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cristinabenjumeazuluaga
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INTRODUCTION
Idiopathic membranous nephropathy is an
autoimmune disease and a common cause of the nephrotic syndrome in
adults
The phospholipase A2 receptor 1 (PLA2R1) was discovered as the major antigen involved in
the pathogenesis of adult idiopathic membranous
nephropathy.
30% of the patients with this disease have no obvious secondary cause of the disease
is thought that other endogenous
glomerular antigens may be involved in
these cases.
They analyzed serum samples from patients with :
idiopathic membranous nephropathy patients
other glomerular diseases
healthy controls
to identify circulating antibodies against
glomerular antigens other than PLA2R1
THROMBOSPONDIN TYPE 1
• It is a protein that in humans is encoded by the THBS1 gene.• This protein is an adhesive glycoprotein that mediates cell-to-cell and cell-
to-matrix interactions. It can bind to fibrinogen, fibronectin, laminin and type V collagen
FUNCTIONS
• Natural inhibitor of neovascularization and tumorigenesis (apoptosis) in healthy tissue.
• Positive and negative modulation of endothelial cell adhesion, motility, and growth.
• Affecting neuronal migration in the rostral migratory stream.• Interacts with numerous proteases involved in angiogenesis• Inmune system regulation
Nephropathy
Damage or disease of a kidney
Nephrosis: is non-inflammatory nephropathy
Nephritis is inflammatory kidney disease.
Bowel incontinenceBladder incontinenceCoordination problemsDiarrheaDysphagiaHypotensionImpotenceNauseaProblems with balanceTachycardiaVomiting
IDIOPATHIC MEMBRANOUS NEPHROPATHY
• Is one of the principal causes of nephropathy. It is caused by the thickening of part of the glomerular basement membrane which helps filter the blood.
• The thicker glomerular membrane does not work normally. As a result, Large amounts of protein are lost in the urine.
• 70% of the times is associated with PLA2R1, the other 30% is still unknown .
IDIOPATHIC MEMBRANOUS NEPHROPATHY
Symptoms :• Edema • Fatigue• Poor appetite• Urination, excessive at night• Weight gain
IDIOPATHIC MEMBRANOUS NEPHROPATHY
30% of the patients with this disease have no
obvious secondary cause of the
disease
Scientist are evaluating circulating
antibodies against glomerular antigens
THBS1
Can be one of the genes affected on
this disease
OBJECTIVE
Find circulating antibodies against glomerular antigens other than PLA2R1, that can explain the other 30% of the patents that are still an unknown process
Materiales y métodos: pacientes
• Dx de IMN Biopsia renal.
Muestras de suero
Nefropatía membranosa
65
Otras enfermedades glomerulares
76
Control
44
Anticuerpos anti-PLA2R1
ELISA
Western blot
Materiales y métodos: pacientes
• Muestras excluidas cuando: <18 añosEdad, género o proteinuria no disponibleProteinuria <1 g/dL
Materiales y métodos: tejido renal
Ext
ract
o de
pro
teín
a gl
omer
ular
Riñones nefrectomizados Porción sana
Riñones de donantes Corteza
Materiales y métodos: Western blot/inmunoblot
Detectar proteínas específicas en una muestra determinada
Electroforesis en gel: se separan proteínas según su tamaño
Se transfieren a una membrana de PVDF* o nitrocelulosa para buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella
Materiales y métodos: Western blot/inmunoblot
• Para usarse como primer anticuerpo, el suero fue diluido en proporción 1:100
• Para detectar la THSD7A, se usó un anticuerpo policlonal del conejo en una dilución 1:1000
Materiales y métodos: Inmunoprecipitación
• Demuestra la existencia de anticuerpos que provocan la precipitación de sus antígenos cuando ambos están solución
Aísla una proteína de interés en una solución
Materiales y métodos: Inmunoprecipitación
Anticuerpos unidos a sustrato
sólido*
Gránulos se añaden a la mezcla de proteínas
Proteínas blanco capturadas por
los gránulos
*Gránulos microscópicos superparamagnéticos o gránulos microscópicos de agarosa (no magnético).
Método directo
Materiales y métodos: Inmunoprecipitación
Anticuerpos en la mezcla de
proteínas
Se unen a su objetivo
Perlas recubiertas de
proteína A/G se unen a la mezcla
Método indirecto
Materiales y métodos: Inmunoprecipitación
Extractos glomerulares se incubaron toda la noche con las muestras de suero.
Se les añadió Matriz de afinidad IgG4 para purificación y aislamiento de dicha Ig
Se recogieron los inmunoprecipitados
Examinar la presencia de la proteína THSD7A usando los anticuerpos anti-THSD7A
Materiales y métodos: Espectrometría de masasBandas
visibles del WB.
Corte
Digestión con tripsina
Péptidos digeridos identificados con espectrometría de
masas
• Permite elucidar
estructura y propiedades químicas
de una molécula.
Materiales y métodos: análisis histológico
• Inmunofluorescencia: visualizar la distribución de una proteína o antígeno específico en células o secciones de tejido.
• Inmunohistoquímica: revela la existencia de distintas proteínas en las muestras de tejidos, permiten conocer el origen y la función de diferentes células.
RESULTADOS
Se estudiaron muestras de Pacientes con NMI y muestras control para analizar total de proteínas en extractos glomerulares humanos
Positivos para anticuerpos
PLA2R1
Reaccionaron con PLA2R1 nativo y
recombinante
Negativos para anticuerpos
PLA2R1
Reaccionaron para una proteína
de 250 KD
Muestras control o con otras
enfermedades glomerulares
No presentaron ninguna
reacción similar
RESULTADOS
• En pacientes negativos para anticuerpos PLA2R1 se encontró un antígeno de 250 KD presente en el glomérulo humano.
• Se encontró que es una proteína N-glicosilada y que se expresa exclusivamente en la membrana celular, lo que ayuda a concluir que es diferente al PLA2R1.
RESULTADOS
Se usaron dos estrategias para
identificar el antígeno
Hidrolisis parcial de proteínas
Electroforesis y western blot
Se encontraron 3 bandas : 250, 225 y
200 KD
Se generó una lista de posibles antígenos
Por:CaracterísticasLocalización
Expresión en riñón humano
RESULTADOS
• Tras todos los estudios realizados se detectó que la proteína que se estaba buscando era la THSD7A
• También se vio que tanto la forma nativa como la recombinante de la proteína mostraban la misma masa tras la glicosilacion lo que se puede interpretar como una pequeña diferencia en modificaciones post transcripcionales.
• Todas las muestras presentaron inmunoprecipitación
RESULTADOS
Para determinar la Ig predominante, se usaron
anticuerpos contra IgG1 hasta IgG4
La predominante es la IgG4
RESULTADOS
THSD7A nativo y recombinante desaparecieron tras el proceso de reducción lo que sugiere que los anticuerpos atacan en epitopos específicos
RESULTADOS3 pacientes analizados
en western blot y proteína en orina.
1. Proteínas altas al diagnóstico.
2. Bajaron con inhibición farmacológica
3. 4 meses después subió nuevamente con aumento de anticuerpos.
4. Cambio de tratamiento.
5. Baja proteínas y anticuerpos.
1. Proteinuria severa
2. Tratamiento con corticotropina
3. Baja anticuerpos y proteinuria
1. No recibió inmunosupresores
2. Alta proteinuria constante
RESULTADOS
Las biopsias renales se analizaron con inmunofluorescencias, se encontró que:• THSD7A se relaciona con colágeno tipo IV y la
fibronectina.• Se ubica principalmente en podocitos.
RESULTADOS
Al comparar características clínicas, no se encontraron relevancias en • Edad• Proteinuria• Albumina sérica• creatinina• Inmunosupresión
Si se encontraron cambios significativos en el género, encontrando ms mujeres en el grupo positivo para THSD7A
(65% )
Discussion
Names What did they say? Agree Disagree
Debiec H, Svobodova B, et al.
“Staining of the biopsy specimen for the presence of the antigen (THSD7A or PLA2R1) may identify a small additional percentage of patients whose serum was sampled after immunologic remission had occurred.”
x
Ju W, Greene SC, et al.
“This finding is consistent with recent data showing that THSD7A is more highly expressed in podocytes than in glomerular endothelial and mesangial cells.”
x
Discussion
Names What did they say? Agree Disagree
East L, Isacke CM “THSD7A was initially characterized as an endothelial protein that is expressed in the placental vasculature. ”
x
Hoxha E, Debiec H, et al.
“Furthermore, renal-biopsy samples from patients who were positive for anti-THSD7A antibodies had increased staining for the antigen within immune deposits, a phenomenon also seen in patients who are positive for anti-PLA2R1 antibodies”
x
Personal conclussions
• I think is very important to know a new antigen for the IMN, because it is a way to create effective treatments for these people. This discovery is very interesting because the authors are motivating us to investigate. Now is clear that PLA2R1 and THSD7A are implicated in IMN, but now the objective is to search which are the others antigens implicated in this disease and why the antibodies are expressing in some people but not in others.
Personal conclussions
• Been able to investigate this kind of diseases that don't have a known reason is a really good thing, because lots of them can have a better treatment if only the scientist and doctors could understand what is really happening, because some of this are not well treat not because lack of possibilities but because lack of knowledge.