Preanalitičke varijabile i biološke varijacije u Kliničkoj enzimologiji

Predavanja iz Kliničke enzimologijeIntegrisane akademske studije: Farmacija-

medicinska biohemijaŠkolska 2014/2015. godina

Preanalitičkafaza

Analitička faza

?

Tumačenjerezultata

Laboratorijsko odreñivanje aktivnosti enzima

2

Preanalitička faza u ispitivanju enzimskog statusa

Nekontrolabilni efektiDugoročni efekti

• Biološki uticajiGodine, pol, rasa, genetski faktori

• Faktori okolineNadmorska visina, temperatura, mesto

stanovanja• Dugotrajne ciklične promene

Sezonske varijacije,menstrualni ciklus• Medicinska stanja

gojaznost, trudnoća, stres,groznica, šok trauma, transfuzija, Hirurške intervencije

Kontrolabilni faktoriKratkoročni efekti

• Uzimanje i obrada uzoraka• Fiziološke varijacije

Položaj tela, dugo ležanje, fizičkaaktivnost, trening, cirkadijalnevarijacije, putovanja

• Ishrana i navikeVrsta hrane, kofein,vegeterijanstvo, gladovanje,malnutricija

• Druge životne navikePušenje, alkohol

• Lekovi• Biljni preparati

3

Preanalitičke varijacije koje mogu da se kontrolišu

• Fiziološke varijacije• Položaj tela

– Stajanje– Produženo ležanje

• Vežbanje• Fizički trening• Cirkadijalne varijacije• Putovanja• Ishrana

– Uzimanje hrane– Uzimanje specifične hrane

• Životne navike– Pušenje– Alkohol

• Uzimanje lekova

4

Standardizacija uzimanja uzoraka

• Pravilna identifikacija pacijenta i njegovog uzorka

• Pravilno uzimanje uzoraka krvi

5

Kontrolabilni faktori Uzimanje i obrada uzoraka

• Uzimanje uzorka natašte ili posle obroka• Položaj tela• Venska staza• Kapilarna ili venska krv• Antikoagulansi i konzervansi

• Čuvanje uzoraka

6

Biološki materijal u kliničkoj enzimologiji

• Krv– Venska krv– Serum, plazma– Puna krv za izdvajanje eritrocita– Antikoagulans heparin, citrat, EDTA, fluorid– Čuvanje eritrocita ACD rastvor– Izolacija eritrocita

• Urin– Porcija urina

• Cerebrospinalna tečnost• Amnionska tečnost• Saliva• Suze• Limfa• Pleuralna i perikardijalna tečnost• Peritonealna tečnost

7

• Uzorak za hemokulturu• Epruvete bez aditiva• Citrat• Heparin• KEDTA• Oksalat/Fluorid

8

Redosled uzimanja uzoraka sa različitim aditivima – Preporuka CLSI

Venepunkcija i hemoliza

• Upotreba odgovarajuće igle

• Izbeći snažno mešanje vakutejnera sa krvlju, punkcija kože pre

nego što je alkohol upotrebljen za brisanje kože,preuska igla,

suviše jak vakuum, neadekvatan transport.

• Povećane aktivnosti:

• LD, AST, kisele fosfataze

• LD marker hemolize

Hemoliza daje lažno pozitivne rezultate zbog:

1. Oslobañanja sadržaja eritrocita u plazmu (enzimi, kalijum)

2. Spektrofotometrijske interferencije samog hemoglobina

3. Efekat hemolize zavise od stepena hemolize

4. Interferencija analita iz eritrocita na metodu odreñivanja

Primer: kreatin kinaza 9

Hemoliza

Eritrociti

Stabilnost uzoraka

• Čuvanje pune krvi• Čuvanje seruma

– Sobna temperatura– Frižider +4 0C– Zamrzavanje na -20 0C– Zamrzavanje na -800C

• Stabilnost enzima• ALP, α-amilaza, ALT, AST, CK, CHE, GGT, LD

- stabilni su min 4 dana na 4 ⁰C;

• ALP, α-amilaza, ALT, AST, CHE

– stabilni su do 3 dana na sobnoj temperaturi• Kisela fosfataza nestabilna • Kod uzimanja uzoraka u serum se dodaje kiselina 10

Uticaj položaja tela- Posturalne promene

• Promena položaja tela iz ležečeg u uspravni– redukcija volumena krvi za 10 % (oko 600 ml)– povećanje proteina plazme za 8-10 %– ova promena traje 10 minuta– obrnuto 30 minuta

• Zašto dolazi do ovih promena ?• Transfer tečnosti kroz zid kapilara zavisi od kompleksne interakcije

hidrostatskog i osmotskog pritiska kapilarne i intestinalne tečnosti• U ležećem položaju više tečnosti se vraća u kapilare• Uticaj kateholamina, aldosterona, angiotenzima II renima i

antidiuretičnih hormona

11

Fiziološke varijacijeStajanje

Promene u aktivnostima serumskih enzima pri promenipoložaja tela iz ležečeg u uspravni položaj

EnzimProse ćno

povećanje %

Alanin aminotransferaza

7

Alkalna fosfataza 7

Amilaza 6

Aspartat aminotransferaza

5

12

Preporuke Minimum 15 minuta u sedećem položaju

Prosećan porast 5-10 %

Uticaj položaja tela- Posturalne promene

• Promena položaja tela iz uspravnog u ležeći ili sedeći– Smanjenje hematokrita zbog hipervolemije za 6,5 %– Redukcija proteina i supstanci vezanih za proteine– Promene u koncentraciji proteina sa posturalnim promenama su

veće kod hipertenzičara, osoba sa niskim proteinima i kod starijih

13

Uticaj venske staze

• Uticaj venske staze• Efekat poveske identičan efektu promene položaja tela iz

ležečeg u stojeći položaj.• kompresija vene 6 minuta dovodi do • porast enzima• ALP, ALT, CK, GGT i LD• za 8-10%

14

Fiziološke varijacijeProduženo ležanje u krevetu

• Produženo ležanje u krevetu• Zapremina plazme i ekstracelularne tečnosti se

smanjuje posle nekoliko dana od početka ležanja. – Povećava se hematokrit za 10 % u toku 4 dana.– Zapaža se i mali pad ukupne količine vode u organizmu ali

nakon 2 nedelje ležanja zapremina plazme se opet vraća na normalu.

• AST se snižava tokom ležanja• CK može da se poveća zbog oslobañanja iz mišića

– Obično je niža nego kod fizički aktivnih osoba

15

Fiziološke varijacijeVežbanje

• Efekat dužine vežbanja i intenziteta• Statičko ili izometrično vežbanje

– Kratko traje i vrlo je intenzivno– Koriste deponovani ATP i kreatin fosfat

• Produženo vežbanje– Koristi se ATP koji nastaje u normalnim metaboličkim procesima

• Promene u vežbanju su posledica:– Pomaka tečnosti izmeñu intravaskularnog i intersticijalnog prostora – Uticaja hormona koji se luče (kateholamini i beta-endorfin)– Gubitka tečnosti zbog znojenja

16

Fiziološke varijacijeVežbanje

• Umereno vežbanje• Vežbanje snižava koncentraciju ATP u ćeliji što ima za posledicu

povećanu ćelijsku permeabilnost.• Povećana je aktivnost enzima skeletnih mišića: • CK, AST, LD i aldolaze.• Porast CK > AST > LD• CK potiče od CK-MM, a vrlo malo je povećanje CK-MB• Fizičke aktivnosti u toku dana u trajanju od 4 sata povećavaju aktivnost

CK za 50 %• Vraćanje u normalne vrednosti za 7 dana

17

Fiziološke varijacijeVežbanje

Enzim Pove ćanje % Enzim Sniženje %

Kisela fosfataza 11Laktat dehidrogenaza

1

Alanin aminotransferaza

41

Alkalna fosfataza 3

Aspartat aminotransferaza

31

Promene u aktivnostima serumskih enzima pri intenzivnom vežbanjuMereno 15 minuta posle 20 minuta vežbanja

18

Fiziološke varijacijeIntenzivno vežbanje - trening

• Intenzivno vežbanje• Naporno vežbanje • Duplira CK aktivnost

• Fizički trening• Atletičari generalno imaju više vrednosti aktivnosti serumskih mišićnih enzima

u mirovanju u odnosu na neatletičare.

• Odgovor mišićnih serumskih enzima na vežbanje je manje kod atletičara

• Manje je oslobañanje enzima iz mišića kod dobro utreniranih osoba posledica je povećanja veličine i broja mitohondrija koji omogućava mišićima da bolje metaboliše glukozu, masne kiseline i ketonska tela.

• Proporcija CK prema CK-MB je veći kod utreniranih osoba.

• Povišenje ALT kod korištenja anaboličkih steroida

19

Cirkadijalne varijacije

• Mnogi konstituenti telesnih tečnosti pokazuju ciklične varijacije• Faktori koji doprinose ovim varijacijama su:

– stajanje, aktivnost, unos hrane, stres, dnevna svetlost i noć, spavanje ili budnost.

• Zbog ovih varijacija važno je vreme uzimanja uzoraka• Hormoni se izlučuju u naletima

20

Cirkadijalne varijacije

Enzim VrednostTotalna

varijacija, %Analiti čka

Varijacija, %

Aspartat Aminotransferaza,U/L

9 25 6

Alanin Aminotransferaza, U/L

6 56 17

Kisela fosfataza, U/L 3 15 8

Alkalna fosfataza, U/L63 20 3

Laktat Dehidrogenaza, U/L

195 16 12

Ukupna i analitička varijacija za serumske enzime u 8,00 i 14,00 sati

21

Fiziološke varijacijePutovanja

• Putovanje kroz vremenske zone• Poremećaj normalnog cirkadijalnog ritma• Promene u hormonima štitne žlezde i nadbubrežnih

žlezda• Tokom 20 sati leta povećanje glukoze i TG zbog

stimulacije glukokortikoida

22

Uzimanje hrane

Vrsta hraneKofeinVegeterijanciMalnutritionDugotrajno gladovanje

23

• Ukoliko se ugljeni hidrati sastoje iz skroba ili saharoze, onda su povećane aktivnosti LD i ALP.

• Aktivnosti ALT i AST su isto tako zavisne od tipa unetog šećera.• Viši su ako se unosi šećer nego kod unosa skroba.

Uticaj vrste unete hrane

Fiziološke varijacijeUnos hrane

• Koncentracija mnogih parametara krvi je pod uticajem unete hrane, pri čemu vreme izmeñu unosa hrane i kolekcije krvi utiče na analite krvi.

• Primer

• Gladovanje od 10-14 sati pre uzimanja krvi smanjuje varijabilnost u koncentracijama mnogih analita i smatra se optimalnim vremenom za gladovanje kod standardizacije uzimanja krvi

• Najveći porast posle obroka je u glukozi i TG.

• Povećanje ALP (posebno izoenzima intestinalne ALP) je veće kod uzimanja masnog obroka i pod uticajem je krvne grupe individue i zavisi od supstrata koji se koristi prilikom odreñivanja.

• ALT i AST su povećane za prosečno 10-20 % posle obroka.

24

Uticaj ishrane

Uticaj standardnog obroka od 700 kcal na aktivnosti serumskih enzima

Enzim Pre obroka2 sata posle

obroka

Alanin Aminotransferaza, U/L

31 33

Alkalna fosfataza, U/L 46 46

Aspartat Aminotransferaza, U/L

22 28

Laktatdehidrogenaza, U/L

198 198

25

Dugotrajno izgladnjivanje i gladovanje

• Efekat na glukozu – sniženje– Insulin se snižava, povećava se glukagon (2X)

• Stimulacija lipolize i hepatične ketogeneze• Aminokiseline iz mišića se oslobañaju i koncentracija račvastih a.k. se

povećava• Izvori energije u gladovanju:

– Glavni izvor energije su masne i ketokiseline za mišiće.– Akumulacija organskih kiselina metabolička acidoza– Razgradnja masti dovodi do prolaznog povećanja vode u telu. – Gladovanje 6 dana povećava koncentraciju holesterola i TG i snižavanja HDL-

holesterola.– Posle 4 nedelje na dijeti od 400 kcal snižavanje ureje i TG

• Promene u enzimima zbog katabolizma aminokiselina• aktivnost GGT se snižava za 20 do 50%• aktivnost AST se povećava za 20-40%.

26

Životne navike

• Pušenje i alkohol• Pušenje• Dejstvo nikotina • Efekat zavisi od broja cigareta i i unetog dima• Deluje na nadbubreg i povećava lučenje adrenalina• Više vrednosti pre svega lipidnih parametara• Povećan rizik od ateroskleroze• Poremećaj funkcije endotela• Nema efekta na enzime

27

Alkohol

• Akutno uzimanje alkohola povećava enzime:– GGT, izocitrat dehidrogenazu i ornitinkarbamoil transferazu

• Uzimanje alkohola u konc 1g/kg TT povećava aktivnost GGT– za 10 % 4 sata kasnije – za 100 % posle 24 sata – efekat mikrozomalne indukcije sinteze enzima u jetri

• Hronični alkoholizam – GGT 1000x povećanje– Marker hroničnog alkoholizma– Povećanje : AST (250%) i ALT(60%)

28

Lekovi• Istovremeno uzimanje velikog broja lekova i do 10 • Pogotovu kod hroničnih bolesti• In vivo i in vitro efekti

• Intramuskularno davanje lekova– Povećanje mišićnih enzima: CK, aldolaza i LD– Davanje penicilina i drugih lekova– Povećanje ostaje nekoliko dana

Opijati• dovode do spazma odijevog sfinktera i povećanja pankreasnih i hepatičnih

enzima

Oralni kontraceptivi• Efekat progestina i estrogena • Odnos ove dve komponente i količine• Mehanizam estrogen indukuje sintezu proteina koji vezuju hormone u jetri• Dolazi do povećanja plazmatskih koncentracije tiroidnih hormona,

glukokortikoida i polnih hormona• Indukuju sintezu GGT 29

Lekovi

Diuretici• Pre svega efekat na elektrolite• Tiazidi dovode do hemokoncentracije i to utiče na lipide• Tiazidi dovode do indukcije mikrozomalnih enzima i to utiče na koncentraciju

lipoproteina.

Fenitoin• Duga upotreba utiče na povećanu aktivnost ALP, snižen Ca i fosfat,

osteomalacija• Utiče na indukciju sinteze enzima koji konjuguju bilirubin u jetri• Redukovan je bilirubin, • Povećan GGT• Aminotransferaze mogu biti povećane

30

Lekovi

• In vitro efekat lekova• Interferencije sa analitičkim metodama• Spironolaktoni• Fluorescein• Manitol• Radiografski kontrasti• Askorbinska kiselina• Interferencija sa dokazivanjem hemoglobina u urinu i

fecesu

31

Nekontrolabilne varijacije

• Biološke varijacije• Uticaji okoline• Dugotrajni ciklični uticaji• Medicinska stanja

32

Biološke varijacije

• Godine• Pol• Rasa• Genetika• Uticaj na holesterol, glukozu, urea N, urat i bilirubin• Uticaj krvnih grupa za nekoliko parametara: alfa-1-

antitripsin, holesterol i ALP i pubertet

• Uticaj godina• Novoroñenče• Detinjstvo • Odraslo doba• Starost 33

Uticaj godina na enzime

Novoroñenče• Vrednosti reflektuju traumu roñenja i promene vezane za adaptaciju bebe na

nezavisnu egzistenciju.• Sastav krvi zavisi od zrelosti pri roñenju• Posle roñenja

– Porast proteina– Visoka aktivnost enzima CK, AST i LD

Detinjstvo do puberteta• ALT porast• ALP visoke vrednosti pri roñenju, pa pad u detinjstvu i porast u pubertetu• Porast GGT u pubertetu 4x veće

34

Promene aktivnosti enzima ALP sa godinama

35

Uticaj godina na enzime

Odrasli• Vrednosti su konstantne izmeñu puberteta i menopauze kod

žene• Izmeñu puberteta i srednjeg doba kod muškaraca

• Starost• Efekat menopauze• Porast mnogih parametara• ALP se povećava kod žena i obično je aktivnost viša nego kod

muškaraca.• Promene u hormonima• Tiroksin, parathormon• Estrogen se snižava i pre menopauze (i do 70%)

36

37

Uticaj godina na aktivnosti serumskih enzima

38

Promene aktivnosti izoenzima alkalne fosfatazesa godinama

Uticaj pola

• Do puberteta mala razlika u polovima• Posle puberteta aktivnost ALT, AST, CK i aldolaza su

veći kod muškaraca• Veće aktivnosti su posledica veće mišićne mase• Posle menopauze viša je aktivnost ALP kod žena• LD-1 i LD-3 su viši, a LD-2 niži kod mladih žena

39

Uticaj menopauze

40

Uticaj rase

• Aktivnost CK i LD viša kod crnaca i m i ž• Uticaj mišićne mase• Više vrednosti ALP kod crne dece u pubertetu zbog

rasta skeleta• Više vrednosti GGT kod crnaca

41

Uticaji okoline

• Nadmorska visina• Temperatura• Mesto stanovanja

42

Ciklične promene

• Sezonski uticaji• Uticaj menstrualnog ciklusa

43

44

Ciklične promeneSezonske varijacije

Medicinska stanja

• Gojaznost• Slepilo• Trudnoća• Stres• Groznica• Šok i trauma• Transfuzuija i infuzija

45

• Porast CK (posebno CK-BB) kod trudnica• Etinilestradiol- indukcija ALP i GGT

Trudnoća i kontraceptivi

46

47

Šok i traumaHirurška inervencija

Aktivnost ostaje povišena nekoliko dana

Transfuzija i infuzija

48

Transfuzija može da poveća aktivnost1. Enzima LD

izoenzima LD-1 i LD-2zbog razgradnje eritrocita

2. Infuzija albumina povećava ALPplacentarno poreklo albumina

49

Biološka varijabilnost

50