obtenidos en el gel de acrilamida.6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.6.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de tcnicas modernas en Inmunologa. Teora y prctica. 1. Edicin. INDRE-SSA. Mxico.6.2. Manual de laboratorio de Inmunologa. (1998). Departamento de Inmunologa. Escuela Nacional de Ciencias Biolgica. ENCB-IPN. Mxico. 13. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL13 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADA6.3. Biotecnologa Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba.6.4 Grupta R., Relyveld E., Lindblad B., Bizzine B., Ben-Efraim S. and Grupta C (1993). Adjuvants-a balance between toxicity and adjuvancicity. Vaccine (11):293-306. 14. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 14 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADAPRCTICA 3 REACCIONES DE PRECIPITACIN1. INTRODUCCINLa reaccin de la precipitacin se presenta cuando un antgeno multivalente en estadosoluble, se une con su anticuerpo especfico y as da lugar a la formacin de un complejoinsoluble. Esta reaccin se utiliza ampliamente para demostrar y cuantificar antgenos yanticuerpos y se puede llevar a cabo en medio de lquido o semislido.La precipitacin en medio lquido puede ser semicuantitativa o cuantitativa. En la primera,slo se estima la cantidad relativa de precipitado formado y en la segunda, al precipitadoformado se le determina la concentracin de protenas totales por mtodosespectrofotomtricos o bien por el anlisis de nitrgeno proteico empleado en el mtodode Kjelndahl.Cuando la reaccin se realiza en medio lquido, la cantidad de precipitado vara segn laproporcin de los reactivos. Si se dispone de una serie de tubos capilares que contenganel mismo volumen de suero y cantidades crecientes de antgeno, puede observarse que elprecipitado formado alcanza un mximo, despus del cual, progresivamente, se encuentrauna disminucin en la cantidad de precipitado.Si se analizan los sobrenadantes de todos los tubos, los correspondientes a los quepresentan un mximo de precipitacin prcticamente no tienen antgeno ni anticuerpos,en tanto, en los precedentes puede demostrarse la presencia de anticuerpos y en el resto,la presencia de antgenos.Si los resultados se grafican, colocando en el eje de las abscisas la cantidad de antgenoagregado y en el eje de las ordenadas la cantidad de precipitado, se obtiene una curva,generalmente en forma de campana, que se puede dividir en tres regiones.La reaccin de precipitacin en medio semislido, se efecta en un gel y se conoce comoinmunodifusin. Esta consiste en la difusin, a travs de un gel, de un antgeno, y suanticuerpo homlogo con la consiguiente aparicin de una banda de precipitado en el sitiodonde se alcanzan las concentraciones ptimas de ambos reactivos.La velocidad de la difusin depende de la forma, tamao y la concentracin de lasmolculas precipitantes, as como de la temperatura a la cual se realice la reaccin.Cuando se tienen dos o ms tipos de molculas, stas se pueden difundir a diferentevelocidad. En el sitio donde se localicen zonas de concentracin ptima de antgeno y deanticuerpos se formarn bandas de precipitacin.Existen diferentes tipos de inmunodifusin; aquel en el que ambos reactivos difundenlibremente en el gel es llamado doble difusin o mtodo de Ouchterlony, el cual puedetener diversas aplicaciones, por ejemplo, la determinacin de la posible relacininmunolgica entre dos antgenos y del nmero de sistemas antgeno-anticuerpopresentes, as como la semicuantificacin de un antgeno o de un anticuerpo.Otra variante en la que slo uno de los reactivos (generalmente el antgeno) difunde en elgel, donde se haya embebido el otro (generalmente el antisuero), se conoce comoimunodifusin simple. En la imunodifusin radial se aplica este principio para determinarcuantitativamente la concentracin del antgeno, ste se encuentra en una concentracininicial tan alta, que se forman complejos solubles y a medida que se van difundiendo, la 15. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 15 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADAconcentracin disminuye hasta que, en el sitio donde los reactivos estn en proporcionesptimas, se forma un halo de precipitacin cuyo dimetro tiene relacin directa a laconcentracin del antgeno.La tcnica de imunoelectroforsis fue propuesta por Grabar y Williams quienescombinaron las tcnicas de electroforesis y de inmunodifusin para separar y determinarla presencia de los componentes de una mezcla de sustancias antignicas.Primeramente, los componentes de la mezcla son separados por la aplicacin de unacorriente elctrica y posteriormente, se hacen reaccionar con sus anticuerpos especficos,con los que se realiza la precipitacin. Esta prueba es ampliamente utilizada paradeterminar la pureza de sustancias antignicas.En la contrainmunoelectroforesis, los antgenos y sus anticuerpos simultneamente sesometen a la accin de un campo elctrico en un gel a Ph de 8.6. En estas condiciones,los anticuerpos casi no tienen carga, por lo que no se desplazarn bajo el efecto de lacorriente elctrica, sin embargo, se mueven hacia el ctodo debido al flujo endosmticodel regulador usado.Los antgenos que poseen carga negativa migran hacia el nodo y mediante ladisposicin apropiada de los pozos en el agar, se puede lograr que el antgeno y elanticuerpo se encuentren, reaccionen y se desarrollen bandas de precipitacin en pocotiempo, dependiendo de la concentracin y de la velocidad de migracin de los reactivos.Obviamente, este mtodo no es aplicable a antgenos con carga positiva o neutra.2. OBJETIVOS.2.1. OBJETIVO GENERAL. Evidenciar la reaccin de precipitacin que se lleva a cabo cuando hay interaccinentre antgeno soluble con anticuerpo homlogo.2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS2.2.1 Desarrollar la tcnica de precipitacin en capilar para la cuantificacin de losanticuerpos presente en un antisuero especfico.2.2.2 Valorar la reaccin de precipitacin3. MATERIALES Y REACTIVOS.3.1Material por equipo.- 11 tubos capilares de 100 mm de largo y de 1.6 a 1.8 mm de dimetro.- 8 tubos de ensaye de 13 x 100mm.- 8 pipetas de 1.0 ml.- 1 gradilla de plastilina.- Papel absorbente.3.2 Reactivos- 5 ml. de solucin salina isotnica.- 1.0 ml. de solucin de antgeno que se desea probar.- 1.0 ml. del antisuero correspondiente.- Antisuero del conejo obtenido antes de empezar el esquema de inmunizacin.4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.4.1. PRECIPITACION EN CAPILAR. 16. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL16UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADA 1. Se toman 7 capilares y con ayuda de un marcador se marcan a a un volumen de0.5 mL y 1 mL 2. En 7 tubos de ensaye de 13 x100 mm debidamente rotulados, se hacen dilucionesseriadas de la solucin de antgeno: a) Se colocan 0.5 ml de solucin salina en cada uno de los tubos de ensaye. b) Al tubo 1 se le agrega 0.5 ml de la solucin del Ag, se mezclan bien con la mismapipeta (dilucin 1: 2). c) Con una pipeta diferente se toman 0.5 ml del tubo 1 y se pasan al tubo 2, semezclan bien con la misma pipeta (dilucin 1: 4) d) El procedimiento se repite para los tubos siguientes (dilucin 1:8 a 1:128). 3. Se toma un tubo capilar y por capilaridad se absorbe un volumen tal de antisuero que llegue hasta la primera marca. La parte externa del capilar se limpia con papel absorbente (papel filtro grueso). 4. El tubo capilar se gira ligeramente y se hace descender el volumen de antisuero hasta el otro borde. 5. Por el extremo en el que se encuentra el antisuero en seguida se absorbe la cantidad necesaria de antgeno sin diluir (dilucin 1:1), de tal modo que el volumen total llegue hasta la siguiente marca del tubo. Se limpia la parte externa con papel absorbente. 6. Es necesario realizar dicha operacin con sumo cuidado, evitando que el antisuero se salga del capilar y contamine el antgeno. 7. Con el dedo ndice se tapa uno de los extremos del capilar y se deja que el contenido quede centrado en el capilar. 8. Un extremo se introduce en una barra de plastilina. 9. Se repite el procedimiento sealado en los incisos de 3 al 8 usando cada una de las diluciones del antgeno (de 1:2 a 1:128). 10. Un capilar se llena hasta la segunda marca con antgeno sin diluir y otro, en la misma forma, nicamente con antisuero. El primero es el testigo del antgeno y el segundo es el del anticuerpo. 11. Se dejar reposar y al trmino de la prctica a temperatura ambiente, si no hay reaccin aparente se guardan en el refrigerador y observar a las 12 y 24 horas. 12. Se mide la cantidad de precipitado en milmetros.4.2 PRECIPITACION EN CAPILAR.Observe cuidadosamente la serie de tubos capilares y mida la altura de la columnade material precipitado en aquellos en que se encuentre. Con estos datos complete unatabla que contengan los siguientes datos: Numero de tubo, factor de dilucin,concentracin del antgeno y altura de la columna.Numero de Capilar Dilucin del antgenoConcentracin del Precipitacin en mm antgeno1 1:12 1:43 1:164 1:645. CUESTIONARIO Que metodologas actuales se pueden aplicar para medir la reaccin antgeno-anticuerpo. 17. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 17UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADA Desarrolle un esquema para cuantificar la reaccin antgeno anticuerpo en ellaboratorio. Qu sugerencias tiene para optimizar la prctica. A nivel comercial que pruebas biolgicas-clnicas se utilizan en la reaccin Ag-Ac? 6. REFERENCIAS.7.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de tcnicas modernas en Inmunologa. Teora y prctica. 1. Edicin. INDRE-SSA. Mxico.7.2. Manual de laboratorio de Inmunologa. (2). Departamento de Inmunologa. Escuela Nacional de Ciencias Biolgica. ENCB-IPN. Mxico.7.3. Biotecnologa Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba.7.4. Mueller UW, Hawes CS, Jones WR. Monoclonal antibody production by hybridoma growth in Freunds adjuvant primed mice. J. Immunol. Methods 1986; 87:193. 18. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 18 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADAPRCTICA 4 DETERMINACIN DE PROTENA POR EL MTODO DE BRADFORD1. INTRODUCCIN El mtodo de Bradford, (1976) involucra la unin del azul brillante de CoomassieG-250 a la protena. Esta unin provoca un cambio en el mximo de absorcin de 465 a595 nm y este incremento a 595 nm es el que se cuantifica. Dicha unin es independientede la composicin de aminocidos de las protenas.2. OBJETIVO2.1 OBJETIVO GENERALDeterminar de manera cuantitativa el anticuerpo producido, para realizar lainmunodeteccin en medio slido western blot2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS Cuantificar el anticuerpo producido por la tcnica de Bradford Determinar la variacin de las muestras3. MATERIALES Y REACTIVOS.3.1 Material por equipo.- Espectrofotometro- celdas de cuarzo para leer- tubos tipo ependorff- 1 gradilla- Micropipetas- Puntas3.2 Reactivos- Reactivo de Bradford- Suero del conejo obtenido despus el esquema de inmunizacin.4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.Se determina la concentracin de protenas, por medio de una curva tipo con BSAy el reactivo de Bradford, como se indica abajo:(BSA) 200 0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25g/mL (mL)Agua destilada 0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0(mL)Reactivode 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75Bradford (mL) 19. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 19 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADAConcentracin 0 20 40 60 80100120 140160 180200de BSA g/mL)Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Despus de 5 min de agregado elreactivo de Bradford, se lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con un blancode reactivos (el que no contiene protena) y se calcula la ecuacin de la recta.La cantidad de protena contenida en la muestra se determina interpolando el dato deabsorbencia en la curva tipo elaborada con la albmina de suero de bovino a diferentesconcentraciones. Se utiliza la ecuacin obtenida de la curva tipoANEXOSPreparacin del reactivo de Bradford: 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 sedisuelven en 50mL de etanol al 95%. A esta solucin se le aaden 100 mL de cidofosfrico al 85% (w/v). La solucin resultante se diluye a un volumen final de 1litro. Lasconcentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) del colorante, 4.7% (w/v) de etanoly 8.5% (w/v) de cido fosfrico.5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976. Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990). 20. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 20 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADA PRCTICA 5 DETERMINACIN DE REACCIN Ag-Ac POR ELECTROTRANSFERENCIA1. INTRODUCCINLa tcnica de inmunoelectrotransferencia (IET), descrita por Towbin et al en 1979, es unode los mtodos ms tiles con que se cuenta para el anlisis antignico (Peferoen et al,1982). Esta metodologa combina el poder resolutivo de la electroforesis en geles depoliacrilamida (PAGE), en presencia o en ausencia de detergentes como el docecil sulfatode sodio (SDS), con las reacciones inmunoenzimticas en fase slida. Las protenasseparadas por pesos moleculares son electrotransferidas a membrana de nitrocelulosa(NC) o de Nylon, en donde se unen a los grupos reactivos de stas, quedandoinmovilizadas y expuestas en la superficie para reaccionar con los anticuerposcorrespondientes. El patrn que se obtiene sobre el papel de NC es una copia del patrnde separacin obtenido en el gel. Posteriormente de bloquean los sitios reactivos delpapel de NC que quedan libres, con alguna protena que no interfiera y a continuacin sehace reaccionar con los anticuerpos problema, los cuales podrn unirse a sus antgenoscorrespondientes inmovilizados en el papel (Brunete, 1981). La siguiente reaccin que seefecta corresponde a la primera interaccin antgeno-anticuerpo, que se pone demanifiesto al agregar un segundo anticuerpo unido a una enzima como peroxidasa u otroconjugado como protena A de Staphyloccocus aureus igualmente marcada.En el ensayo enzimtico se agrega el sustrato y un cromgeno que precipiten in situ parahacer visible la reaccin. Se puede identificar la clase de respuesta inmunolgica delhusped (IgM, IgG, IgA, IgE), usando el conjugado correspondiente.2. OBJETIVOS2.1 OBJETIVO GENERAL.Cuantificar el anticuerpo producido, para realizar la inmunodeteccin en medio slidowestern blot2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS2.2.1 Determinar la presencia del antgeno por medio de la tcnica deelectrotransferencia.2.2.2 Realizar la transferencia y deteccin por unin especifica.2.2.3. Corroborar que el esquema de inmunizacin se llevo de la manera adecuada3. MATERIALES Y REACTIVOS.3.1. Material por equipo. Cmara de electrotransferencia Fuente de Poder Papel filtro Whatman 3mm Papel de Nitrocelulosa Ambos papel de nitrocelulosa y papel filtro hay que cortarlos del mismo tamao del gel de porteinas (SDS-PAGE). Vasos de precipitado 21. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL21 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADA Micropipetas Matraces aforados Matraces erlenmeyer3.2. Reactivos Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8% Amortiguador del gel separador pH 8.8 Amortiguador del gel separador pH 6.8 Amortiguador de corrida 5X / SDS Amortiguador de muestra pH 6.8 Persulfato de amonio al 10% Sol. de azul de bromofenol 10 mg/mL Sol. teidora Sol. desteidora Amortiguador de electrotransferencia [25 mM Tris-HCl, 192 mM glicina, 20% (v/v) metanol, 0.01% (w/v) SDS, pH 8.3]. Solucin salina de fosfatos 0.01M, NaCl 0.15M, pH 7.2 (PBS) Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20,, 0.05%) Rojo de Ponceau [0.2% en cido tricloroactico 3%] Solucin de bloqueo Solucin cromgeno /sustrato4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.4.1 Tratamiento de las muestras5. A la muestra de protena con concentracin conocida se lleva a un volumen de 85 Lcon amortiguador de muestra. Adicionar con 10 L de la sol. de azul de bromofenol y 5 Lde -mercaptoetanol.6. Poner a ebullicin durante 5 minutos y enfriar.4.2 Procedimiento para el gel de SDS-PAGE7. Limpiar con etanol al 70% las placas de vidrio.8. Colocar el juego de placas de vidrio y separadores en la base para preparar el gel.9. Preparar el gel separador con forme a la Tabla 1, considerando que al final se adicionael TEMED y Persulfato de amonio para vaciar en la cmara de electroforesis. Vaciar el gelseparador evitando la formacin de burbujas hasta dejar un espacio de 3 cm a partir delborde superior de los vidrios (Tabla 1).Tabla 1.Gel separador para 15 mLSol. stock (mL) / Conc. gel (%)5 6789 10 12 13 15Sol. Acrilamida bisacrilamida 2.5 3.03.54.04.55.06.06.57.5Amortiguador pH 8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75Agua desionizada8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75Persulfato de amonio0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 22. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 22 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGADEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGA APLICADATEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.0110. Dejar polimerizar de 20-30 minutos11. Preparar el gel concentrador como lo ndica la Tabla 2, vaciar en la parte superior delgel.Tabla 2. Gel concentrador para 2 mLSol. Acrilamida bisacrilamida 0.26 mLAmortiguador pH 6.80.5 mLAgua desionizada1.22 mLPersulfato de amonio0.01 mLTEMED 0.002 mL 3.Colocar el peine con cuidado de no formar burbujas y dejar polimerizar por 20 min. 4.Preparar las muestras y el marcador de peso molecular. 5.Montar las placas de vidrio en su base y sta en la cmara de electrofresis. 6.Preparar el amortiguador de corrida al 1X. 7.Llenar la cmara interna con amortiguador de corrida hasta el lmite y la parte externa hasta cubrir los electrodos. 8. Cargar el gel con las muestras y el marcador de peso molecular. 9. Tapar y conectar los electrodos a la fuente de poder. 10. Iniciar con un voltaje de 50 V hasta que las muestras pasen del gel concentrador, posteriormente aumentar a 100 V hasta que el frente alcance la parte inferior del gel. 11. Apagar la fuente de poder y recuperar el amortiguador de corrida (se puede utilizar hasta 3 veces) 12. Desmontar la cmara y extraer con cuidado el gel. Colocar el gel en un recipiente adecuado y teirlo con la sol. correspondiente. Colocar en agitacin orbital durante 1 hora aprox. Retirar el gel y sumergirlo en la sol. desteidora hasta desteir bien el gel. Una vez obtenido el gel SDS-PAGE, se sumerge en amortiguador de transferencia.4.3 Preparacin de la cmara y transferencia.1.- Colocar fibras Scotch y papeles Whatman (grosor 0.16 mm) en un recipiente consuficiente amortiguador de transferencia, 30 minutos antes de transferir.2.- Cortar la membrana de nitrocelulosa (NC) de acuerdo al tamao del gel (utilizandoguantes) y colocarla en otro recipiente que contenga amortiguador de transferencia.3.- Colocar dos fibras Scoth en un cassette para electrotransferencia, sobre las cualesse colocan dos porciones de papel filtro teniendo cuidado que no queden burbujasatrapadas entre los papeles; despus colocar el gel y sobre este la membrana de NC;eliminar las burbujas.4.- Con un lpiz marcar el frente de electroforesis del gel, sobre el papel de NC y sealarel nmero de carril de acuerdo a la colocacin de las muestras, colocar otros dos papelesfiltros sobre la NC y otras dos fibras. Cerrar el cassette e insertarlo en el contenedor.5.- Colocar el contenedor en la cmara y llenarla con el amortiguador de transferencia,tapar y conectar los electrodos de tal manera que el nodo (-) quede del lado del gel y el 23. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 23 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADActodo (+) del lado de la NC; conectar a la fuente de poder y transferir durante 1 hora a100 V, cuidando de que la temperatura del lquido no se eleve a ms de 60 C.6.- Al terminar la transferencia tomar la membrana de NC con guantes y colocarla en unrecipiente con solucin para teir (durante 20 minutos)7.- Observar en la membrana si se distinguen las protenas que fueros transferidas, lavarcon agua destilada para retirar el exceso de colorante y secar; si no se alcanzan adistinguir las bandas teir otros 20 min.4.4 Reaccin inmunoenzimtica1.- Colocar la membrana de NC en un recipiente que contenga 30-50 mL del amortiguadorde bloqueo e incubar 2 h a temperatura ambiente en agitacin continua.2.- Eliminar el exceso de solucin de bloqueo por decantacin y hacer 3 lavados con PBS-Tween de 5 min. Cada uno con agitacin contina.3.- Incubar la membrana con el suero o anticuerpo de inters a las diluciones establecidascon anterioridad.4.- Eliminar el exceso y lavar come en el paso 2.5.- Posteriormente se agrega el conjugado correspondiente en la dilucin apropiada conPBS-Tween. Se incuba durante 2 h a temperatura ambiente con agitacin continua.6.- Se repite el paso 4.7.- Por ltimo se agrega la solucin cromgeno/sustrato para dot-ELISA einmunoelectrotransferencia y se espera hasta que aparezcan las bandas; despus seenjuaga con agua desionizada y se deja secar.ANEXOSSOLUCIONES PARA GEL SDS-PAGEAcrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) ms 0.8g de bis-acrilamida. Disolver en aguabidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco mbar a 4C. Usar guantes al pesar ya que la archilamida es un compuesto neurotxico.Amortiguador del gel separador pH 8.8Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustarel pH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.Amortiguador del gel separador pH 6.8Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar elpH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.Amortiguador de corrida 5X / SDSPesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de Glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizaday aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X.Amortiguador de muestra pH 6.8Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada yajustar el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar elvolumen a 100 mL.Persulfato de amonio al 10% 24. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 24 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADASe prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mnimo necesario.Sol. de azul de bromofenol 10 mg/mLPesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardaren refrigeracin.Sol. teidoraPara preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de cido actico y 40 mL deagua desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Commasie en elmetanol y adicionar el cido actico. Aforar con el agua desionizada.Sol. desteidoraPara preparar 500 mL se usan 25 mL de cido actico, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL deagua desionizada.SOLUCIONES DE ELECTROTRANSFERENCIAAmortiguador de transferencia(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2My agregar 14.49 g de glicina, aadir 200mL de metanol aforar a 1000 mL con aguabidestilada. Guardar a 4C. Nota: No ajustar pH oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de lacalidad del tris, el metanol debe ser grado analtico, este amortiguador se puede usarhasta 3 veces, despus de cada uso filtrar con papel Whatman n 1.Solucin salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS)Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y 8.75 g de NaCl.Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con agua desionizada. La solucin de PBse prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobsico monohidratado y 11.5 g de fosfatode sodio dibsico anhidro. Disolver en 200 mL de agua desionizada y aforar a 1 L conagua desionizada.Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%)A un litro de PBS pH 7.2 aadir 500 L de Tween 20.Solucin de bloqueo.Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20.Guardar a -20 C.Rojo de Ponceau 0.2% en cido tricloroactico 3%Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y aadir 3 g de cido tricloroactico. Aforar a 100 mlcon agua desionizada. Mantener a 4 C en frasco color ambar.Solucin cromgeno / sustratoPesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, aadir 5 mL de metanol absoluto y 25 mL de PBS,agregar 25 l de perxido de hidrgeno al 3%. Nota: esta solucin se preparainmediatamente antes de usarla.5. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 25. INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL 25 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOSINMUNOLOGA APLICADA1. Fundenberg, Hugh, Stites Daniel, Caldwell, Joseph, Wells, Vivian, Manual deInmunologa clinica, segunda edicin, editorial el Manual Moderno, Mexico, 1980, pp. 50-60.2. Towbin H., Staehelin, Gorgon J.. Electrophoretic transfer of proteins frompolyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc NatlSci USA, 1979, 76:4350.3. Peferoen M. R., Huybrechts R., De Loof A. Vaccum-blotting: A new simple and efficienttransfer of proteins from sodium docedyl sulfate-polyacrylamide gels to nitrocellulose.FEBS Lett. 1982, 145:369.