Pruebas de Laboratorio

ELISA

Western Blot

Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)

Dr. Luis Aragón D.

ELISA

Enzyme

Linked

Immuno

Sorvent

Assay

Qué es?

Prueba de inmunoanálisis empleada para el estudio

cuantitativo de antigenos y anticuerpos específicos.

Se basa en el uso de antígenos o anticuerpos

marcados con una enzima, e insolubilizado sobre un

soporte (inmunoadsorbente) en donde la reacción

antígeno-anticuerpo queda inmovilizada, se le

agrega un substrato especifico que al actuar con la

enzima produce un color cuantificable mediante el

uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

Tipos

• ELISA Directo (Ac marcados con enzima)

• ELISA Indirecto (suero – Antígenos

fijados)

• ELISA Competitivo (Ac específicos del agente patógeno a detectar )

• ELISA sándwich

– Doble (DAS)

– Heterólogo (HADAS)

En qué consiste? Pasos generales de un ELISA.

1.Se agrega el antígeno o anticuerpo.

2.Se mezcla la muestra con los antígenos o

anticuerpos. Se unen

3.Se lava el exceso no unido

4.Se agrega el anticuerpo (2) marcado con la

enzima y se une al antígeno

5.Lavado eliminar el exceso de enzima no unida

6.Por ultimo se agrega el substrato este su une a la

enzima desarrollando el color, listo para cuantificar

Aplicaciones

Hormonas

Gonadotropina coriónica

Progesterona

Testosterona

Hormonas tiroideas (T3, T4)

Cuantificación de inmunoglobulinas

IgG (rubeola)

IgE

IgA

IgM (toxoplasma)

Inmunopatología

Anticuerpos contra HIV-1

Anticuerpos contra antígeno de superficie (anti Hbs)

Antígeno superficie (AgH- Bs)

Factor reumatoide

Inmunocomplejos circulantes

Aplicaciones

Enfermedades producidas por parásitos

Babesias y tripanosomas

Toxocara canis

Toxoplasmosis

Enfermedades producidas por Micoplasmas

Enfermedades producidas por bacterias

Mycobacterium tuberculosis

Enterotoxinas Vibrio cholerae

Estreptococos

Salmonela

Enfermedades producidas por virus

Fiebre aftosa

Rotavirus

Artritis vírica

Western Blot

El término “blotting” hace

referencia a la

transferencia de

macromoléculas biológicas

desde un gel hasta una

membrana y su posterior

detección en la superficie

de la misma.

Qué es?

• La técnica del Western Blot también llamado

“inmunoblotting” utiliza anticuerpos para detectar el

antígeno o los antígenos específicos de interés.

• La especificidad de la unión antígeno –anticuerpo permite

la detección de una única proteína dentro de una mezcla

compleja de otras proteínas. En la actualidad se utiliza

como criterio de identificación positivo de una proteína

especifica en una mezcla compleja y para obtener datos

cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.

Método Directo

El anticuerpo

primario

marcado se une al

antígeno de la

membrana y

reacciona

con el sustrato

originando una señal

detectable.

Método Indirecto

El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego, un anticuerpo(2) marcado se une al primario y reacciona con el sustrato.

1.Separación de las macromoléculas mediante geles de electroforesis.

2.Las macromoléculas ya separadas en función de su diferente

peso molecular se transfieren a una segunda matriz(membrana de nitrocelulosa). Posteriormente, se bloquea la membrana para evitar la unión inespecífica a su superficie de los anticuerpos que se van a utilizar para la detección de la proteína de interés.

3.Se une a dicha proteína transferida un anticuerpo especifico marcado con una enzima

4.Finalmente se añade un sustrato para dicha enzima con lo que se produce un producto detectable

Se utilizan sustratos quimioluminiscentes que cuando se combinan con la enzima correspondiente, producen luz como producto final, que se detecta con una película o una cámara especializada.

La intensidad de la señal se correlaciona con la cantidad del antígeno en la superficie de la membrana.

PCR

Reacción en

Cadena de

Polimerasa

Qué es?

• Prueba de amplificación genética, que permite

detectar en sangre o en ganglios linfáticos células

malignas.

• Hace posible la multiplicación de segmentos de

ADN por un factor de hasta 10 a la sexta potencia

• A partir de cantidades pequeñas como una sola

célula es posible identificar elementos específicos

que faciliten el diagnóstico de procesos neoplásicos.

En qué consiste?

• Transcripción inversa: se amplifican las secuencias

mensajeras ARNm para convertirlas a ADN

complementaria (enzima reversa transcriptasa-

polimerasa)

• Mediante la técnica RT-PCR la ADNc es amplificada

y esto permite identificar una población celular que

porte la molécula ARNm especifica.

Aplicaciones

• Diagnóstico enfermedades infecciosas

• Diagnóstico infección por VIH (neonatal)

• Anemia células falciformes

• Leucemias

• Melanomas

• Neoplasias

Bibliografía

• Angel G, Angel M, Interpretation Clínica de Laboratorio, 7a

Edición 2006

• Morrison K, Laboratorio Clínico y Pruebas de Diagnóstico,

1era Edición en Español

• Harrison T, Harrison Principios de Medicina Interna, 16a

Edición, 2006

• Masson, Diccionario Médico, 4a Edición, 2005

Playa Hermosa, Costa Rica