Upload
uniappuntistore.adm
View
21
Download
1
Tags:
Embed Size (px)
DESCRIPTION
appunti
Citation preview
Metodologie Cellulari Dott.ssa Valeria Crippa
UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO
1
INDICE 1. Le colture cellulari ..................................................................................................................................... 4
1.1 La storia delle colture cellulari ......................................................................................................... 4
1.2 Vantaggi e svantaggi delle colture cellulari ..................................................................................... 5
1.3 Fonti cellulari ..................................................................................................................................... 6
1.4 Substrati per colture cellulari ........................................................................................................... 7
1.5 Morfologia delle cellule di mammifero............................................................................................ 8
1.6 Principali tipi di colture cellulari ....................................................................................................... 9
1.7 Colture primarie e linee cellulari .................................................................................................... 17
1.8 Le cellule staminali .......................................................................................................................... 18
2. Mantenimento di una coltura cellulare. ................................................................................................ 21
2.1 Ciclo o curva di crescita. ................................................................................................................. 21
2.2 Mantenimento della vitalità di una coltura cellulare. ................................................................... 23
2.3 Terreni per le colture cellulari. ....................................................................................................... 29
2.4 Conservazione delle cellule in azoto liquido .................................................................................. 33
3. Laboratorio per colture cellulari. ........................................................................................................... 35
3.1 Sterilità e contaminazione. ............................................................................................................. 35
3.2 Classificazione degli agenti biologici .............................................................................................. 36
3.3 Attrezzature necessarie per colture cellulari. ................................................................................ 36
3.4 Cura e mantenimento del laboratorio ........................................................................................... 43
3.5 Aspetti di sicurezza delle colture cellulari ...................................................................................... 43
3.6 Sterilizzazione del materiale per le colture cellulari ...................................................................... 43
3.7 Contaminazioni delle colture cellulari ........................................................................................... 46
4. Colture batteriche ................................................................................................................................... 48
4.1 Utilizzo di colture di batteri in biologia molecolare ...................................................................... 48
4.2 Crescita dei batteri .......................................................................................................................... 49
4.3 Colture batteriche solide e liquide ................................................................................................. 50
4.4 Conservazione dei batteri ............................................................................................................... 51
4.5 Trasformazione dei batteri ............................................................................................................. 51
4.6 Amplificazione dei batteri .............................................................................................................. 53
4.7 Estrazione del DNA plasmidico dai batteri..................................................................................... 53
4.8 Ceppi batterici: E.coli TOP 10 ......................................................................................................... 54
5. Vettori batterici ....................................................................................................................................... 55
5.1 Vettori plasmidici per batteri (o plasmidi) ..................................................................................... 55
5.2 Batteriofagi ..................................................................................................................................... 62
5.3 Cosmidi ............................................................................................................................................ 65
2
5.4 Vettori e dimensioni degli inserti clonabili .................................................................................... 67
5.5 Laboratorio per i batteri ................................................................................................................. 67
6. La trasfezione: vettori virali e non virali ............................................................................................... 68
6.1 Sistemi di trasferimento genico (trasduzione)............................................................................... 68
6.2 Ottimizzazione del processo ........................................................................................................... 68
6.3 Fattori che influenzano la trasfezione ............................................................................................ 69
6.4 Metodi di Trasfezione ..................................................................................................................... 69
6.5 Il cargo ............................................................................................................................................. 70
6.6 I vettori ............................................................................................................................................ 74
6.7 Lavorare con i virus ......................................................................................................................... 99
6.8 Tipo di trasfezione: transiente o stabile? .................................................................................... 100
6.9 Sistemi inducibili ........................................................................................................................... 102
6.10 Scopo della trasfezione ............................................................................................................. 108
7. Tecnologie di editing del genoma ........................................................................................................ 112
7.1 Modifiche genomiche ................................................................................................................... 112
8. Tecniche di microscopia a fluorescenza ............................................................................................... 120
8.1 Luminescenza ................................................................................................................................ 120
8.2 Fluorescenza .................................................................................................................................. 120
8.3 Proteine fluorescenti .................................................................................................................... 122
8.4 Microscopio a fluorescenza. ......................................................................................................... 123
8.5 Applicazioni della fluorescenza in biologia cellulare ................................................................... 126
8.6 Applicazioni della fluorescenza .................................................................................................... 131
9. SAGGI SULLE COLTURE CELLULARI ....................................................................................................... 136
9.1 Saggi di vitalità cellulare ............................................................................................................... 136
9.2 Tecniche per lo studio della genesi tumorale. ............................................................................. 138
10. La Citofluorimetria ............................................................................................................................ 141
10.1 Citofluorimetro ......................................................................................................................... 141
10.2 Analisi dei dati ........................................................................................................................... 149
10.3 Controlli ..................................................................................................................................... 152
10.4 Applicazioni ............................................................................................................................... 153
3
4
1. Le colture cellulari
Sono sistemi artificiali in cui cellule isolate dal loro ambiente, libere od organizzate in tessuti od
organi, messe in condizioni di vivere all’interno di un sistema definito, nel quale continuano a svolgere
le loro funzioni specifiche e si accrescono per un tempo limitato oppure indefinitamente. Le colture
cellulari vengono anche definiti sistemi di cellule disperse che rappresentano il grado estremo di
dissociazione di un organismo multicellulare.
1.1 La storia delle colture cellulari
La storia delle colture cellulari è relativamente recente e rappresenta la storia dello sviluppo delle
tecniche di coltura in vitro. Agli inizi del secolo XX ebbero inizio i primi studi riguardanti l’ambiente
cellulare; e numerosi ricercatori tentarono di isolare cellule dagli organismi e di mantenere vitali in
coltura frammenti di tessuto, riuscendo anche, in alcuni casi, ad effettuare esperimenti di breve
durata. Dunque, si iniziò ad ipotizzare che le cellule viventi fossero capaci di vivere in modo
autonomo. Tuttavia però, tale supposizione non condusse ad effetti pratici nel campo della biologia
sperimentale e bisognava attendere l'inizio del ventesimo secolo per i primi esperimenti riguardanti
gli studi sull'ambiente cellulare. Infatti, all'inizio del XX secolo, diversi ricercatori tentarono di isolare
gruppi di cellule degli organismi e di mantenere tali cellule vive riuscendo, anche in alcuni casi, ad
effettuare degli esperimenti di breve durata. Nel 1885 Wilhelm Roux riuscì a portare a termine i primi
esperimenti di espianto mantenendo il cervello di un embrione di pollo in una soluzione salina calda
per alcuni giorni; in questo modo si dimostrava che, le cellule di embrione di pollo, al di fuori
dell'animale, potevano sopravvivere per un certo periodo di tempo. Nel 1907 fu la volta del biologo
statunitense Ross G. Harrison, che condusse i primi esperimenti su colture di cellule animali,
utilizzando dei campioni di midollo spinale di anfibio. La scelta di questo sistema era basata sul fatto
che i tessuti animali a sangue freddo non necessitavano di un mantenimento a temperature diverse
da quelle della temperatura ambiente; e quindi, fu effettuata per la prima volta, una coltura in vitro
di frammenti di tessuto coltivando il midollo spinale di rana su un substrato biologico rappresentato
da un coagulo di linfa. Tale sperimentazione permise al biologo di dimostrare che le fibre nervose
(assoni) non erano altro che prolungamenti (o estensioni) delle singole cellule nervose. Questi
esperimenti possono essere considerati una pietra miliare nello studio del sistema nervoso in vitro;
infatti, grazie anche allo sviluppo di successive tecniche di cultura, è stato possibile ricreare in vitro
delle reti neurali che vengono utilizzate come modello di studio per analizzare i processi di
autorizzazione del sistema nervoso. Nel 1909 Francis Peyton Rous, medico virologo statunitense,
dimostrava la possibilità di mantenere in vita in una soluzione salina cellule d’embrione di pollo; e
scopriva anche che nei polli il sarcoma poteva essere indotto non solo trapiantando delle cellule
tumorali ma anche iniettando un filtrato di tali cellule. Più tardi fu provato che tale filtrato conteneva
un agente microscopico infettivo estratto dalle cellule stesse, un RNA-virus denominato in seguito
virus del sarcoma di Rous. Questa scoperta fu molto importante perché diede vita alla teoria
dell'origine virale dei tumori valse a Raus il premio Nobel. Nel 1913 il chirurgo e biologo francese
5
Alexis Carrel diede notevoli contributi alla tecnica di coltivazione delle cellule in vitro, perché riuscì a
mantenere delle porzioni di tessuto di dimensione di circa 1-2 mm di diametro in specifici terreni di
coltura, in condizioni asettiche e soprattutto in condizioni osmotiche e termiche il più possibile simili
a quelle fisiologiche. Si svilupparono così le prime tecniche per la propagazione in serie di diversi tipi
di cellule, dimostrando che era assolutamente possibile la crescita ed il mantenimento di cellule in
coltura in un mezzo necessariamente asettico. Nel 1943 W.R. Earle riuscì ad ottenere le prime linee
continue di cellule di mammifero; questo fu un passo molto importante per lo sviluppo delle colture
cellulari in vitro. Molto importante fu anche la scoperta condotta nel 1951 da George Otto Gey, il
quale riuscì per la prima volta ad isolare, mettere in coltura e pagare una linea cellulare di origine
tumorale umana. In questo modo realizzava la prima linea cellulare in cultura continua, cioè una linea
cellule che era in grado di propagarsi in maniera indefinita. Tale linea cellulare prese il nome di linea
cellulare HeLa dal nome della paziente dalla quale fu espiantato il tumore. Negli stessi anni, Rita Levi
Montalcini, conduceva esperimenti fondamentali che la portarono alla scoperta della presenza di un
fattore di crescita molto importante per le cellule del sistema nervoso, ovvero il cosiddetto NGF
(Nerve Growth Factor). Harry Eagle, nel 1955, compì la prima indagine sistematica sugli elementi
nutritivi essenziali, necessari affinché una coltura cellulare possa essere mantenuta. e iniziò così a
formulare in primi terreni per colture cellulari. L’utilizzo delle colture cellulari nel campo della ricerca,
con il tuo punto di partenza effettiva nella metà del secolo scorso, negli ultimi anni è diventato pratica
comune grazie anche al miglioramento delle tecnologie, delle tecniche di sterilità e allo sviluppo di
terreni di cultura sempre più specifici e complessi. Grazie a questi fattori favorevoli, le colture cellulari
hanno avuto uno sviluppo rapidissimo che ha avuto ricadute applicative in moltissimi campi della
biologia e della medicina, permettendo una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e
molecolari con il vantaggio di un minore ricorso alla sperimentazione in vivo. Per colture cellulari si
intendono, gruppi di cellule che vengono coltivate in condizioni controllate al di fuori del loro
ambiente naturale. Tali metodologie possono costituire un ottimo modello di studio per diverse
applicazioni della biologia cellulare e molecolare, della genetica, dell’oncologia, della ricerca di base
fino ad arrivare alle applicazioni per la ricerca di nuove strategie terapeutiche per diverse patologie.
1.2 Vantaggi e svantaggi delle colture cellulari
VANTAGGI. Un grossissimo vantaggio delle colture cellulari è legato al fatto che si riduce
l'utilizzo di animali per la sperimentazione in vivo. Quindi l'utilizzo di colture cellulari riduce o
addirittura, in alcuni casi, limita il sacrificio di animali vivi. I vantaggi delle colture cellulari sono diversi,
il principale vantaggio è quello di costituire un abbondante e omogeneo materiale di studio poiché
queste possono essere propagate. Un altro grossissimo vantaggio è legato al fatto che le colture
cellulari possono essere congelate e recuperate anche a distanza di anni. Un altro importante
vantaggio dall’utilizzo di una coltura cellulare è dato dalla facilità di controllo delle condizioni di
crescita di queste cellule, che possono essere modulate a piacimento; infatti si può interferire con il
pH, la temperatura, l’osmolarità, i nutrienti. Quindi le condizioni di crescita sono facilmente
controllabili dall'operatore. Le colture cellulari sono molto più economiche rispetto a quelle in vivo e
consentono di ottenere una risposta nell’arco di poco tempo, a volte ore o pochi giorni, cosa che
difficilmente si ottiene con un modello in vivo. Un altro grande vantaggio è che è possibile acquistare
6
delle colture cellulari, in quanto esistono delle banche pubbliche di linee cellulari, e questo garantisce
l’omogeneità e la riproducibilità degli esperimenti. Nel corso degli ultimi anni, le colture cellulari,
possono essere facilmente robotizzate e, ovviamente anche in questo caso, si ha un guadagno in
termini di tempo e di riproducibilità degli esperimenti.
SVANTAGGI. Sicuramente lo svantaggio principale è che la coltura cellulare è diversa dalla
situazione in vivo, perché è necessario considerare che nel momento in cui si fa una cultura di cellule
disperse si vanno a perdere tutte quelle informazioni che derivano dal fatto che una cellula,
normalmente nell'animale, e integrata all'interno del tessuto ed è capace di interagire con le cellule
vicine che spesso sono dello stesso tipo; ma al contempo, il tessuto stesso è integrato all’interno di
un organo e ciò garantisce anche l’interazione tra cellule differenti tra loro. Questo ci fa comprendere
come nella situazione in vitro si avrà sicuramente la perdita dei rapporti tridimensionali, la perdita
dell'integrazione tra cellule diverse e di conseguenza si potrebbero ottenere delle risposte diverse
rispetto a quelle che si potrebbero ottenere nell’animale. Un altro problema scaturisce dal fatto che,
nel momento in cui si va a sviluppare una linea cellulare in vitro, molto spesso per poter mantenere
questa linea del tempo e avere materiale abbondante per lo studio è necessario trasformare queste
cellule in cellule e che sono in grado di crescere e duplicarsi in maniera indefinita nel tempo, e quindi
capaci di acquisire delle caratteristiche simili a quelle delle cellule tumorali. Come ben noto, le cellule
tumorali sviluppano delle caratteristiche completamente diverse rispetto alla cellula di partenza per
quanto riguarda l’aspetto metabolico caratteristico ovviamente della durata del ciclo cellulare
piuttosto che il ciclo cellulare stesso; dunque anche in questo caso i risultati che possiamo ottenere
potrebbero essere diversi rispetto a quelli ottenuti dalle stesse cellule quando queste vengono
studiate all'interno di un organismo vivente. Un ultimo svantaggio è dato dalla facilità di conta-
minazione di una coltura cellulare da altri tipi cellulari o da microrganismi, quali per esempio batteri
e virus, che anche in questo caso la presenza di un agente contaminante può andare ad alterare il
metabolismo cellulare.
1.3 Fonti cellulari
La maggiore fonte di approvvigionamento delle colture cellulari sono le banche cellulari, presso le
quali le colture cellulari vengono generate, stabilizzate, studiate, amplificate e distribuite ai laboratori
interessati. Le fonti di provenienza sono tre:
1. Banche cellulari. La principale banca cellulare è la ATCC (American TypeCulture Collection) in
USA; ma oltre a questa possiamo distinguere la corrispettiva tedesca, ovvero la DSMZ
DeutscheSammlungvon Mikroorganismenund Zellkulture (German Collection of Micro-
organismsand Cell Cultures), la ECACC (EuropeanCollection of AnimalCell Culture) in UK e la
corrispettiva giapponese, la JCRB (JapaneseCollection of ResearchBioresources). I vantaggi
dell’ottenere delle linee cellulari direttamente dalle banche cellulari sono molteplici:
a. sono di facile acquisizione;
b. ne viene garantita l’assenza di contaminanti (contaminant–free);
c. vengono vendute con documentazione dettagliata che comprende il certificato di garan-
zia e tutte le informazioni necessarie e utili alla loro coltivazione; ovvero, tale certificato
informa nel dettaglio sul tipo di cellula, la sua origine, il terreno di coltura da utilizzare per
7
la crescita e per il congelamento, le caratteristiche di crescita, la morfologia, il numero dei
passaggi in coltura ed il cariotipo.
2. Altri laboratori. In alcuni casi si può ottenere una linea cellulare da un altro laboratorio
attraverso particolari accordi;
3. Animali. Molto spesso è possibile ottenere tali linee cellulari direttamente a partire da animali.
Bisogna tener presente che tutte le linee cellulari, anche quelle che vengono acquistate in
banche cellulari, hanno origine a partire da animali e in alcuni casi da biopsie umane. Quindi
gli animali sono la fonte principale per la generazione delle culture cellulari, ottenibili attra-
verso due differenti procedure:
a. separazione delle stesse da fluidi biologici come il sangue a seguito di un prelievo ematico
sull’animale;
b. oppure, attraverso l’asportazione (espianto) di un organo o tessuto e successiva disso-
ciazione dei frammenti multicellulari che, mediante trattamento con agenti enzimatici o
chimici, sono ridotti ad una popolazione di singole cellule.
La sospensione cellulare così ottenuta viene messa in “coltura”, cioè trasferita in contenitori
appositi contenenti miscele di sostanze inorganiche ed organiche necessarie al sostenta-
mento delle cellule. Tutte queste sostanze, nel loro insieme, fanno parte di quello che viene
chiamato terreno di crescita.
1.4 Substrati per colture cellulari
Il primo substrato è stato il vetro. Tuttavia, non tutte le cellule sono in grado di aderire al vetro (o alle
plastiche); infatti quelle che non aderiscono spontaneamente richiedono l’utilizzo di sostanze che,
rivestendo la superficie in vetro, ne permettono l’adesione. Tra le più usate possiamo trovare:
1. Collagene;
2. Polilisina;
3. Poliornitina;
4. Laminina;
5. Matrigel.
Tutte queste sostanze costituiscono la matrice extra cellulare sono responsabili della formazione di
questa rete proteica che viene sfruttata dalle integrine di membrana per poter aderire. Ovviamente
esistono dei fattori di adesione differenti e specifici per le diverse linee cellulari. Infatti, vi sono diversi
tipi di collagene a seconda del tipo cellulare che si vuole far crescere:
a. Collagene di tipo I, utile per il muscolo, gli epatociti, le cellule del ganglio spinale, le cellule di
Schwann;
b. Collagene di tipo II, utile per i condrociti;
c. Collagene di tipo IV, utilizzato per le Cellule endoteliali, epiteliali, muscolari, e nervose.
Tra tutti il fattore di adesione polilisina, insieme alla laminina, è quello più utilizzato e che può essere
condivisa per diversi tipi cellulari.
Il matrigel, è un substrato particolare di recente formulazione sviluppato per alcuni tipi di colture
cellulari, in particolar modo per le cellule staminali e per quelle pluripotenti indotte. È di origine
biologica che si ottiene a partire da una linea cellulare tumorale, nello specifico cellule di sarcoma di
8
topo particolarmente ricche in proteine della matrice extracellulare, che possono essere quindi
recuperate e rese disponibili per la coltura di altre cellule. La composizione del matrigel (come tutti
tipi di matrici di origine biologica) è variabile da lotto a lotto. Per questo motivo che la composizione
è indicata come approssimativa: laminina per circa il 60%, collagene circa il 30%, entactina circa l’8%
e fattori di crescita e metalloproteine circa il 2%. In maniera generale, quando si utilizza un terreno,
una matrice o un siero di natura biologica, cambiando il lotto, è assolutamente necessario testare
nuovamente le condizioni di crescita per assicurarsi che le condizioni stabilite con il lotto precedente
siano valide anche con il nuovo lotto.
Oggi, la maggior parte delle colture in adesione vengono cresciute non su vetro ma su plastica, ma-
teriale più economico e facile da produrre nonostante sia molto più inquinante rispetto al vetro
stesso. Esistono due tipologie di plastica per colture cellulari:
1. Substrato in plastica non trattato, utilizzato per le cellule in sospensione;
2. Substrato in plastica trattato, al fine di favorire la crescita delle cellule in adesione.
L’aspetto dei due tipi di contenitori in plastica è esattamente identico, per cui è strettamente neces-
sario che l’operatore controlli le specifiche di acquisto indicate sulla confezione prima del loro utilizzo.
È importante tener presente che le piastre per colture batteriche possono essere usate per colture
cellulari in sospensione ma non per colture cellulari aderenti.
In cosa consiste il trattamento della plastica per renderla adatta ad una coltura cellulare in adesione?
Le piastre per colture cellulari aderenti sono composte da un materiale plastico in polistirene; il
trattamento che si utilizza fa sì da renderle più idrofile e cariche negativamente. In tal modo il
polistirene lega stabilmente la fibronectina e la vitronectina presenti nel siero che permettono l’ade-
sione di diversi tipi di cellule.
Tra i vari contenitori che vengono molto spesso adoperati si possono distinguere:
1. Flasks, ovvero dei contenitori a forma di bottiglia, utilizzate solitamente per mantenere la
linea cellulare e per amplificarla (a causa della loro ampia superficie di crescita rispetto agli
altri due tipi di contenitori. La chiusura ermetica tramite il tappo ne facilita il trasporto e lo
spostamento di questi contenitori.
2. Multi Well-plates, contenitori multi-pozzetto; questo formato di contenitore è spesso scelto
nel momento in cui bisogna effettuare un esperimento in diversi replicati su una determinata
linea cellulare.
3. Dishes, dischetti che presentano un diametro variabile.
1.5 Morfologia delle cellule di mammifero
Le colture cellulari vanno regolarmente osservate per esaminare la loro morfologia. Questo serve per
capire lo stato di salute della coltura cellulare e osservare eventuali contaminazioni. Dal punto di vista
morfologico le cellule di mammifero animale possono essere classificate in quattro tipologie:
1. Fibroblasti. Sono cellule bipolari o multipolari, hanno forma allungata e crescono adese al
substrato.
2. Epiteliale. Le cellule hanno una forma poligonale e dimensioni regolari. Crescono adese al
substrato in isole.
3. Linfoblastoide. Le cellule hanno forma sferica e solitamente crescono in sospensione.
9
4. Endoteliale. Sono cellule appiattite, con un nucleo centrale. Hanno uno spessore di 1-2 µm e
diametro di 10-20 µm.
Inoltre vi può essere una quinta categoria: 5. Neuronale. Possono avere forma e dimensioni differenti. Sono dotati di un corpo cellulare
molto grande da cui dipartono estroflessioni corte, chiamate dendriti (o assoni nel caso dei motoneuroni). Vengono classificati in: a. Neuroni di tipo I, caratterizzati da lunghi assoni; b. Neuroni di tipo II, caratterizzati da un corpo privo di assoni (solamente dendriti).
1.6 Principali tipi di colture cellulari
Distinguiamo due tipi principali di cultura cellulare:
1. Colture di microrganismi.
2. Colture di cellule e di tessuti animali. Queste colture possono essere distinti in tre tipi di
colture cellulari:
a. Colture cellulari primarie;
b. Colture cellulari secondarie;
c. Linee cellulari.
COLTURE CELLULARI PRIMARIE. Definiamo primaria una coltura cellulare che viene generata
direttamente isolando le cellule a partire da un tessuto o un organo di un animale.
Il vantaggio principale è dato dal fatto che le cellule che si ottengono direttamente a partire dall’ani-
male per disgregazione di un tessuto o di un organo, hanno caratteristiche biochimiche e metaboliche
molto simili a quelle delle cellule in vivo, se non identiche. Lo svantaggio principale che si riscontra
nell’utilizzo di colture cellulari primarie è dovuto al fatto che tali cellule presentano una durata di vita
limitata, e di conseguenza possono essere mantenute in coltura per un tempo ridotto. Le colture
cellulari primarie possono essere distinte in tre grandi categorie:
1. colture d’organo. Consiste nell’espianto di un organo o parte di un organo e successiva-
mente mantenuto in coltura. Sono essenzialmente delle colture a breve termine (con una
durata che va a alcuni giorni a poche settimane dopo l’espianto). Sono delle colture che
vengono scelte e utilizzate quando è necessario effettuare degli studi di morfologia, di dif-
ferenziamento e di fisiologia; ovvero quando più generalmente è importante studiare le varie
interazioni tra le diverse cellule che costituiscono un organo. Questo è possibile perché
affinché l’organo mantenga inalterato il rapporto tra le sue cellule costituenti. Solitamente
viene espiantato l’organo nella sua totalità quando si lavora con gli embrioni, oppure porzioni
d’organo se queste vengono espiantate da animali adulti. Il problema principale delle culture
d'organo è dovuto al fatto che, poiché viene coltivato un tessuto tridimensionale prelevato
dal suo normale ambiente di crescita, nel momento in cui viene estratto, la rete vascolare che
lo irrora viene meno, e di conseguenza la parte più interna di tale organo tende a fenomeni
necrotizzanti, a seguito della mancanza di ossigeno e materiale nutritizio. Quindi, le limitazioni
principali riguardano le dimensioni, in quanto l’organo che viene espiantato e mantenuto in
coltura non deve avere dimensioni superiori al millimetro cubo. L'organo viene prelevato
dall'animale, e qualora di parta da un animale adulto è necessario sezionare l’organo con uno
strumento apposito, il vibratomo, in modo tale da ottenere delle porzioni d’organo che
10
rispettino le caratteristiche sopra citate, ovvero che siano sufficientemente piccole da
consentire l’interscambio di nutrienti e materiale gassoso anche nelle parti più interne
dell’organo. Ovviamente se si parte da un organo ottenuto da un embrione o da un feto
animale, questo sarà più piccolo e facilmente coltivabile nella sua totalità (senza necessità di
sezione). Una volta espiantato, l’organo viene coltivato in opportuni contenitori che permet-
tono uno scambio gassoso sufficiente (ci deve essere un grande spazio d'aria per permettere
la corretta ossigenazione e lo scambio di CO2 a tutte le cellule che costituiscono l’organo
stesso). Il mezzo di coltura nel quale l’organo viene immerso deve essere necessariamente di
natura liquida o semisolido.
2. colture di frammenti di tessuto. Una piccola porzione di tessuto viene mantenuta in coltura,
general-mente amplificata. Le colture di frammenti di tessuto consentono di ottenere delle
cellule isolate e senza che sia necessario disgregare il tessuto questo è un vantaggio rispetto
all’ottenimento di colture primarie di cellule disperse perché le procedure che sono
necessarie per disgregare le cellule da un tessuto spesso sono dannose per le cellule stesse;
e quindi in alcuni casi, durante il processo di disgregazione, si assiste a fenomeni di
immortalità cellulare. La coltura diretta di un frammento di tessuto, invece, riduce tale
fenomeno. Vengono effettuate sezioni molto piccole di tessuto, e successivamente poste in
contenitori opportuni per colture cellulari (in presenza ovviamente di un terreno di crescita).
Tali sezioni di tessuto tenderanno ad aderire al substrato che gli viene fornito, e le cellule
costituenti il tessuto cominciano, dopo qualche giorno, a duplicarsi tutto intorno al
frammento in modo da ricoprire il substrato (alone di cellule). Se il frammento di tessuto viene
spostato in diversi punti della superficie del substrato, alla fine come risultato, si ottiene un
monostrato di cellule che origina dal tessuto di partenza.
3. colture di cellule disperse. Sono la tipologia di colture primarie più utilizzate. Nel caso
specifico, tali cellule vengono disaggregate in modo da formare un singolo strato che può
crescere in adesione su un altro substrato. Ad esempio possono essere ottenuti dal sangue
(in questo caso otterremo delle colture di linfociti, o macrofagi), si possono ottenere dei
neuroni (se partiamo dal tessuto nervoso) degli epatociti (attraverso il tessuto epatico) e così
via. Per poter ottenere una coltura di cellule disperse è necessario disgregare l’espianto di
tessuto (o di organo); seppur necessario, molto spesso, il processo di disgregazione porta alle
morte di alcune delle cellule originariamente presenti all'interno del tessuto e, ovviamente,
alla selezione delle cellule che sono in grado di sopravvivere e che daranno origine alla cultura
primaria vera e propria. Esistono due metodi di colture cellulari, a seconda che le cellule
interessate per la coltivazione crescano normalmente in adesione o in sospensione.
a. Colture in sospensione. Le cellule che crescono in sospensione possono crescere in un
mezzo normalmente liquido, (come ad esempio le cellule del sangue, alcuni tipi di cellule
trasformate o tumorali) senza aderire ad un substrato; mentre quasi tutte le altre cellule
sono cellule che necessitano di un substrato su cui aderire per poter crescere. Tali cellule,
nel momento in cui si origina la coltura primaria, possono essere mantenute in contenitori
(flask) non trattati allo scopo di aumentare l’adesione al substrato (adesione sfavorita), e
che necessitano di volumi di terreno di coltura elevati in modi da garantire una grande
superficie di scambio sufficiente alla crescita. Solitamente le colture in sospensione
11
vengono tenute in agitazione su piastre magnetiche o su flask rotanti, per favorire tale
scambio in maniera perfettamente omogenea. Attraverso una visione al microscopio a
diversi ingrandimenti, è possibile osservare che, le cellule in sospensione presentano una
morfologia tondeggiante dovuta, per l’appunto, alla mancata adesione al substrato.
b. Colture in adesione. La maggior parte delle cellule dei vertebrati (ad eccezione di quelle
ematopoietiche) necessita di adesione ad un substrato per poter crescere (ancoraggio-
dipendenti). Tali cellule, solitamente, crescono formando una monostratificazione in due
dimensioni (2D). L'adesione di una cellula ad un substrato coinvolge le proteine della
membrana plasmatica, in particolar modo dei recettori che prendono il nome di integrine
i quali sono in grado, normalmente, di aderire con le proteine della matrice extracellulare.
Quindi, la crescita della maggior parte dei tipi cellulari dipende dalla presenza nel terreno
di crescita, e ovviamente anche sul substrato di crescita, di fattori di adesione che possono
essere sfruttati dai recettori di membrana (integrine) per poter aderire con il terreno di
crescita presente sulla piastra di coltura. La maggior parte delle cellule richiedono un certo
periodo di tempo per sintetizzare la matrice cellulare, quindi per favorire una coltura per
adesione vengono forniti dei fattori di adesione esogeni (che molto spesso sono presenti
all’interno del siero che viene addizionato al terreno di crescita). Da una visione al miscro-
scopio ottico, le cellule che crescono in adesione, si presentano con una morfologia ben
distinguibile.
Vantaggi e svantaggi delle colture in adesione. Le colture in adesione per via della loro mor-
fologia ben definita presentano tre grossi vantaggi, ovvero:
a. permettono di valutare in maniera molto rapida l’effetto che un determinato trattamento
può avere sulle cellule stesse in termini di modifiche morfologiche. Questa valutazione
infatti, risulta molto più complessa per le cellule che crescono in sospensione
b. sono facilmente manipolabili, perché per poter sostituire il terreno quando questo è stato
consumato è sufficiente aspirarlo e aggiungere un terreno fresco; mentre per le colture
in sospensione è necessario effettuare operazioni di separazione delle cellule dal terreno
che prevede l’utilizzo di centrifughe.
c. Rendono possibili le metodiche di colorazione, quindi metodiche citochimiche e immuno-
istochimiche direttamente sul supporto di crescita.
Il più importante svantaggio è legato alla superficie di crescita correlata alla quantità di cellule
necessarie (possibilità di utilizzo di microcarriers).
Vantaggi e svantaggi delle colture in sospensione. Le colture in sospensione presentano due
importanti vantaggi:
a. L’accrescimento di altre cellule all’interno dello stesso contenitore è direttamente pro-
porzionale al volume occupato;
b. Ridotte manipolazioni per l’utilizzo sperimentale.
Gli svantaggi invece sono direttamente correlati alle colture in adesione e riguardano l‘accre-
scimento per monostratificazione.
Come si realizza una coltura primaria in vitro. Per poter realizzare una coltura primaria in
vitro si deve partire da un animale vivo o da una biopsia umana. E’ assolutamente necessario avere
una licenza per l’ottenimento e l’utilizzo di cellule primarie, approvata da un comitato etico.
12
Attualmente esistono, sia a livello industriale sia anche a livello universitario, delle facilities dedicate
nei centri di ricerca per ottimizzare i costi (es. da un animale sacrificato cercare di ottenere più di un
solo tipo cellulare).
Fonti del materiale da coltura. Se si parte da un animale, si può scegliere di partire da un animale
adulto piuttosto che da un embrione e viceversa. Ovviamente, tessuti di partenza diversi avranno una
capacità proliferativa differente; ad esempio partendo da una cellula uovo, i tessuti presenti al suo
interno hanno una capacità proliferativa maggiore rispetto ai tessuti ottenuti da un embrione o da
un tessuto adulto (molti dei tessuti adulti presentano scarsa attività proliferativa per via della
presenza di una quantità maggiore di assetti cellulari già specializzati e che hanno perso tale capacità
proliferativa). È necessario capire se le cellule che si vogliono coltivare provengono a un tessuto o da
un organo, oppure se si trovano libere nel fluido biologico; e, a seconda se queste provengono da un
tessuto o da un fluido biologico, la tecnica di isolamento è differente. Nel momento in cui si vuole
generare una coltura cellulare di provenienza animale, è necessario fisare uno start-point che parta
o dall’embrione o dal tessuto adulto. Durante la scelta dello start-point, bisogna tener presente che
i tessuti adulti, oltre ad essere poco proliferativi, sono anche più difficili da disgregare e possiedono
una matrice extracellulare più strutturata. Inoltre, riguardo ai tessuti embrionali, anche se questi sono
caratterizzati da elevata attività proliferativa e presentano una resa più alta aderendo meglio al
substrato e, di conseguenza, sono più facili da mantenere in vita. Pero, non è detto che queste ultime,
se introdotte in una coltura in vitro, vadano con certezza ad assumere caratteristiche della linea
cellulare differenziata presa come oggetto di studio. Un’altra domanda che bisogna porsi quando si
va a generare una coltura cellulare riguarda lo start-point sano o malato, o meglio: si vuole partire da
un tessuto sano o tumorale? Se si parte da tessuti tumorali, questi danno vita a linee cellulari continue
con una durata di vita illimitata (ciò determina una maggiore disponibilità del materiale cellulare di
studio). Di contro, i tessuti sani danno vita a colture cellulari primarie che sono colture con una durata
di vita limitata. Però, come detto precedentemente, una cellula tumorale può avere delle caratteristi-
che metaboliche e proliferative molto diverse dalla cellula tumorale di partenza da cui si è generata.
Ottenimento di cellule primarie. A seguito dell’ottenimento dell’autorizzazione da parte del comitato
etico si procede con l’espianto.
1. Inizialmente l’animale viene profondamente anestetizzato, e di seguito sacrificato seguendo
le indicazioni del comitato etico.
2. Successivamente viene asportato un tessuto o un organo e dissezionato meccanicamente
(sminuzzato con l’utilizzo di un bisturi per disgregare le cellule che lo compongono).
3. Il tessuto disgregato viene posto a contatto con degli agenti enzimatici con azione degradativa
nei confronti della matrice extracellulare. Tra questi il più utilizzato è la tripsina, che attacca
le proteine della matrice cellulare interrompendo i legami adesivi cellula-cellula o cellula-
substrato.
4. Attraverso l’aggiunta di un inibitore al siero, viene bloccata la digestione enzimatica che
potrebbe progredire fino alle proteine della membrana plasmatica e danneggiare la cellula
stessa e le sue funzionalità.
5. Terminata la fase di separazione delle cellule, a seguito di una valutazione attraverso conta
cellulare, queste possono essere seminate (petri/flask/multiwell) o, in alcuni casi, mantenute
in sospensione.
13
Generalmente quando si vuole ottenere una linea cellulare primaria a partire da un tessuto o da un
organo, o da un fluido biologico è necessario ricordare alcune regole generali:
1. il grasso e il tessuto necrotico vanno eliminati attraverso l’utilizzo di un bisturi. Questa
operazione va effettuata con strumenti adatti, cercando di limitare i danni. Operazione da
fare sotto uno stereomicroscopio (cappa flusso orizzontale);
2. gli enzimi usati per la disgregazione devono essere inibiti (con l’aggiunta di siero) ed eliminati
(la sospensione cellulare viene sottoposta ad una blanda centrifugazione);
3. la concentrazione delle cellule nella coltura primaria deve essere superiore a quella che
servirà nella subcoltura per via del mancato attecchimento di un variabile percentuale di
cellule (ad esempio, alcune delle cellule coltivate in partenza possono non sopravvivere alla
degradazione enzimatica, e quindi nel giro di poche ore andranno incontro a morte).
4. Usare un terreno ricco di nutrienti per favorire la ripresa e l’attecchimento delle cellule
selezionate dl tessuto.
Alla fase di dissociazione enzimatica segue una fase di separazione dei vari tipi cellulari da una sospen-
sione cellulare mista; questo avviene molto spesso quando anziché partire da un tessuto si parte da
un organo o da un fluido biologico, per cui si ottengono tanti tipi cellulari diversi che necessitano di
essere separati. La separazione può avvenire in diversi modi (sfruttando diverse tecniche):
1. Separando le cellule in base alle loro dimensioni o peso centrifugandole a bassa velocità con
l’ausilio di sostanze che creano gradienti a diversa densità (Percoll, Ficoll);
2. Sfruttando diversa attitudine ad aderire a diversi substrati utilizzando specifiche molecole di
adesione;
3. Marcando le cellule con anticorpi fluorescenti specificici (reazione di coniugazione antigene-
anticorpo) che riconoscono delle specifiche proteine di membrana; successivamente vengono
separandole con uno strumento detto FACS (fluorescence activated cell sorting) che sfrutta le
differenze in scattering della luce o di fluorescenza delle cellule (metodo applicato per
separare cellule fluorescenti in una popolazione mista);
4. Utilizzando terreni di crescita selettivi che favoriscono la crescita solo di alcuni tipi cellulari
presenti in soluzione, piuttosto che altri.
Le cellule in sospensione sono più facili da ottenere rispetto alle cellule in adesione, però hanno lo
svantaggio di veicolare con sé, all'interno del fluido biologico, anche possibili agenti patogeni; per tale
ragione devono essere manipolate con estrema cautela. Esiste la possibilità di acquistare da diverse
companies, cellule primarie in coltura o congelate. Le cellule in sospensione (sangue, spermatozoi
ecc) sono cellule differenziate, quindi essendo cellule post-mitotiche non possono essere tenute in
cultura per un tempo molto lungo; per tale motivo è molto importante, ai fini della pianificazione di
un esperimento, coordinare molto bene il timing dell’esperimento con isolamento delle cellule a
partire dal fluido biologico. Il problema del timing è importante per tutte le cellule in colture primarie,
le quali sono caratterizzate da una vita abbastanza breve. A meno che non vengano trasformate
spontaneamente in una linea cellulare, ovvero una coltura cellulare in grado di replicare in modo indefinito
nel tempo (anche definita linea continua). La vita di un cellulare non è in relazione al tempo cronologico di
cultura ma dipende dal numero delle duplicazioni cellulari a cui tale cellula va incontro. La figura 1, rappre-
senta lo sviluppo di una coltura primaria. Generalmente, quando si dà il via per una coltura primaria,
14
le cellule aderiscono al substrato e, se queste non sono in fase post-mitotica, cominciano a replicare
occupando tutto lo spazio fornito loro per la coltura.
Figura 1. Evoluzione di una coltura cellulare primaria.
Nel momento in cui queste occupano tutta la superficie, quello è effettuare un'operazione che si
chiama subcultura, cioè andare a staccare le cellule dal substrato su cui crescono e successivamente
seminarle su dei substrati nuovi. Questa operazione permette di mantenere la coltura in attività
replicativa costante. Generalmente se la coltura è di tipo primario, a seconda del tipo di cellule di
partenza (ad esempio cellule embrionali piuttosto che adulte) è possibile ottenere un numero di
divisioni cellulari variabile. Difatti, ogni cellula ha una vita biologica specifica che è determinata
sostanzialmente dal numero di duplicazioni alle quali è andata incontro, ed è legato strettamente alla
lunghezza dei suoi telomeri. Ad un certo punto, se la cellula non subisce mutazioni in geni di regolazio-
ne del ciclo cellulare, questa interrompe la sua attività proliferativa divenendo senescente e andando
incontro a morte per apoptosi (morte programmata). Però, talvolta accade che alcune cellule subi-
scono delle mutazioni spontanee nei geni di regolazione del ciclo cellulare e acquisiscano la capacità
di replicarsi in modo indefinito (linea cellulare continua).
COLTURE CELLULARI SECONDARIE. Sono le colture propagate in vitro a partire dalla coltura
primaria quando, giunta a confluenza, bisogna provvedere ad una subcoltura in un nuovo recipiente
e con terreno fresco. La sopravvivenza di una coltura può variare anche ampiamente:
1. colture a termine, la cui curva di crescita si conclude dopo un certo numero di replicazioni;
2. colture continue che crescono illimitatamente (a seguito di una generazione spontanea);
3. colture continue immortalizzate (attraverso manipolazione genetica).
COLTURA
SECONDARIA
15
Colture a breve termine. Possono essere colture secondarie che ottengono da colture primarie
che dopo un certo numero di replicazioni vanno incontro a senescenza e quindi a morte. Le colture a
breve termine direttamente originate da una coltura primaria hanno le caratteristiche più simili alle
cellule dalle quali si sono originate e rispecchiano la situazione in vivo di quest’ultime. Presentano un
corredo cromosomico diploide con lo stesso cariotipo. Sono capaci di crescere sia in adesione che in
sospensione; e, qualora crescano in adesione al substrato, risentono dell’inibizione da contatto con
le cellule adiacenti. Una coltura a breve termine non si divide in modo indefinito, ma presenta un
numero limitato di cicli cellulari; tale numero risulta inversamente proporzionale all’età dell’animale
dal quale sono stati prelevati i tessuti. Lo svantaggio principale delle colture a breve termine è legato
al numero limitato di cellule e ciò non consente una replicazione all’infinito. Un altro svantaggio è
dovuto all’isolamento che diviene complesso da effettuare ogni qualvolta si ha bisogno della coltura
cellulare, proprio perché per poter ripetere l’esperimento è necessario ripartire dalla disgregazione
del tessuto stesso. Questi limiti ed altri motivi hanno indotto i ricercatori ad isolare dei ceppi cellulari
clonali che fossero capaci di crescita illimitata: le linee cellulari continue.
Linee cellulari continue. Sono cellule rese "immortali" mediante l’inserimento di un oncogene che
fa sì che le cellule diventino tumorali; oppure spontaneamente. il vantaggio di avere una linea
cellulare continua è che questa può crescere in maniera infinita. Questo garantisce all’operatore di
disporre sempre di materiale cellulare per gli esperimenti. Tali cellule, però, presentano lo svantaggio
di non essere sempre fedeli alla realtà (in vivo) nel momento in qui queste vengono rese immortali
(simili a quelle tumorali e non più simili alla cellula di partenza); dunque è sempre necessario
riconfermare i dati di questo ottenuti in vitro con un modello in vivo. Le proprietà caratteristiche che
vengono acquisite da una coltura primaria nel momento in cui viene trasformata in una linea continua
sono le seguenti:
1. alterata morfologia cellulare, alcune delle caratteristiche, nel caso delle cellule differenziate,
vengono perse;
2. perdita dell’inibizione da contatto;
3. perdita dell’inibizione densità dipendente;
4. perdita dipendenza dall’ancoraggio;
5. modificazione del fenotipo;
6. capacità di andare incontro ad un numero illimitato di divisioni;
7. alterazioni del cariotipo;
8. acquisizione di capacità tumorigenetiche;
9. capacità di crescita in terreni semi-solidi;
10. modificazione dello stato di differenziamento.
Metodi di immortalizzazione delle cellule primarie. Le tecniche di immortalizzazione sono differenti:
1. spontanea, come le cellule HeLa che furono isolate da George Gey nel 1951 direttamente dal
carcinoma umano della cervice uterina, l’immortalizzazione di questo tipo prevede modifiche
del tutto spontanee in geni con attività regolatoria per il ciclo cellulare;
2. chimica-fisica, mediante radiazioni UV, di tipo mirata;
3. hTERT (human telomerase reverse transcriptase). Trasfezione di un plasmide codificante per
telomerasi; usato per cellule umane.
16
Si è scoperto che è possibile utilizzare delle proteine virali per indurre l’immortalizzazione cellulare.
Infatti, alcuni geni virali possono essere utilizzati per immortalizzare cellule di mammifero:
1. T antigen di Simian virus 40 (SV40), 2. Epstein Barr virus (EBV), 3. E1A and E1B di Adenovirus, 4. E6 and E7 di human Papillomavirus (HPV).
L’antigene T di SV40 è il più utilizzato. Questi geni virali immortalizzano le cellule inattivando i tumor
suppressor genes (agenti su due proteine regolatrici del ciclo cellulare, ovvero la p53, e la Rb). L’atti-
vazione della proteina p53 in seguito a danni al DNA o da ipossia porta all’arresto del ciclo cellulare
in G1 e all’induzione dei geni che riparano il DNA. Se il danno non viene riparato, la cellula va in
apoptosi. Questo è il motivo per cui l’inattivazione di tale proteina non induce un blocco del ciclo
cellulare, nessun riparo del DNA e le cellule possono continuare a replicare in maniera continua. A
questo punto, il mancato controllo dei geni regolatori sul DNA può indurre a modificazioni di tipo
genomico; dunque le linee immortalizzate in questo modo possono acquisire delle caratteristiche
molto diverse rispetto alla cellula di partenza. La proteina Rb, normalmente regola il ciclo cellulare
andando a legarsi al fattore di trascrizione E2F inducendo l’attivazione dei geni che portano la cellula
in fase S. La proteina Rb viene regolata da un sistema di fosforilazioni che portano ad un suo cambia-
mento conformazionale che fa perdere l’affinità di legame per il fattore E2F e l’avvio e la progressione
della fase S. L’antigene T di SV40, agisce su entrambe queste due proteine, andando a sequestrare
da una parte la proteina p53 e dall’altra l proteina Rb fosforillata che non può temporaneamente
legare il fattore E2F. La conseguenza dell’antigenetica T di SV40 è la mancata inibizione del ciclo
cellulare; le cellule non esercitano più controllo né sul danno al DNA né riguardo la selezione di
nutrienti corretti per la duplicazione, continuando a proliferare per un tempo indefinito. Un’altra
strategia che può essere adottata per l’immortalizzazione delle cellule è quella di sovra esprimere il
gene che codifica per la telomerasi, ovvero l’enzima deputato alla sintesi di telomeri e che è molto
attivo nelle cellule di natura embrionale e di tipo staminale. Il mantenimento in attività della
telomerasi fa sì che i telomeri risultino sempre di una determinata lunghezza, non permettendo alla
cellula di divenire senescente e successivamente apoptotica (fasi nelle quali i telomeri, normalmente,
risultano più corti). Un'altra tecnica che permette l'immortalizzazione di una linea cellulare primaria
è quella degli ibridomi; utilizzata nel momento in cui si vuole studiare delle cellule altamente
differenziate, e che di conseguenza, presentano capacità replicative molto basse o addirittura nulla
(basti pensare alle cellule post-mitotiche come i motoneuroni). Questa tecnica consiste nella fusione
di una cellula differenziata con una cellula tumorale e, tra i vari cloni che si formano, si va a selezionare
il clone con il maggior differenziamento che ha acquisito capacità replicative infinite. Generalmente
tale fusione avviene tra cellule della stessa specie (ibridomi topo-topo) oppure tra specie differenti
(topo-uomo, dove in questo caso la cellula differenziata è quella di topo e la cellula tumorale sarà
quella umana). Gli ibridomi possono essere mantenuti in coltura inalterati, anche se talvolta lo
svantaggio può essere rappresentato dal fenomeno di de-differenziamento durante i passaggi di
coltura, che fa prevalere la componente tumorale rispetto alla componente differenziata. Le cellule
ibride topo-topo sono generalmente più stabili di quelle topo-uomo. In tal caso si perdono più
frequentemente i cromosomi umani. Per l'ottenimento degli ibridomi si utilizza una tecnica che
prevede il trasferimento genico mediato da cromosomi. Questa tecnica permette la fusione di due
17
cellule in un’unica cellula ibrida utilizzando il polietilenglicole (PEG); attraverso la combinazione del
materiale cromosomico delle due cellule madri (corredo cromosomico raddoppiato) mediante la
fusione dei nuclei. Solitamente anche se i nuclei appaiono fusi, i cromosomi rimangono distinti. Tale
operazione porta alla formazione di una generazione clonale successiva; per tale ragione è im-
portante, nelle prime fasi, andare a selezionare quel clone che presenta le caratteristiche di nostro
interesse, ovvero che abbia capacità replicative infinite e aspetto metabolico e fenotipico quanto più
simile alla cellulla non tumorale (differenziata). Talvolta però, come anticipato sopra, con il proseguire
della coltura, il de-differenziamento può essere dovuto anche al fatto che gli ibridomi possiedono un
corredo cromosomico duplicato e altamente instabile perché spesso durante a duplicazione possono
essere persi uno o più cromosomi in maniera indistinta. Un esempio di ibridoma è la formazione di
motoneuroni immortalizzati (come l’NSC), ottenuti a partire da una coltura primaria di motoneuroni
fusa mediante l’utilizzo di PEG con cellule tumorali di neuroblastoma. L’NSC è stato ottenuto a partire
da cellule di neuroblastoma N18TG2 fuse con dei motoneuroni primari di topo; la coltura ottenuta a
dato vita a due linee clonali (SNC19 e SNC34) di motoneuroni immortalizzati con le caratteristiche
mantenute dai motoneuroni dai quali hanno avuto origine. Da una visione al microscopio ottico è
possibile osservare, in modo netto, tali caratteristiche prettamente motoneuronali per la presenza
dei lunghi assoni che dipartono dal pirenoforo. La tecnica degli ibridomi, oggigiorno, viene utilizzata
per la sintesi degli anticorpi monoclonali. Inizialmente l’animale viene immunizzato con un particolare
antigene e, successivamente, vengono selezionate quelle cellule in grado di produrre un determinato
anticorpo di interesse. Tali cellule selezionate vengono poi fuse con delle cellule tumorali in modo da
ottenere una linea cellulare che sia in grado di produrre l’anticorpo monoclonale di interesse.
1.7 Colture primarie e linee cellulari
Scelta della linea cellulare. Quando si lavora con una coltura cellulare è importante scegliere la linea
cellulare più opportuna. La scelta viene fatta in base allo studio che deve essere compiuto; ovvero se
si studio, ad esempio, una patologia neurologica la scelta viene indirizzata verso l’utilizzo di cellule
neuronali e così via. I fattori che bisogna considerare sono i seguenti:
1. la specie (ad esempio uomo, topo ecc);
2. le caratteristiche funzionali;
3. l’utilizzo di una linea cellulare finita o continua come start-point;
4. l’utilizzo di cellule normali o trasformate come start-point;
5. le condizioni di crescita.
Di solito la prima scelta, nel momento in cui si inizia la sperimentazione, cade sull’utilizzo di linee
cellulari continue le quali sono più abbondanti, facili da reperire e mantenere in coltura e soprattutto
non richiedono alcun sacrificio di animali. Non sempre però è possibile utilizzare le linee continue,
infatti se ad esempio bisogna studiare un determinato organo in un determinato modello animale,
meglio partire da colture primarie. Quando si ha l’esigenza di studiare cellule umane, queste
potrebbero essere più difficili da ottenere (soprattutto se queste non sono cellule immortalizzate)
per via delle limitazioni legislative.
Esempi di linee cellulari. Una delle linee più utilizzate è la HEK293 human embryonic kidney,
cellule di origine umana, ottenute mediante trasformazione (immortalizzazione) virale di normali
18
cellule embrionali di rene. Molto facili da crescere e trasfettare. Dal tessuto renale di scimmia
vengono isolate le COS 1,7, cellule epiteliali immortalizzate attraverso l’antigene T di SV40. Le cellule
CHO (chinese hamster ovary) sono state isolate dal tessuto ovarico del criceto, particolarmente
utilizzate per lo studio di espressione genica poiché facilmente trasfettabili. Alcune cellule di origine
neuronale sono le PC12, molto utilizzate per il differenziamento e hanno la caratteristica peculiare di
crescere con una morfologia poco differenziata in assenza di NGF o acido retinoico; in caso contrario
l’aggiunta di questi due fattori di crescita ne premette il differenziamento a neuroni maturi. In seguito
possiamo distinguere le cellule Jurkat che sono cellule che si accrescono in sospensione; le cellule
HeLa di adenocarcinoma, precedentemente citate riguardo la loro aggressività e la loro capacità di
contaminare facilmente altri tipi di cellule e, dunque, per tale ragione si prestano molto bene per gli
studi di crescita tumorale in vitro. Le cellule NHI-3T3, sono dei fibroblasti di topo che spesso vengono
utilizzate non tanto come materiale di studio ma per fornire un substrato di crescita per altre linee
cellulari.
1.8 Le cellule staminali
Finora si è visto come ottenere delle line cellulari continue in vitro a partire dall’espianto di un tessuto
o di un organo animale, oppure da un fluido biologico; come stabilire una coltura primaria e come in
alcuni casi tale coltura primaria può essere indotta a modificazioni che gli consentono di replicare in
maniera indefinita. E’ molto importante per un ricercatore avere a disposizione tanto materiale
biologico per poter condurre le sue analisi, evitando di dover partire sempre dall’animale. Sempre in
quest’ultimo esistono delle cellule primitive non specializzate in grado di generare cellule figlie sia
identiche alla cellula madre, sia differenziate lungo una o più linee cellulari, cioè trasformate in diversi
altri tipi di cellule. Tali cellule, dette staminali, sono in grado di replicare in maniera indefinita. Per
poter essere definita staminale una cellula deve soddisfare due proprietà:
1. autorinnovamento, cioè capacità di compiere un numero illimitato di cicli replicativi
mantenendo il medesimo stadio differenziativo. Il processo replicativo avviene attraverso
mitosi mantenendo sempre le caratteristiche della cellula di partenza. Questo permette
di mantenere una riserva di cellule indifferenziate che prende il nome di nicchia staminale.
2. potenza, cioè capacità di dare origine a una o più specie cellulari tramite il differen-
ziamento. Quest’ultimo corrisponde alla capacità di queste cellule di riuscire a specializ-
zarsi in cellule con caratteristiche fenotipiche, biochimiche e metaboliche diverse dalla
cellula di partenza. È un processo molto più complesso, che richiede una moltitudine di
passaggi ed è finemente regolato. Le cellule staminali, in base alla potenza, possono esse-
re suddivide in 4 grossi gruppi:
a. cellule totipotenti, possono generare tutti i tipi cellulari, svilupparsi in un intero orga-
nismo e persino in tessuti extra-embrionali (es. blastomeri);
b. cellule pluripotenti, possono generare più tipi cellulari diversi e specializzarsi in tutti i
tipi di cellule di un individuo adulto ma che, a differenza delle cellule totipotenti, non
sono in grado di generare le cellule che compongono i tessuti extra-embrionali;
c. cellule multipotenti, possono differenziarsi solamente in alcuni tipi di cellule;
d. cellule unipotenti, possono generare solamente un tipo di cellula specializzata.
19
Classificazione in base alla fonte e alla funzione delle cellule staminali. Le cellule staminali
possono essere classificate in base alla fonte di ottenimento (staminali embrionali o adulte). Per
quanto riguarda le cellule staminali embrionali, queste possiedono la maggiore potenza; infatti nei
tessuti embrionali si ritrovano cellule totipotenti (le quali possono produrre anche i tessuti extra-
embrionali, ottenute dall’oocita fecondato fino allo stadio di morula), multipotenti e pluripotenti. Nei
tessuti adulti, invece si ritrovano unicamente cellule multipotenti o unipotenti.
Secondo la sorgente di derivazione si possono anche classificare in 4 tipi:
1. Staminali embrionali, dalle cellule interne di una blastocisti (cellule pluripotenti),
2. Staminali fetali, (multipotenti), presenti nell'utero, nel corso dello sviluppo fetale (gastrula) e
ottenute da feti abortiti spontaneamente o da interruzioni di gravidanza;
3. Staminali amniotiche, presenti nel liquido amniotico che circonda il feto durante la gestazione;
4. Staminali adulte, non specializzate, reperibili tra cellule specializzate di un tessuto specifico e
prevalentemente multipotenti.
Le cellule staminali embrionali e fetali servono alla formazione dell’organismo, invece le cellule
staminali. Le cellule staminali adulte servono ad assicurare il ricambio cellulare (che avviene nor-
malmente durante la nostra vita) e anche ad intervenire in caso di danno a livelli di organi (deputate
al mantenimento dell’omeostasi tissutale). Le cellule staminali adulte si trovano in diverse sedi tra
cui cervello, occhi, fegato, ossa e nei muscoli. Queste possono essere multipotenti e dare origine
solo ad alcuni tipi di cellule (ad esempio le cellule del sangue); oppure unipotenti, capaci di generare
un solo tipo di cellula specializzate.
Le cellule staminali sono un’ottima fonte di cellule per generare una coltura in vitro per la loro capaci
di autorinnovarsi. Le cellule staminali possono essere prelevate a vari livelli (dall’embrione feconda-
to, dalla blastula, gastrula, dal feto o dall’individuo adulto) per dare origine ad una linea cellulare in
vitro che, se in opportune condizioni, può mantenere la sua capacità di autorinnovamento; in alcuni
casi, se esposta a dei fattori specifici può essere indotta a differenziamento secondo la linea cellula-
re di interesse. Esistono, tuttavia, una serie di problemi etici legati all’utilizzo delle cellule staminali
per la ricerca dove il prelievo in animali di tali cellule è regolamentato da una commissione etica che
dà la sua approvazione su protocolli e sperimentazioni previste. L’utilizzo delle cellule staminali,
soprattutto quelle embrionali, sono le più interessanti dal punto di vista della ricerca, che proprio per
la loro totipotenza, possono dar origine a tutte le cellule di un organismo e ottenere cellule specifiche
differenziate utili alla ricerca. Per ovviare a queste problematiche etiche, gli studiosi han-no cercato
di trovare una soluzione per ottenere delle cellule con delle caratteristiche di auto-rinnovamento
tipica delle cellule staminali e la capacità di differenziamento in alcune linee cellulari.
Cellule iPSCs. Una scoperta molto importante, valsa poi il premio nobel ad uno scienziato
giapponese Shinya Yamanaka, è quella della riprogrammazione delle cellule adulte fino allo stato di
pluripotenza, così da ottenere una linea di cellule staminali pluripotenti indotte denominate iPSCs
(induced PluripotentStem Cells). L’obbiettivo principale dello studio di questo scienziato era quello di
riuscire riprogrammare dei fibroblasti per ottenere delle cellule pluripotenti indotte capaci di
differenziare in diverse linee cellulari (sostanzialmente quelle appartenenti ai tre foglietti germinativi:
endoderma, mesoderma ed ectoderma) partendo da cellule somatiche. La pluripotenza indotta è
stata ottenuta inizialmente da fibroblasti di topo e, nell’anno successivo anche da fibroblasti umani,
portando alla riespressione di determinati fattori (successivamente denominati fattori di Yamanaka,
20
l’Oct3/4, il Sox2, il KIf4 e c-Myc) in modo da riprogrammare queste cellule ad uno stadio di
pluripotenza. La riprogrammazione dei fibroblasti prevedeva l’espianto di un frammento di cute
tramite biopsia. Successivamente si è cercato di ottenere queste cellule da una fonte più accessibile
qualora si volevano ottenere delle cellule umane; per tale ragione, degli studi hanno consentito la
riprogrammazione di cellule presenti nei fluidi biologici a partire dai linfociti, oppure particolari tipi di
cellule che possono essere rintracciate nelle urine. Da questo passo avanti si è ottenuto un notevole
vantaggio circa la facilità di ottenimento di tali cellule con un prelievo ematico, piuttosto che con una
biopsia di cute. Attraverso queste tecniche innovative si potuto cambiare radicalmente la storia delle
colture cellulari. Un secondo vantaggio sta nel fatto che è possibile ottenere una linea cellulare a
partire da un soggetto malato e che possono costituire un vero e proprio modello di studio. Lo
svantaggio di questa cellula è che nel momento in cui si va a riprogrammare una cellula somatica, le
mutazioni epigenetiche probabilmente verranno mantenute anche nelle replicazioni successive di
tale cellula riprogrammata. Se osservate al microscopio ottico, queste cellule, presentano peculiari
caratteristiche morfologiche che vi attribuiscono una forma tondeggiante di piccola dimensione e
che si accrescono attraverso colonie. Hanno la capacità si svilupparsi su due substrati differenti: su
una matrice biologica come il matrigel, oppure su un mono-strato di fibroblasti di topo che vengono
seminati, portati a confluenza e successivamente ne viene inibita la replicazione portandoli a
senescenza. Questi fibroblasti forniscono la matrice extracellulare di supporto utile alla crescita di
queste cellule. Molto importanti per queste cellule sono le condizioni di crescita poiché queste
devono essere mantenute allo stato indifferenziato. Per far questo, è importante che il terreno di
crescita venga sostituito tutti i giorni per mantenere attivi gli otto fattori di crescita necessari a
garantire la pluripotenza di queste cellule. Tra questi otto fattori, quelli più importanti che si
consumano rapidamente, e che devono essere costantemente reintegrati, sono l’FGF2 e TGF-beta1.
Limitazioni delle cellule iPSCs. La limitazione principale, per ora, è legata al costo; infatti il manten-
imento dei terreni di coltura sia per quanto riguarda la pluripotenza che per il differenziamento di
queste cellule ha un costo parecchio elevato. Un’altra problematica è legata al fatto che queste
cellule mantengono le modificazioni epigenetiche anche nelle generazioni future. Possono essere
caratterizzate da instabilità genomica e, in alcuni casi, risulta difficoltoso ottenerle.
21
2. Mantenimento di una coltura
cellulare.
2.1 Ciclo o curva di crescita.
Per poter coltivare una linea cellulare in vitro è necessario essere a conoscenza delle caratteristiche
della sua curva di crescita; questo perché ogni linea cellulare segue delle fasi ben precise di crescita
che vanno sotto il nome di curva di crescita. Tale curva non va confusa con il ciclo cellulare. È
fondamentale conoscere i parametri di crescita del ciclo replicativo delle cellule che si vuole coltivare.
Il ciclo di crescita infatti determina:
1. la densità di semina;
2. il tempo d crescita;
3. la durata di un esperimento;
4. il momento adatto per il prelievo del campione;
5. Il metabolismo cellulare.
Generalmente, all'interno di una cultura cellulare, le cellule si trovano in fasi diverse del ciclo di
crescita e, di conseguenza, si comportano in modo diverso rispetto di parametri biologici come la
proliferazione, le attività enzimatiche, la sintesi di prodotti specifici, la glicolisi, la respirazione
cellulare e l'interazione con la matrice extracellulare. Il ciclo di crescita può essere suddiviso in 3 fasi:
1. FASE LAG (o fase iniziale) di adattamento – in tale fase tutte le cellule ricostituiscono tutte le
strutture che erano state precedentemente modificate o danneggiate in seguito al distacco
dal substrato precedente. Nello specifico, si osserva un riassemblaggio del citoscheletro e
sintesi delle proteine strutturali e della matrice extracellulare e il ripristino di tutti quegli
elementi che erano stati danneggiati durante il distacco. La fase LAG corrisponde anche al
tempo immediatamente successivo alla coltura e alla semina e, proprio a causa del riadat-
tamento cellulare al substrato, il numero delle cellule in attività proliferativa è minimo (fase
di latenza).
2. FASE LOG (o fase logaritmica) in cui si osserva una crescita esponenziale. La fase Log segue
immediatamente la fase di adattamento, infatti, non appena le cellule si sono adattate alle
nuove condizioni di crescita, queste cominciano a duplicare in modo esponenziale. La durata
di questa fase è direttamente proporzionale al numero di cellule che sono state seminate in
un determinato terreno, al grado di crescita delle cellule e alla densità minima di inibizione
della proliferazione. In questa fase, circa il 90% delle cellule è in fase attiva di divisione, per
cui la fase LOG è quella in cui il modello della linea cellulare risulta maggiormente ripro-
ducibile (è la fase migliore per la vitalità cellulare, per raccogliere i campioni e per effettuare
gli esperimenti poiché questi hanno un identico grado di riproducibilità nel tempo). Bisogna
tener presente che le cellule non sono sincronizzate, cioè sono distribuite in maniera casuale
nel ciclo cellulare.
22
3. FASE PLATEAU (o fase stazionaria) in cui non si osservano più replicazioni. Tale fase inizia con
la fase terminale della fase logaritmica quando tutte le cellule hanno occupato tutto lo spazio
a loro disposizione, diventano confluenti e la replicazione viene rallentata a causa
dell’inibizione da contatto. Si assiste anche ad un rallentamento dell’accrescimento che, a
seguito di un mancato intervento sulla coltura, porta a senescenza e successivamente a morte
cellulare.
Figura 2. Ciclo di crescita.
Durante la curva di crescita di una coltura cellulare si possono osservare due diversi tipi di arresto
della crescita associati a due diversi fenomeni di inibizione:
1. INIBIZIONE DA CONTATTO. Si osserva qualora alle cellule venga a mancare l’ancoraggio con
il substrato. L’aumento in numero delle cellule all’interno della coltura cellulare fa sì che le
cellule diventino troppo confluenti e si riducano gli spazi per ancorare nuove cellule sul
substrato di partenza. Questo ne determina il blocco della crescita e della replicazione. L’inibi-
zione da contatto viene meno nelle cellule tumorali, quindi la crescita cellulare non si arresta
e le cellule si dispongono su più strati.
2. INIBIZIONE DA DENSITA’. È associata ad un blocco della crescita per la mancanza dei
nutrienti. In questo caso anche le cellule tumorali risentono dell’inibizione da densità e arre-
stano la loro crescita. Ovviamente le cellule tumorali, riescono a raggiungere delle densità di
crescita più alte perché possono disporsi in multistrati.
DIAGRAMA DI CRESCITA. È possibile disegnare un diagramma di crescita che dipende dal tipo
di cellule in coltura (le linee di coltura primaria avranno una velocità di crescita molto diversa rispetto
alle cellule immortalizzate oppure rispetto a cellule tumorali). Nel diagramma di crescita viene
23
rappresentato il tempo (sull’asse delle ascisse) e la densità (sulle ordinate). Si può osservare una fase
iniziale di adattamento con attività accrescitiva e replicativa molto bassa. La fase successiva è la fase
di accrescimento esponenziale (o fase logaritmica) che inizia solitamente dopo un giorno
dall’inserimento delle cellule sul nuovo substrato di coltura e, di solito, ha una durata di circa 2-3
giorni. Alla scadenza di tale periodo bisogna intervenire sulla coltura, altrimenti le cellule arrestano
la loro crescita per raggiungimento della confluenza. Dal diagramma della curva di crescita è possibile
estrapolare più informazioni tra cui:
1. il tempo di raddoppiamento (la più importante), ovvero il tempo (di solito a metà della fase
logaritmica) necessario a raddoppiare di concentrazione;
2. la saturazione da densità (S.D.), che si verifica qualora non venga effettuato un cambio del
terreno al tempo di raddoppiamento (operazione fortemente consigliata per mantenere la
coltura in attiva divisione).
2.2 Mantenimento della vitalità di una coltura cellulare.
L’analisi della curva di crescita fornisce informazioni su quando effettuare delle operazioni sulla
coltura cellulare in modo tale da mantenerla vitale nel tempo. Le operazioni che possono essere
apportate ad una coltura cellulare sono: il cambio del terreno oppure la subcultura.
CAMBIO DEL TERRENO. Il cambio del terreno viene effettuato prima della subcultura, quando
le cellule non sono ancora confluenti (possibilmente) e soprattutto quando si osserva un aumento
della velocità di crescita che presuppone un attivo metabolismo cellulare e un consumo rapido dei
nutrienti. Ovviamente il cambio del terreno di crescita è strettamente dipendente dal tipo cellulare
in esame (le cellule post-mitotiche consumeranno meno terreno rispetto alle cellule tumo-rali), e dal
volume nel quale si sta effettuando la coltura cellulare (ad esempio le cellule in sospensione
necessitano di un cambio di terreno più frequente rispetto a quelle che crescono in adesione).
SUBCULTURA. Una subcoltura (o passaging) è la rimozione del terreno, il distacco delle cellule
ed il trasferimento di un’aliquota di cellule da una coltura precedente in una nuova con terreno di
crescita fresco, in modo tale che le cellule non si trovino mai in una situazione di confluenza eccessiva
che porti all’arresto della crescita per inibizione da densità o da contatto.
Come si effettua una subcultura. La modalità di ottenimento della subcultura dipende fatto di avere
cellule in sospensione o in adesione. Per le cellule che crescono in sospensione è necessario mescola-
re bene la coltura, prelevare un’aliquota, lavare con eccesso di terreno fresco e in fine effettuare la
conta in modo da determinare la densità e stabilire il numero di cellule da seminare. Successivamente
è necessario risospendere l’aliquota su terreno fresco e seminare la nuova sospensione cellulare in
contenitori per coltura cellulare alla concentrazione opportuna. Molto più complessa è la subcultura
di una coltura cellulare che cresce in adesione. Partendo da una coltura cellulare primaria ottenuta
per disgregazione di un tessuto animale (o da biopsia umana), la prima volta che questa coltura arriva
a confluenza ed è necessario effettuare la subcultura rappresenta un’importante fase di transizione,
perché il primo passaggio è quello che ci consente di generare una linea cellulare secondaria e
generalmente effettuato quando la linea cellulare è cresciuta in modo da occupare tutto il substrato
disponibile. Quanto appena detto è importante poiché si cerca di massimizzare il numero di cellule
provenienti da una coltura primaria. Nel momento in cui si deve effettuare una subcultura di una
24
cultura che cresce in adesione, bisogna tener conto che le cellule vanno staccate dal substrato e che
l’adesività di queste al nuovo substrato è dipendente da proteine che usano come cofattore il calcio
e il magnesio. Dunque il distacco può essere effettuato utilizzando degli enzimi specifici (tripsina
addizionata con EDTA) che agiscono andando a degradare le proteine della matrice extracellulare,
oppure prevede l’utilizzo di metodi meccanici (ad esempio screaper, ovvero dei bastoncini che con-
sentono di staccare meccanicamente le cellule dal substrato di crescita; oppure irrigando con terreno
di crescita l’intera coltura in modo da favorirne il distacco). La tripsina è un enzima proteolitico (serin-
proteasi ottenuto da pancreas di bovino) che rompe i legami peptidici delle proteine extracellulari
che costituiscono il substrato su cui le cellule sono ancorate. La temperatura ottimale per il suo
funzionamento è 37°C ma funziona anche a temperatura ambiente. Generalmente è attiva dopo 5-
10 minuti. Viene addizionata ad EDTA, un agente chelante di calcio e magnesio, che sottrae questi
ioni alle proteine della membrana per il loro legame alla matrice, e favorisce il funzionamento della
tripsina. La tripsina viene inattivata dalle proteine presenti nel siero. Non deve essere lasciata agire
per un tempo abbastanza lungo perché potrebbe danneggiare le proteine della membrana plasma-
tica. Oltre alla tripsina esistono anche altri metodi enzimatici alternativi (Acutase e TryPLE) entrati in
commercio recentemente, meno aggressivi (maggiore efficacia) ma più costosi. Un’alternativa alla
Tripsina è l’Acutase, un enzima di origine marina scoperto recentemente, il quale esplica un’azione
proteolitica e colagenolitica. E’ utilizzato per il distacco delle colture primarie e delle cellule staminali
per la minore aggressività rispetto alla tripsina. Data la sua origine di tipo vegetale ha come vantag-
gio, rispetto alla tripsina, quello di non contenere proteine di origine animale o batteri.
Subcoltura di cellule in monostrato. Generalmente avviene secondo i seguenti step:
1. Inizialmente viene aspirato il terreno di coltura consumato. Tale operazione consente di
eliminare eventuali detriti cellulari o cellule morte.
2. Il monostrato viene lavato solitamente con terreno privo di siero, perché altrimenti questo
inattiverebbe la tripsina.
3. Viene aspirato anche il terreno di lavaggio.
4. Si introduce l’enzima proteolitico (tripsina o Acutase) in un volume sufficiente a coprire il
monostrato.
5. Successivamente si procede all’incubatura per circa 5-10 minuti ad una temperatura di 37 °C.
6. Verificare il distaccamento delle cellule, una volta trascorso il tempo di incubazione, attraverso
l’osservazione della flasks.
7. Viene bloccata l’azione della tripsina aggiungendo terreno con siero.
8. Procedere come dal primo punto della subcoltura di cellule in sospensione.
Conta cellulare. Durante la sub-coltura è possibile contare le cellule presenti nella sospensione cellu-
lare e determinare la concentrazione (procedura caldamente consigliata). L’informazione ottenuta
permetterà di effettuare una semina di un preciso numero di cellule, e quindi di standardizzare la
procedura e rendere quanto più riproducibile l’esperimento di interesse. Quanto si effettua una sub-
coltura bisogna evitare di seminare un numero di cellule troppo basso rispetto alla superficie a dispo-
sizione per la crescita; ma anche di seminare un numero di cellule troppo elevato. Il problema di una
semina troppo bassa è che questa richiede troppo tempo per arrivare a confluenza e, molto spesso,
questo provoca un arresto della crescita e l’avvio della fase senescente che le porta a morte. A tal
proposito bisogna ricordare che, ai fini dell’accrescimento, le cellule hanno bisogno di essere suf-
25
ficientemente vicine per poter interagire tra loro. Al contrario, una densità di semina troppo elevata
porta le cellule a confluenza in maniera rapida e i risultati sperimentali che si ottengono spesso non
sono riproducibili (perché viene a mancare la fase iniziale di adattamento in seguito al distacco dal
substrato per ripristinare i componenti danneggiati). Per effettuare una conta cellulare si utilizzano
delle cellette di conta, che consistono in dei reticoli con un volume noto, normalmente utilizzati
contare il numero di cellule al microscopio. Uno dei reticoli utilizzati per la conta è la camera di Burker,
fondamentalmente strutturato in nove quadrati più grandi delimitati da tre righe parallele con
all'interno quadrati e rettangoli delimitati da due righe parallele. I quadrati di solito hanno una
dimensione nota, ovvero un 1 mm di lato in modo tale che si conosca il volume delle camere minori.
Quindi, dalla area del quadrato si ottiene 1 mm quadrato, lo spessore della camera 1/10 di mm e il
volume e 1/10mm cubo. Tali informazioni serviranno per il calcolo della densità all’interno della
sospensione.
Figura 3. Camera di Burker.
È possibile inserire pochi microlitri della sospensione cellulare all’interno del vetrino di conteggio che
si distribuiranno all’interno del reticolo sfruttando il riempimento per capillarità e poi, successi-
vamente contare le cellule presenti in tre quadrati grandi (ciascuno composto da 9 quadrati minori)
e calcolarne la media.
1 2 3
4 5 6
7 8 9
26
Nella figura 4 viene proposto un esempio di conteggio cellulare utilizzando la camera di Burker. I
numeri non corrispondono ai pallini effettivamente rappresentati nel disegno. Supponiamo di aver
contato nel primo quadrato 63, nel secondo 70 e nel terzo 56 cellule. Viene fatta la media e si
ottengono 63 cellule da considerare in 1/10 di mm cubo (il volume all’interno del quale è stata posta
la sospensione cellulare). Dalla conversione dei mm cubi in mL si ottiene che la sospensione cellulare
sarà concentrata di 630.000 cellule per mL. Riassumendo in calcoli:
63 + 70 + 56 = 186 cellule contate nei tre quadrati
Densità: 186 : 3 = 63 cellule in media in 1/10 mm3
Conversione: 63 cellule in 104 mL = 63 x 104 = 630.000 cellule/mL
Dove 104 è il fattore di diluizione della cameretta.
Figura 4. Esempio di conta.
27
ESERCIZIO 1
ESERCIZIO 2
Calcolare la densità di una sospensione cellulare sapendo che la conta effettuata in 3 quadrati della camera di Burker è di 93, 105, 87 cellule. A. 950.000 cel/ml B. 95.000 cel/ml C. 950 cel/ml D. 95 cel/ml Risoluzione. media = (93 + 105 + 87)/3 = 95 cellule densità = media x fattore di diluizione della cameretta = 95 cell x 104 ml = 950.000 cel/ml.
Calcolare il numero di cellule presenti in una sospensione cellulare sapendo che la conta effettuata in 3 quadrati della camera di Burker è di 25, 37, 28 cellule e che il volume della sospensione è pari a 8 ml. A. 2,4 mln B. 240.000 C. 24.000 D. 240 Risoluzione. media = (25 + 37 + 28)/3 = 30 cellule densità = media x fattore di diluizione della cameretta = 30 cel x 104 = 300.000 cel/ml cellule totali = densità x volume finale = 300.000 cel/ml x 8 ml = 2,4 milioni di cellule.
28
ESERCIZIO 3
ESERCIZIO 4
Data una sospensione cellulare X, indicare il volume da prelevare per effettuare una semina di 10 pozzetti di una mw da 24 pozzetti a 70000 cell/pozzetto, sapendo che la conta in camera di Burker delle cellule presenti nella sospensione X è: 143; 137; 140.
A. 5 ml B. 500 ul C. 50 ul D. 5 ul Risoluzione. media = (143 + 137 + 140)/3 = 140 cellule densità = 140 cel x104 ml = 1.400.000 cel/ml cellule da seminare = 70.000 x numero di pozzetti = 700.000 cellule volume da prelevare = numero cellule / densità = 700.000 / 1.400.000 = 0,5 ml
Data una sospensione cellulare X, indicare il volume da prelevare per effettuare una semina di 10 pozzetti di una mw da 24 pozzetti a 70000 cell/ml, sapendo che: - la conta in camera di Burker delle cellule presenti nella sospensione X è 143 – 137 - 140 - Il volume da seminare in un pozzetto di una mw24 è di 0.5 ml
A. 2,5 ml B. 250 ul C. 25 ul D. 2,5 ul Risoluzione. media = (143 + 137 + 140)/3 = 140 cellule densità = 140 cel * 104 ml = 1.400.000 cel/ml volume da seminare = volume del pozzetto x numero dei pozzetti = 0,5 x 10 = 5 ML cellule da seminare = 70.000 cel/ml x volume da seminare = 70.000 cel/ml x 5ml = 350.000 cellule volume da prelevare = numero cellule / densità = 350.000 / 1.400.000 = 250 ul
29
2.3 Terreni per le colture cellulari.
I requisiti fondamentali dei terreni di coltura sono principalmente tre:
1. Fornire tutti i composti necessari alle cellule (sostanze elementari per la costruzione delle
macromolecole, substrati per il metabolismo energetico, vitamine, etc.);
2. Deve contenere un sistema tampone per mantenere il pH entro i limiti fisiologici;
3. Non deve contenere fattori tossici per le cellule.
I primi medium in cui sono state cresciute delle cellule in coltura sono quelli estratti da fluidi corporei,
tessuti di animali. Come abbiamo visto in precedenza, la formulazione di un vero e proprio terreno
specifico per le colture cellulari eucariotiche fu fatta da Harry Eagle nel 1955, il quale comprese che
le cellule di mammifero crescevano ad una determinata temperatura (37°C), sature d’umidità, in un
mezzo acquoso stamponato a pH = 7.3–7.4 (condizioni fisiologiche). Successivamente i medium natu-
rali sono stati sostituiti da quelli sintetici, poiché questi erano facilmente riproducibili e standardiz-
zabili. In commercio sono disponibili numerose formulazioni di terreni chimicamente definiti per la
coltivazione di cellule. Solo alcuni di questi terreni sono in realtà utilizzati su larga scala e si possono
acquistare come terreni liquidi oppure come miscele di componenti in polvere da sciogliere e
sterilizzare in laboratorio. Il terreno di coltura viene scelto in base alle caratteristiche e alle esigenze
del tipo cellulare utilizzato. I terreni di coltura sono caratterizzati dall’avere una formulazione dei
nutrienti utile a soddisfare le diverse esigenze di crescita. Le cellule, infatti, necessitano di fattori
nutrizionali di base per crescere in vitro come:
1. Acqua – è il costituente fondamentale dei terreni di coltura liquidi e rappresenta la
percentuale maggiore dell’ambiente cellulare;
2. Amminoacidi – Tutte le cellule necessitano di 12 aa essenziali: arginina, cisteina, tirosina, iso-
leucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, istidina e valina. Inoltre
anche la glutammina è necessaria per le cellule, in quanto l’azoto contenuto nella glutammina
è l’unica fonte di purine e pirimidine per gli acidi nucleici e per NADH e NADPH. Sono tutti
della serie L (levogira). La glutammina è un amminoacido altamente instabile che nel tempo
si converte in una forma non utilizzabile dalle cellule. Deve essere aggiunta al terreno appena
prima dell’uso. Adesso ci sono formulazioni di glutammina stabile. L’aggiunta di amminoacidi
non essenziali stimola la crescita e prolunga la vitalità delle cellule.
3. Vitamine - Agiscono da coenzimi o gruppi prostetici nei processi metabolici cellulari. Quelle
più presenti sono la biotina, colina, folato, nicotinammide, pantotenato, piridossale, ribo-
flavina, tiamina. Di solito possono essere presenti anche nel siero.
4. Sali minerali inorganici, ioni ed elementi in tracce – Le cellule necessitano di elementi di base
come sodio, potassio, calcio, magnesio, azoto e fosforo; ma anche di elementi in tracce come
molibdeno, vanadio, ferro, zinco, rame e manganese. I sali inorganici influiscono in modo
determinante sulla capacità delle cellule di aderire al substato (ioni calcio) e sulla protezione
delle cellule dalle fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali e a prodotti del catabo-
lismo (ioni bicarbonato/fosfato).
5. Carboidrati (monosaccaridi come il glucosio) – Le colture cellulari usano glicolisi aerobica e
anaerobica per produrre energia. La capacità di assorbimento delle cellule varia per i diversi
30
monosaccaridi, la più alta è per il glucosio, la più bassa per il galattosio. I terreni sono addizio-
nati solitamente da glucosio ad alta (4.5 g/L) o bassa (1 g/L) concentrazione;
6. Supplementi organici – vengono aggiunti nei medium complessi. Tra questi supplementi
distinguiamo proteine, peptidi, nucleosidi, lipidi ecc. Vengono aggiunti solo se la concentra-
zione del siero è bassa.
7. Somatomedina (IGF) e Ormoni – Le cellule per crescere richiedono IGF ed ormoni per
stimolare la crescita e mantenere la funzionalità e lo stato cellulare. Presenti di solito nel siero.
8. Fattori di crescita.
PRESSIONE OSMOTICA. La pressione osmotica è un parametro molto importante che viene
regolato anche dal terreno di crescita, poiché le cellule necessitano di un ambiente isotonico per la
loro crescita garantito dalla corretta composizione del terreno di crescita (in combinazione con la CO2
presente nell’incubatore). La pressione osmotica del sangue umano è circa 290 mOsm/kg che è la
pressione osmotica ideale per le colture cellulari umane.
SISTEMA TAMPONE. Il pH ideale per la maggior parte delle cellule è 7.2-7.4 (leggermente
alcalino), un pH diverso può essere molto dannoso per le cellule. La principale sostanza che causa
variazioni di pH è la CO2 prodotta con il metabolismo cellulare. Infatti l’anidride carbonica può reagire
con l’acqua per produrre l’acido carbonico secondo la seguente reazione:
CO2 + H2O ↔ H2CO3 ↔ H+ + HCO3- (1)
quindi, tutti i medium sintetici vengono addizionati di un sistema tampone (generalmente bicarbo-
nato, NaHCO3). Hanno potere tampone le soluzioni contenenti in concentrazioni approssimativa-
mente uguali:
1. un acido debole e il suo sale con una base forte (CO2/HCO3);
2. una base debole e il suo sale con un acido forte (NH3/NH4+).
Tale soluzione resiste al cambiamento in seguito ad aggiunte contenute di un acido o di una base. La
scelta di una soluzione tampone dipende dal valore di pH che deve essere mantenuto costante.Un
sistema molto usato è il tampone bicarbonato che richiede un apporto di CO2 nell'incubatore e
bicarbonato nel medium. La percentuale di CO2 deve essere del 5% accuratamente controllato (e
mantenuta costante), perché governa la stabilità del sistema tampone; motivo per cui gli incubatori
hanno un sensore e un regolatore dell’afflusso di CO2 al loro interno. Infatti, la presenza di CO2 e del
tampone bicarbonato giocano sull'equilibrio della reazione (1), garantendo che il sistema tampone si
trovi ad una corretta concentrazione e che funzioni nella maniera adeguata.
CO2
CO2
Aria
Acqua
A
31
Tale sistema tampone esplica la sua funzione sia in eccesso di CO2 nell’aria che tende a disciogliersi
nel terreno di coltura e tamponata dal bicarbonato; oppure viceversa, qualora la concentrazione di
ioni H+ fosse troppo elevata all’interno del terreno (che ne risulterebbe acidificato), l’H+ reagisce con
la CO2 attraverso la reazione inversa e, quello che si osserverebbe, è la liberazione della CO2 nell’aria.
I terreni, solitamente, sono provvisti di un sistema che consente di andare a valutare rapidamente
ogni singola variazione del pH. Questo è reso possibile grazie all’aggiunta di un indicatore, il rosso
fenolo, dal colore caratteristico a pH fisiologico di 7.3. Quando il pH si abbassa (6,8 – 7), questo in-
dicatore, può virare verso il giallo; oppure, se il pH cresce (> 7,6) vira verso il rosa magenta. La condi-
zione più frequente che si può osservare è quella in cui l’indicatore vira al giallo; tale situazione è
indice dell’aumento eccessivo dell’attività metabolica cellulare (duplicazione) responsabile di un
incremento degli ioni H+ che acidificano il terreno che pian piano si sta consumando è necessita di
essere sostituito (o addirittura una subcultura). Il colore viola indica che le cellule non sono meta-
bolicamente attive o che la regolazione della CO2 è errata. Alcuni laboratori (e alcune linee cellulari)
non utilizzano questo tipo di sistema tamponante, e utilizzano incubatori "a secco" senza CO2. Si
utilizzano sistemi tampone che non prevedono l’utilizzo del bicarbonato. Quello più utilizzato è
l’HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid) che garantisce la stabilizzazione del
pH delle cellule. I terreni tamponati con HEPES sono utili quando le cellule vive devono essere mani-
polate per tempi lunghi fuori dall’incubatore. in questo caso la CO2 dell’atmosfera non è sufficiente
a mantenere il pH neutro per cui il terreno si alcalinizza con conseguente danno per le cellule. La
necessità di scambiare gas (soprattutto CO2) con l’esterno, ha fatto sì che il contenitore per coltura
cellulare dovesse prevedere tale scambio. I primi contenitori (flasks non ventilati) in plastica ave-
vano il coperchio che doveva essere leggermente svitato per consentire gli scambi; attualmente
invece, i contenitori flasks ventilati, sono caratterizzati da un tappo forato e provvisto di filtro che
permette gli scambi e garantisce che la soluzione all’interno non venga contaminata da agenti
atmosferici.
TERRENI DI COLTURA PIU’ UTILIZZATI. I terreni di coltura più utilizzati nella coltura delle cellule
sono principalmente tre:
1. MEM (Minimum Essential Medium) – più utilizzato;
2. DMEM (Dulbecco’s Modification of MEM);
3. RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium).
Questi terreni differiscono tra loro per il contenuto in glucosio, amminoacidi e sali minerali. Ogni
coltura cellulare ha uno specifico terreno di crescita. Se si acquista una coltura da una banca cellulare,
generalmente, viene indicato il terreno di crescita più adatto. Qualora si vogliano effettuare delle
colture di determinate linee cellulari è necessario compiere degli esperimenti su diversi terreni a
diverse concentrazioni per stabilire quello ideale. Nel MEM sono contenuti 12 amminoacidi non
essenziali, vitamine e alcuni Sali inorganici. Il DMEM, a differenza, è quattro volte più ricco in ammi-
noacidi, vitamine e glucosio rispetto al MEM; inoltre nel DMEM vengono addizionati il ferro e il rosso
fenolo. Solitamente il terreno di coltura viene acquistato e, al momento dell’uso, deve essere comple-
tato attraverso l’aggiunta di glutammina stabile, antibiotici (penicillina e streptomicina per ridurre la
contaminazione batterica) e il siero (il cui tipo e percentuali variano a seconda del tipo cellulare).
IL SIERO. Viene addizionato ai terreni di coltura per favorire la crescita cellulare. È un liquido
ottenuto dal plasma degli animali dopo la coagulazione. Generalmente, per le colture di cellule
32
eucariotiche, viene utilizzato il siero di bestiame come quello bovino. Quello che si predilige è il Cattle
serum che comprende il bovine calf serum (siero di vitello), new born calf serum (vitello neonato),
fetal bovine serum (siero fetale bovino, il più utilizzato). Il siero fetale bovino proviene dall’animale
partorito con taglio cesareo, quello di vitello neonato proviene dall’animale nato entro le 24 ore,
mentre il siero di vitello proviene da animali nati da 10-30 giorni. La scelta del siero appena nato con
taglio cesareo non è casuale, infatti l’animale prima del parto non era mai venuto a contato con
l’ambiente esterno e ha sviluppato il minor numero di anticorpi possibili. Questo diviene vantaggioso
perché si riduce la risposta immunitaria da parte delle cellule che vengono esposte a questo fluido
biologico. Sieri umani ed equini sono utilizzati solo in casi particolari.
Componenti del siero. I componenti che si ritrovano nel siero fanno parte di tre classi principali:
1. proteine, che sono i componenti principali, infatti il siero è molto ricco in albumine e globuline
(carrier per minerali, acidi grassi, ormoni), contiene fattori come la fibronectina e fetuina (che
promuovono adesione), altri fattori inibitori per la tripsina come l’alfa2-macroglobulina, e la
transferrina (lega il ferro presente nel terreno rendendolo meno tossico e maggiormente bio-
disponibile).
2. fattori di crescita, come PDGF, TGFb, EGF, FGF, IGF;
3. ormoni, come l’insulina (facilita l’uptake di glucosio), l’idrocortisone (adesione e proliferazione
cellulare, ad alte dosi è citostatico e differenziante).
4. nutrienti, come amminoacidi, glucosio, chetoacidi, lipidi, etanolamina, fosfoetenolamina;
5. minerali, tra cui ferro, rame, zinco e oligoelementi associati a proteine come ad es. selenio
che detossifica dai radicali liberi;
6. Inibitori, sostanze inibenti la proliferazione cellulare come tossine batteriche date da conta-
minazioni del siero, oppure dalla presenza di anticorpi presenti nelle g globuline del siero.
Solitamente per ridurre al minimo la risposta cellulare, il siero prelevato dal bovino deve
essere decomplementato, ovvero sottoposto an trattamento che prevede l’utilizzo di calore
(30 min a 56°C) per distruggere le molecole del complemento e le immunoglobuline che
possono essere presenti. La cascata di reazione del complemento porta alla lisi cellulare, e
quindi alla morte della nostra coltura.
Problemi nell’utilizzo del siero. Il problema principale legato all’utilizzo del siero animale è rappre-
sentato dal fatto che, essendo un fluido biologico, la sua composizione non è costante ma varia da
lotto a lotto principalmente per il fatto che deriva da animali diversi. Quindi è necessario ritestare la
compatibilità del siero ad ogni cambio di lotto. Il problema della mancanza di costanza nella compo-
sizione del siero ha fatto sì che i componenti del siero essenziali per la crescita cellulare per alcune
linee cellulari fossero stati analizzati e identificati, e questo ha permesso di mettere a punto terreni
“chimicamente definiti” che contengono alcuni dei costituenti del siero in quantità note.
Sieri speciali. Tra i sieri speciali possiamo distinguere:
1. Heat inactivated FBS: siero trattato a 56°C x 30 minuti per inattivare le proteine del comple-
mento.
2. Charcoal FBS: siero privato di ormoni. Questo siero viene utilizzato molto frequentemente
sugli studi cellulari in cui si vuole evidenziare l’effetto di un determinato ormone fornito alla
coltivazione.
33
3. Exosome-depleted FBS: siero privato di esosomi (vescicole extracellulari); questo viene utiliz-
zato nello studio delle vescicole extracellulari per la comunicazione tra le cellule.
4. Embryonic Stem Cell FBS Qualified: testato per ES e iPSC. È un siero specifico formulato per le
cellule staminale e per le iPSC.
5. Dialyzed FBS: a bassa concentrazione di piccole molecole.
Terreni speciali. Esistono una serie di terreni formulati per la crescita di particolari tipi cellulari o
particolari applicazioni.
2.4 Conservazione delle cellule in azoto liquido
Le cellule animali possono essere conservate nel tempo attraverso congelamento per poterle uti-
lizzare all’occorrenza. La conservazione prevede l’utilizzo di azoto liquido. L'azoto liquido è inerte,
privo di colore e di odore, e si trova ad una temperatura di -196 °C. Deve essere maneggiato con cura,
infatti il contatto accidentale con l'azoto liquido o con il gas che si sviluppa può provocare gravi ustioni
da freddo. Nel caso in cui il contatto sia prolungato le conseguenze possono essere lesioni molto gravi
da congelamento, dei tessuti anche a livello profondo.
COME AVVIENE LA CONSERVAZIONE. Per non restarne a corto, in laboratorio le cel-lule
provenienti da linee immortalizzate, o staminali embrionali o linee cellulari ibride vengono congelate
in azoto liquido dopo. Le cellule vengono riposte in contenitori adeguati e congelate lentamente e
poi poste in azoto liquido (-196°C). Le cellule possono restare in azoto anche per anni. Al contrario,
lo scongelamento deve essere al quanto rapido, infatti queste vengono riportate rapidamente a 37°C,
e possono essere seminate in piastre, aderiscono al substrato (che deve essere ricco di siero per
favorirne l’adattamento in fase LAG), dove cominciano a crescere e a riprodursi.
Velocità ideale di congelamento. Il raffreddamento deve essere tanto lento da evitare il formarsi di
ghiaccio intracellulare e nello stesso tempo tanto rapido da non danneggiare la cellula per disidra-
tazione; in queste condizioni il materiale biologico ha buone possibilità di sopravvivenza dopo scon-
gelamento. Un raffreddamento troppo rapido porta alla formazione di ghiaccio intracellulare ed
extracellulare, mentre un raffreddamento troppo lento conduce alla presenza di ghiaccio extra-
cellulare. La formazione del ghiaccio deve essere evitata in entrambi i casi perché induce la rottura
delle membrane cellulari. Se la velocità di raffreddamento è troppo lenta la cellula è esposta a
concentrazioni crescenti di soluti extracellulari. Se la velocità di congelamento è troppo alta si avrà la
formazione di nuclei di cristallizzazione sia nella soluzione esterna, sia all’interno della cellula. Con il
procedere del raffreddamento i nuclei si trasformano in grossi cristalli di ghiaccio. Il danno cellulare
è meccanico. I cristalli interni spaccano gli organuli subcellulari.
Crioprotettori. Oltre a regolare la velocità di congelamento, di solito vengono addizionate delle
sostanze (come glicerolo o DMSO- dimetilsolfossido) a diversa composizione chimica che hanno in
comune elevata solubilità in acqua e tossicità dipendente dalla concentrazione di utilizzo. Vengono
addizionati alla sospensione cellulare prima che questa venga congelata. La loro azione pro-ettiva si
esplica in vari modi:
1. con un’azione diretta sulla membrana cellulare;
2. si sostituiscono all’acqua e diminuiscono la formazione dei cristalli di ghiaccio;
34
3. abbassano il punto di congelamento della soluzione e permettono una maggiore
disidratazione delle cellule durante il congelamento lento.
Congelamento. Per effettuare un corretto congelamento si opera nello stesso modo di una sub-
coltura. Le cellule vengono staccate dal substrato di crescita e si procede con l’eliminazione del terre-
no di crescita e successivamente risospese in un volume ridotto di terreno di crescita addizionato
elevate concentrazioni di siero (il doppio di quella utilizzata normalmente). Al termine di tale opera-
zione si addiziona il crioprotettore. Dopo di che, le cellule vengono poste in crio-wallars (dei conteni-
tori che resistono alle basse temperature), e a loro volta posti in contenitori più grandi che consento-
no la riduzione della temperatura di 1 °C al minuto in modo da effettuare un congelamento
sufficientemente lento da non consentire la formazione di cristalli ma sufficientemente veloce da
garantire un congelamento corretto. Normalmente vengono congelati a -80 °C per una notte e, il
giorno successivo, vengono trasferiti in azoto liquido. Esistono diversi contenitori di azoto liquido in
formati differenti che consentono di contenere al loro interno dai 1000 ai 2000 crio-wallars; ma vi
sono anche sistemi di congelamento più grandi utilizzati dalle banche cellulari.
35
3. Laboratorio per colture cellulari.
3.1 Sterilità e contaminazione.
Il requisito fondamentale di un laboratorio per colture cellulari è la sterilità. È assolutamente
necessario mantenere le colture cellulari prive di contaminazione da parte di altre colture, da bat-
teri, da lieviti e virus. La contaminazione, infatti, può portare a variazioni significative del normale
metabolismo cellulare e, di conseguenza, ad una alterata interpretazione dei risultati ottenuti. Oltre
a garantire la stabilità bisogna proteggere le cellule in coltura (prodotto). Le maggiori fonti di conta-
minazione possibili in un laboratorio di coltivazioni cellulari sono generalmente dovute:
1. all’operatore, che può portare con sé virus, batteri ed altri agenti patogeni contaminanti che
possono essere presenti sulle mani, naso e bocca, abbigliamento, attraverso l’esecuzione di
una tecnica inadeguata, o addirittura, dovuta a conoscenze inadeguate di come bisogna
operare in un laboratorio di colture cellulari.
2. alle attrezzature presenti, in particolar modo il bagnomaria utilizzato per scaldare i terreni di
crescita; le centrifughe, gli incubatori, contenitori di gas e azoto liquidi, pipette ecc.
3. altri contaminanti quali additivi, cellule, materiale per coltura, terreni di coltura.
Dunque, l’operatore deve conoscere come operare in modo che questi contaminanti non possano
raggiungere la coltura cellulare. Non va dimenticato che le colture cellulari rappresentano del mate-
riale biologico e quindi è particolarmente importante, ai fini di una adeguata preservazione, che
vengano adottate delle procedure che consentano la protezione di chi lavora a contatto con le colture
cellulari. Le principali fonti di rischio per l’operatore sono le linee cellulari stesse, specialmente
quando si utilizzano linee cellulari umane (es linfociti) o primarie, in quanto sono portatrici di poten-
ziali agenti contaminanti per l’uomo. Altri esempi di fattori di rischio per l’operatore sono dovuti a
prodotti chimici speciali per le colture cellulari (DMSO, estrogeni, TPA ecc.). Per ridurre tali rischi,
l’operatore deve porre maggiore attenzione sull’importanza dell’utilizzo dei dispositivi individuali di
protezione (DPI). Tra tutti questi dispositivi di protezione che vengono forniti in un laboratorio, quelli
che sono necessari all’interno di un laboratorio microbiologico sono essenzialmente due:
1. camice bianco, il principale DPI da portare solo nell'area delle colture cellulari per evitare che
divenga un possibile vettore di contaminazione per le colture stesse. Deve consentire la
protezione di tutte le parti esposte, specialmente in tutti quei casi in cui si verifica uno sversa-
mento di liquidi. Ove è possibile, deve prevedere la possibilità di una allacciatura a collo e di
stringere i polsini (con un elastico o con un bottone) in modo tale da garantire la massima
protezione delle braccia e che non ci siano parti di pelle esposte all’ambiente.
2. guanti di lattice/nitrile – le mani sono la parte del corpo più contaminata e che si contamina
per prima. Un presupposto per poter lavorare in un laboratorio di colture cellulari l’igiene
personale delle mani, prima di indossare i guanti e nuovamente una volta terminato il lavoro.
I guanti possono essere di diversi materiali, quelli più comuni sono in lattice (o in nitrile in caso
di allergie).
È consigliato evitare di portare gioielli come braccialetti e, se si lavora senza guanti, non portare anelli,
perché sono una buona fonte di sporcizia, e quindi di contaminazione. Quindi è importante:
36
1. indossare i dispositivi di protezione individuale;
2. lavorare in condizioni di pulizia e ordine più possibile;
3. seguire delle procedure specifiche, che vengono fornite all’operatore.
3.2 Classificazione degli agenti biologici
RISCHIO BIOLOGICO. Prima della manipolazione di un determinato agente biologico è
necessario conoscere il rischio ad esso associato.
Livello di rischio. Viene definito sulla base della capacità che un determinato agente biologico può
avere di causare danni all’uomo: agenti ad alto, medio e basso rischio.
Esistono dei decreti legislativi in cui gli agenti biologici vengono classificati in quattro gruppi a seconda
del rischio. (Decreto Legislativo N° 81/08 - Allegato XLVI: Elenco degli agenti biologici classificati).
1. agente biologico del gruppo 1. Agente che presenta poche probabilità di causare malattie in
soggetti umani;
2. agente biologico del gruppo 2: un agente che può causare malattie in soggetti umani e
costituire un rischio per i lavoratori; è poco probabile che si propaghi nella comunità; sono di
norma disponibili efficaci misure profilattiche o terapeutiche (es. Escherichia coli; Clostridium
Tetani; Herpes simplex virus tipi 1 e 2);
3. agente biologico del gruppo 3: un agente che può causare malattie gravi in soggetti umani e
costituisce un serio rischio per i lavoratori; l'agente biologico può propagarsi nella comunità,
ma di norma sono disponibili efficaci misure profilattiche o terapeutiche (es. virus rabbia; virus
AIDS; virus epatite C)
4. agente biologico del gruppo 4: un agente biologico che può provocare malattie gravi in
soggetti umani e costituisce un serio rischio per i lavoratori e può presentare un elevato
rischio di propagazione nella comunità; non sono disponibili, di norma, efficaci misure
profilattiche o terapeutiche (es. virus Ebola; Virus della febbre emorragica di Crimea/Congo).
3.3 Attrezzature necessarie per colture cellulari.
Tra le apparecchiature indispensabili presenti in un laboratorio microbiologico troviamo:
1. CAPPE (O CABINE) STERILI DI SIUREZZA BIOLOGICA – Sono considerati dei dispositivi di
protezione collettiva. Difatti, sono attrezzature che impediscono la diffusione degli aerosol e
degli schizzi verso l’operatore e l’ambiente esterno. In alcuni casi, tali dispo-sitivi, possono
anche garantire la sicurezza del campione prevenendo (o riducendo al minimo) la possibilità
di contaminazioni esterne e crociate. Le cappe di sicurezza biologica sono inefficaci per i rischi
di natura chimica. In un laboratorio biologico sperimentale si indica comunemente una cappa
di sicurezza biologica come “cappa sterile”.
Funzionamento. Si basa sulla presenza di flusso laminare unidirezionale di aria sterile, filtrato
attraverso dei filtri HEPA. Questo flusso laminare, fa sì che i contaminanti possano essere
allontanati dall’area di lavoro e, soprattutto, la presenza di un flusso laminare evita la forma-
zione di vortici e di conseguenza massimizza l’effetto protettivo del flusso d’aria stesso.
L’efficacia di una cappa sterile dipende dalla presenza dei filtri HEPA (High Efficiency
37
Particulate Air). Tali filtri sono costituiti da fibre di vetro ripiegate più volte (a fisarmonica) in
modo da aumentare la superficie filtrante. Vengono posti in serie, in modo tale da aumentare
la capacità del filtro stesso di allontanare tutte quelle particelle che abbiano una dimensione
superiore a 0,3 µm di diametro. Appunto, l’efficienza è la capacità di tali filtri di trattenere
particelle di 0,3 mm di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%.
Cappe a flusso verticale. La loro efficacia dipende:
a. dal flusso dell’aria,
b. dalla capacità di contenimento,
c. dall’integrità dei filtri HEPA
d. dalla loro posizione nella stanza in relazione alle correnti di aria e ai movimenti del
personale (vanno poste lontano dalle zone di passaggio e da correnti d’aria pro-
venienti da porte, finestre e dall’impianto di aerazione che siano diverse da quelle
create dalla cappa stessa perché tali correnti esterne d’aria potrebbero alterare il
flusso presente nella cappa e ridurre a capacità di funzionamento della cappa stessa).
Esistono tre tipi di cappe di sicurezza biologica a flusso verticale: classe I, classe II e classe III.
a. Classe I – sono dotate di un filtro HEPA allo scarico per proteggere l’ambiente dalla
fuoriuscita di microorganismi. Si basano principalmente sul riciclo dell’aria all’interno;
viene filtrata l’aria in uscita ma non quella in entrata, di conseguenza tale aria circo-
lante immessa all’interno della cappa non è sterile e nemmeno in grado di proteggere
il campione da contaminazione. Tuttavia sono ideate per proteggere l’operatore e
l’ambiente esterno da qualsiasi agente contaminante. Come tutte le cappe a flusso
verticale sono provviste di apertura frontale. La protezione dell’operatore è possibile
grazie al flusso di aria diretto dall’esterno all’interno della cappa attraverso l’apertura
frontale. La protezione dell’ambiente avviene per la presenza di un filtro HEPA nel
sistema di scarico. Sono adatte per impieghi con agenti biologici a basso medio rischio
(agente biologico di classe I). Nello schema di preparazione della cappa di classe I si
possono distinguere:
• Una zona di preparazione, facilmente decontaminabile con pannelli rimovibili;
• Il filtro HEPA di espulsione e di parziale riciclo;
• Un filtro a carbone attivo in caso di riciclo nello stesso locale.
b. Classe II – è una cappa ventilata aperta frontalmente progettata per la protezione:
• dell’operatore
• dei prodotti al suo interno
• dell’ambiente circostante.
Nelle cappe di classe II anche l’aria in ingresso viene filtrata. Queste, infatti, sono
dotate di:
• un filtro HEPA di espulsione dell’aria (come le cappe di classe I);
• un filtro a carbone attivo in caso di riciclo nello stesso locale.
• un filtro HEPA di ricircolo che ne garantisce la sterilità dell’aria che grazie ad un
flusso verticale, cade dall’alto sul campione manipolato sul piano di lavoro.
• una zona per decontaminazione;
38
• un filtro HEPA (è quello più importante perché garantisce la filtrazione dell’area
in entrata).
c. Classe III – Queste cappe consentono di operare con agenti biologici ad alto rischio
(agenti biologici di classe III e IV). Sono cappe ventilate totalmente chiuse a tenuta
d’aria (non presentano alcuna apertura con l’esterno) e mantenute a pressione
negativa, in modo tale che nessun agente presente dentro la cappa possa uscire
all’esterno; e soprattutto, impedisce il contatto diretto tra questo e l’operatore. L’aria
in ingresso passa per un filtro HEPA e quella in uscita passa per due filtri HEPA posti in
serie. Il lavoro viene svolto con guanti a manica in gomma attaccati alla cappa.
Cappe a flusso orizzontale. Una cappa a flusso orizzontale non fornisce protezione all’opera-
tore (che viene investito direttamente dall’aria contaminata proveniente dall’interno della
cappa) e per l’ambiente. Non sono dei dispositivi di protezione collettiva. Il loro utilizzo
all’interno del laboratorio è destinato a quelle situazioni in cui si vuole proteggere unicamente
il campione (a patto che questo sia a basso rischio, o nullo per l’operatore). Generalmente
vengono utilizzate quando si vogliono coltivare delle cellule primarie a partire da cellule di
origine animale; in questo caso, l’unico interesse è quello di proteggere il campione dalla
contaminazione (il flusso orizzontale è quello che garantisce la maggiore protezione). In
alternativa si predilige l’utilizzo di una cappa di classe II (ai fini della protezione dell’operatore),
quando vengono manipolate sostanze con rischio superiore a quello degli agenti di classe I.
Sterilizzazione. A seguito dell’utilizzo di una cappa di classe I, o II , o III è bona norma procedere
con la sterilizzazione delle parti interne della cappa, del piano di lavoro, delle pareti in vetro.
Tale sterilizzazione è necessaria ai fini di eliminare i residui biologici rimasti all’interno della
cappa; viene effettuata mediante l’utilizzo di lampade germicide a UV. Le radiazioni
ultraviolette sono radiazioni elettromagnetiche prodotte dal bombardamento, con elettroni
o con un fascio di raggi catodici, di un bersaglio di metallo pesante (lampade germicide).
Risultano poco penetranti ed agiscono per trasformazione fotochimica delle basi pirimidiniche
del DNA cellulare (danneggiamento del materiale genetico del microorganismo). La steriliz-
zazione con i raggi UV è adoperata soprattutto nei laboratori scientifici per trattare l’aria e
deve avvenire quando i locali trattati non sono utilizzati. Questo perché i raggi UV sono molto
irritanti per le mucose (occhi in particolare).
Uso delle cappe. Affinché le cappe di sicurezza biologica vengano a funzionare come dispositi-
vo di protezione collettiva, è necessario che il loro funzionamento per l’utilizzo nei limiti di
queste cappe vengano spiegati a tutti i potenziali utenti. La cappa non deve essere usata se
non è perfettamente funzionante, in quanto potrebbe non garantire la protezione collettiva.
Quando la cappa (classe II) è in uso, il pannello di chiusura in vetro non deve essere aperto
oltre alla posizione di sicurezza fissata dal costruttore (alterazione del flusso d’aria generato
dalla cappa). Per lavorare sotto cappa è necessario imparare a lavorare in modo da interferire
al minimo con il flusso d’aria e quindi le attrezzature e i materiali nella cappa devono essere
ridotti al minimo e posti in fondo all’area di lavoro. Nella cappa non si devono usare becchi
Bunsen. Il caldo prodotto causa scompensi nel flusso d’aria e può danneggiare i filtri. Tutte le
operazioni devono essere eseguite nel mezzo o in fondo alla superficie di lavoro ed essere
visibili dal pannello di vetro. Il passaggio di cose e persone alle spalle dell’operatore deve
39
essere ridotto al minimo. L’operatore non deve disturbare il flusso d’aria introducendo e
togliendo ripetutamente le braccia.
Buone prassi di lavoro. L’utilizzo di una cappa sterile prevede che vengano seguite alcune
semplici norme di lavoro:
a. Accendere la cappa almeno 10 minuti prima di iniziare a lavorare per essere sicuri che il
flusso possa andare a regime;
b. Posizionare il vetro frontale, se del tipo a scorrimento, all’altezza di sicurezza per
l’operatore (20-30 cm) – in realtà nelle cappe nuove la posizione del vetro frontale è fissa
quindi non necessita di regolazione.
c. Ridurre al minimo il materiale sul piano di lavoro per evitare di alterare il flusso all’interno
della cappa;
d. Operare nella parte media e posteriore del piano di lavoro, poiché nella parte anteriore
non è garantito in quanto questa è molto esterna, e l’operatore con i suoi movimenti
potrebbe alterare il flusso stesso.
e. Rimuovere immediatamente rovesciamenti di materiale biologico, utilizzando della carta
e pulire la cappa stessa per evitare che si formino delle contaminazioni.
f. A lavoro terminato, lasciare la cappa in funzione per 10 minuti, prima di chiuderla, per
consentire al flusso d’aria di “pulire” una eventuale aero-contaminazione dispersa che si
è creata all’interno;
g. Pulizia e disinfezione della cappa ogni volta che si termina il lavoro; si possono utilizzare
come disinfettanti la candeggina od altre soluzioni alcoliche che consentono l’elimi-
nazione degli agenti contaminanti.
h. Chiudere la cappa e accendere la lampada U.V. per effettuare un ciclo di decontami-
nazione; le cappe nuove hanno un sistema automatizzato settabile durante la notte o al
mattino presto in modo tale che all’arrivo dell’operatore la cappa decontaminata è
immediatamente pronta per l’utilizzo
BIOHAZARD. Le cappe di classe IIA sono denominate cappe biohazard dalla normativa del
national federal standard 49 (usa) e sono contraddistinte da dal simbolo in fig 5. Tali cappe
sono attualmente le più utilizzate e garantiscono un’efficace protezione dal rischio biologico.
.
Figura 5. Biohazard.
40
La scelta di una cappa piuttosto che di un’altra dipende dall’agente che deve essere mani-
polato al suo interno, poiché ogni cappa (come precedentemente visto) fornisce un livello di
protezione differente.
Classe Aria in
ricircolo
CARATTERISTICHE IMPIEGHI PROTEZIONE
% operatore Ambiente campione
I
Apertura frontale, il
contenimento è dato
dall’aria esterna
richiamata
dall’apertura frontale.
Filtro HEPA sull’aria in
uscita.
Basso rischio;
micro-
organismi di
gruppo 1-2.
buono
ottimo
Scarso
IIA
70
Apertura frontale che
permette l’ingresso
dell’aria, flusso
laminare verticale
nell’area di lavoro, filtro
HEPA sull’aria in
ingresso e in uscita se
oltre al campione
biologico sono presenti
sostanze mutagene,
cancerogene e
radioattive l’aria deve
essere convogliata
all’esterno.
Medio rischio;
microrganismi
di gruppo 2-3
buona
Ottima
Ottima
IIB 1
30
IIB 2
0
III
Chiusura ermetica,
funzionamento in
pressione negativa,
accesso consentito da
guanti, filtro HEPA
sull’aria in ingresso,
doppio filtro HEPA
sull’aria in uscita.
Elevato
rischio;
microrganismi
di gruppo 4.
ottima
ottima
buona
Livelli si contenimento fisico (PCL). Quando si utilizzano agenti biologici di classe II, non è
sufficiente utilizzare una cappa sterile di casse II o classe III, ma è necessario che vengano
utilizzate delle misure preventive aggiuntive anche sull’ambiente in cui si trova la cappa. In
particolar modo, si devono attuare delle strategie che garantiscano un buon livello di con-
tenimento fisico del materiale biologico all’interno della stanza; tale livello può essere diviso
in varie classi:
a. classe 2 (PCL-2) – prevede che la cappa e l’ambiente di lavoro siano a pressone negativa per
evitare la fuoriuscita di qualsiasi agente biologico;
41
b. classe 3 (PCL-3) – prevede la presenza di una pre-camera a pressione negativa che preceda
la camera in cui vengono effettuate le manipolazioni sul materiale biologico – solitamente,
questo ambiente aggiuntivo serve alla preparazione dell’operatore stesso.
c. classe 4 (PCL-4) - prevede la presenza di una serie di stanze a pressione negativa crescente
che precedono la camera in cui vengono effettuate le manipolazioni sul materiale bio-
logico. L’accesso a tali camere avviene in maniera unidirezionale.
2. INCUBATORI AD ATMOSFERA CONTROLLATA - E’ quello strumento che garantisce le
condizioni corrette di temperatura (28-37 °C), umidità (95%), pressione di anidride carbo-nica
(5-10%) indispensabili alla sopravvivenza della coltura stessa. Bisogna sempre tenere
presente che le colture cellulari necessitano di una fine regolazione su alcuni parametri come
il pH, l’osmolarità e la temperatura; questi, infatti vengono mantenuti dall’incubatore. Gli
incubatori contengono al loro interno una serie di ripiani sui quali possono essere esposti i
contenitori per colture cellulari (flasks, multiwell, dishes ecc), e solitamente sulla parte più
bassa sono provvisti di una bacinella in cui viene posta dell’acqua (con disinfettante) per
garantire la quantità di umidità necessaria all’interno dell’incubatore stesso. Ogni incubatore
prevede la presenza di un sistema a doppia porta, una interna in vetro e un’altra esterna di
materiale differente. La porta interna garantisce la tenuta stagna dell’umidità, della
temperatura e della CO2; mentre quella più interna in vetro permette all’operatore di osserva-
re all’interno dell’incubatore senza dover manomettere la porta esterna. Il sistema elettrico
di cui è dotato, consente all’incubatore di monitorare i parametri sopracitati.
Perché è importante regolare la temperatura? Le cellule sono in grado di crescere ad una
temperatura quanto più simile a quella fisiologica (37°C), talvolta possono sopportare situa-
zioni di ipotermia non inferiore a 28 °C. Difficilmente queste sopportano l’ipertermia, infatti
piccoli aumenti di temperatura per brevi periodi portano a notevoli alterazioni ed in alcuni
casi a morte.
A cosa serve l’umidità? L’acqua posta sulla parte bassa dell’incubatore è di fondamentale
importanza perché garantisce il corretto mantenimento dell’osmolarità della coltura cellu-
lare. Infatti, nel momento in cui vene il materiale viene mantenuto ad una temperatura di
37°C si assisterebbe ad un fenomeno di evaporazione in assenza di umidità. Ciò costituirebbe
una variazione drastica dell’osmolarità all’interno della soluzione.
Cosa accade se mettiamo una piastra contenente le cellule nel medium di coltura in un
incubatore privo di acqua? Durante la coltura cellulare deve essere rispettata la condizione di
isotonicità del terreno. Se il terreno che viene posto è ipertonico si assiste ad un rag-
grinzimento delle cellule; in condizioni di ipotonicità, le cellule catturano molta acqua e
rischierebbero di scoppiare.
Il pH. Il terzo parametro che viene ad essere regolato dall’incubatore è il pH. Precedentemen-
te abbiamo visto come i terreni di coltura sono generalmente addizionati di un sistema tam-
pone bicarbonato per consentire il mantenimento di tale parametro a seguito dell’intenso
metabolismo cellulare che ne acidificherebbe il terreno stesso. Però per poter funzionare, il
sistema tampone deve essere in presenza di determinato parametro pressorio di anidride
carbonica che viene fornita, in questo caso, dall’incubatore. Diminuendo la pressione della
CO2 l’efficacia del tampone si riduce del 75% in meno di 5 minuti.
42
All’interno dell’incubatore c’è una pressione pCO2 pari al 5% che corrisponde alla pCO2
cellulare misurata all’interno dei tessuti. Talvolta l’incubatore può essere anch’esso fonte di
contaminazione batterica, motivo per cui deve essere mantenuto pulito da agenti conta-
minanti attraverso l’utilizzo di soluzioni alcoliche e disinfettanti. Viene, di solito, ridotto il
rischio di contaminazione aggiungendo un agente anti-micotico all’acqua posta all’interno
dell’incubatore (infatti proprio l’acqua è una delle principali fonti di contaminazione). Alcuni
incubatori permettono la possibilità di effettuare un ciclo di sterilizzazione (per un tempo di
24 ore) in assenza del campione poiché ciclo di sterilizzazione, solitamente, è di tipo termico.
Altri tipi di incubatori hanno la parte interna fatta in rame, in quanto questo è un agente
antimicrobico naturale.
3. BAGNO TERMOSTATATO AD ACQUA (BAGNOMARIA) – consente di scaldare e portare ad
una temperatura di 37°C (temperatura pari a quella dell’incubatore) i terreni e tutto ciò che
deve essere messo a contatto con le cellule.
4. MICROSCOPI OTTICI – È un microscopio rovesciato a contrasto di fase che permette di
osservare la coltura cellulare e di valutarne:
a. Stato di proliferazione;
b. Stato di salute;
c. Parametri morfologici;
d. Parametri fisiologici delle colture;
e. Presenza di agenti contaminanti.
5. CENTRIFUGA – Le centrifughe sono molto utilizzate per le colture cellulari, per il
mantenimento, il congelamento/scongelamento ed il frazionamento subcellulare. Servono
principalmente a separare le cellule ad un mezzo fluido attraverso una blanda accelerazione
centrifuga di 300 giri per 5 minuti, che permette la sedimentazione delle cellule ma non il loro
danneggiamento. L’operazione di centrifugazione viene effettuata diverse volte durante la
coltivazione di una linea cellulare; basti pensare che nel momento in cui si effettua una
subcultura, il protocollo spesso prevede l’aggiunta di un agente di tipo enzimatico che con-
sente di staccare le cellule dal substrato. Una volta effettuata tale operazione è necessario
rimuovere l’agente enzimatico grazie all’utilizzo di una centrifuga. Un altro step in cui potreb-
be essere utile l’utilizzo di centrifuga per rimuovere il crioprotettore (durante lo scongela-
mento) o per concentrare le cellule per poterle in seguito congelare. Le centrifughe hanno il
grosso svantaggio di essere degli strumenti in cui possono venire a generarsi delle contamina-
zioni. Infatti, per loro natura le centrifughe producono aerosol, per minimizzare i rischi sono
spesso dotate di coperchi trasparenti per controllare l’interno senza aprire e vanno pulite
molto frequentemente da parte dell’operatore prima e dopo l’utilizzo. L’apparecchio deve
essere ben bilanciato prima di far partire il giro di centrifugazione per garantire un corretto
funzionamento della centrifuga stessa, al fine di impedire lo sversamento di liquido biologico
al suo interno.
6. PLASTICHERIA E VETRERIA – In un laboratorio di colture cellulari è indispensabile tutta una
serie di materiale in plastica o in vetro. Il vetro normale/pyrex (vetro borosilicato è un
materiale robusto resistente agli sbalzi termici e con un basso coefficiente di dilatazione). Gli
strumenti in vetro possono essere provvisti di scala graduata. Lo strumento principale che
43
possono essere utilizzate sono le pipette Pasteur (opportunamente sterilizzate prima
dell’utilizzo). Talvolta si predilige l’utilizzo di plastica consumabile (monouso)che viene
acquistata già sterile dal produttore, attraverso l’utilizzo di radiazioni ionizzanti. Tali radiazioni
sono fotoni ad elevata energia. Le radiazioni ionizzanti agiscono trasferendo la loro energia
all’interno della cellula colpita, la cui sensibilità è proporzionale alla quantità di DNA presente,
che viene alterato. In un laboratorio per colture cellulari, normalmente, vengono utilizzati dei
pipettatori che permettono di prelevare una certa quantità di liquido e dispensarlo all’interno
dei contenitori per colture cellulari. Molto utilizzate sono anche le micropipette.
3.4 Cura e mantenimento del laboratorio
Per operare in maniera corretta all’interno di un laboratorio per colture cellulari è necessario man-
tenere l’ambiente quanto più pulito possibile, per cercare di ridurre al minimo il rischio di contamina-
zione. Altro accorgimento importante è quello di controllare spesso il livello dell’acqua nell’incubato-
re per assicurarsi che venga mantenuto costante il livello di umidità all’interno dell’apparecchio. Per
mantenere l’ambiente di lavoro pulito, le superfici (banconi, pavimenti e pareti) presenti in
laboratorio devono essere lisce e facili da pulire. Devono essere resistenti all’acqua e resistenti a
diverse sostanze chimiche (acidi, alcalini, solventi e disinfettanti). Negli ambienti dove viene utilizzato
l’azoto liquido il pavimento deve essere resistente alla sostanza.
3.5 Aspetti di sicurezza delle colture cellulari
Sul sito www. Europe.osha.eu.int si possono leggere tutte le direttive europee per la salute e la sicu-
rezza sul lavoro (in cui sono indicate anche le direttive di lavoro in un laboratorio). La valutazione del
rischio deve essere intrapresa prima di iniziare un’attività. È importante identificare e valutare un
rischio associato ad un determinato agente biologico, in modo tale da poter definire quali sono le vie
efficaci volte a minimizzare tale rischio.
Rifiuti biologici. Un altro aspetto importante è il corretto smaltimento dei rifiuti biologici (rifiuti che
si sono generati per contatto con il materiale biologico. I rifiuti biologici devono essere smaltiti
secondo la normativa nazionale in appositi contenitori (ecobox). Il colore che indica il rischio infettivo
ed il pericolo biologico è il colore giallo.
3.6 Sterilizzazione del materiale per le colture cellulari
Le colture cellulari necessitano di condizioni di sterilità. E’ necessario che tutto il materiale utilizzato
(e che deve entrare a contatto con le colture cellulari) sia sterile.
Differenza tra sterilizzazione e disinfezione. Per sterilizzazione si intende la distruzione o
eliminazione di tutte le forme viventi; per disinfezione, invece, ci si riferisce all’eliminazione degli
agenti capaci di causare infezione o malattia.
Importanza della sterilizzazione. Tale pratica è molto importante perché gli agenti inqui-nanti
possono andare ad alterare la normale crescita di una coltura cellulare, perché questi sono in grado
di sottrarre nutrienti al terreno di crescita. Avendo un metabolismo molto più rapido rispetto alla
coltura cellulare di mammifero, solitamente, i batteri tendono ad acidificare il medium rapida-mente
44
e soprattutto producono metaboliti che possono essere tossici per le cellule. Se è presente una
contaminazione all’interno della coltura cellulare allora i risultati non saranno attendibili e quindi
bisognerà partire da zero.
Tecniche di sterilizzazione. Variano a seconda del materiale che deve essere sterilizzato.
Le soluzioni, generalmente, vengono sterilizzate mediante calore o filtrazione utilizzando appositi
filtri con pori del diametro di 0.2mm (capaci di trattenere tutte le particelle di diametro superiore).
La sterilizzazione del materiale solido è fatta mediante calore. La sterilità del materiale monouso è
stata fatta, all’atto della produzione, utilizzando radiazioni uv, raggi gamma o ossido d’etilene.
Sterilizzazione mediante calore (più utilizzata). Il calore è considerato il mezzo più sicuro, rapido ed
economico per qualsiasi materiale che non sia termolabile. Il tempo di sterilizzazione decresce con
l’aumentare della temperatura. Il calore può essere usato essenzialmente in due modi:
1. Secco (incenerimento, stufa);
a. Incenerimento. Si realizza attraverso la fiamma del Bunsen, che oggi ha impieghi limitati
perché il rischio fisico associato a tale metodologia è abbastanza elevato (infatti per la
ricurezza dell’operatore è consigliato di non utilizzare fiamme libere all’interno dell’am-
biente di laboratorio). Trova impiego nella sterilizzazione di strumenti di laboratorio
metallici (anse, aghi), pipette di vetro per aspirare il medium dalle piastre.
b. Stufa di calore. Trova impiego nella sterilizzazione della vetreria, di ferri chirurgici (per la
preparazione di colture primarie). Utile per materiale termoresistente, non corrode. La
sterilizzazione in stufa, richiede tempistiche più lunghe. Generalmente le stufe di calore
sono apparecchi con al loro interno una serie di ripiani sui quali viene alloggiato il materia-
le da sterilizzare; sono dotate di un sistema di regolazione della temperatura che consente
la regolare la temperatura per il riscaldamento iniziale e di impostare la fase di regime.
2. Umido (ebollizione, autoclave). Viene ottenuta principalmente all’interno i strumenti che
prendono il nome di autoclave.
a. Autoclave. Utilizza vapore ad una temperatura di 121 °C alla quale le più resistenti spore
batteriche vengono distrutte in 5-10 min. Un’autoclave può essere immaginato come una
sorta di pentola a pressione che può essere, in alcuni casi, molto semplice come realiz-
zazione e come utilizzo oppure prevedere un sistema di riciclo dell’aria molto più com-
plesso. Trova impiego nella sterilizzazione di materiale di vetro, materiale in gomma o
plastica (resistenti alla temperatura), ferri chirurgici (per la preparazione di colture pri-
marie), soluzioni acquose, terreni di coltura in brodo o agarizzati, purché privi di sostanze
deperibili alle alte temperature (es. Siero). Se le soluzioni sono sterilizzate in contenitori
sigillati, bisogna aspettare molto tempo prima di aprire l’autoclave per consentire un
sufficiente raffreddamento ed evitare esplosioni.
In entrambi i casi l’azione biocida del calore deriva dall’ossidazione dei costituenti cellulari con
denaturazione irreversibile degli enzimi e delle strutture proteiche. La sensibilità del calore varia in
rapporto al loro contenuto in acqua: più questa è alta, più sensibili sono i microrganismi al calore. Il
vapore è un migliore conduttore termico rispetto al calore secco, quindi a parità di temperatura, la
sterilizzazione è raggiunta in un tempo minore. Le sostanze volatili e i solventi (etanolo, isopropanolo,
acetone, fenolo, alcol isoamilico, formaldeide, formammide, guanidina isotiocianato) non devono mai
45
essere messe né in autoclave né in stufa. Le temperature e i tempi di sterilizzazione dipendono dal
metodo utilizzato.
TEMPERATURE E TEMPI DI STERILIZZAZIONE
Metodo di sterilizzazione Temperatura (°C) Tempo (min) Pressione (atm)
STUFA
140
150
160
170
180
150
120
60
AUTOCLAVE
112
121
134
30
15
10
+ 0,5
+ 1
+ 2
In qualunque processo di sterilizzazione effettuato col calore si possono individuare tre fasi distinte,
in cui la temperatura del sistema varia:
1. fase di riscaldamento (iniziale) - fase in cui si osserva l’aumento della temperatura ma che
non dà luogo alla sterilizzazione; infatti è importante che lo strumento arrivi alla temperatura
impostata e solo a quella temperatura si inizia a calcolare il tempo necessario;
2. fase di regime – fase in cui avviene effettivamente la sterilizzazione poiché tutto il materiale
è esposto ad una temperatura costante per un tempo definito;
3. fase di raffreddamento - tale fase è una fase di riassestamento, che consente al materiale di
tornate alla temperatura ambiente.
P
0 t
Riscaldamento Sterilizzazione Scarico Asciugatura
Figura 6. Processo di sterilizzazione.
46
Al termine del processo è possibile verificare se la sterilizzazione è avvenuta correttamente. Esistono
dei sistemi di rilevazione molto semplici che consistono in dei nastri adesivi contenenti al loro interno
delle parti termosensibili che cambiano colore al raggiungimento della temperatura desiderata. Ci
sono nastri per la sterilizzazione a secco e per quella in autoclave. Esistono anche dei sistemi più
tecnologici per determinare l’efficienza del processo di sterilizzazione; infatti questi non sono altro
che delle bande cangianti a seconda se il processo di sterilizzazione si avvenuto o meno.
3.7 Contaminazioni delle colture cellulari
Le principali cause di contaminazione delle colture cellulari sono rappresentate da batteri, lieviti,
muffe, micoplasma e cross-contaminazione da parte di altre cellule. Come si è detto in precedenza, i
problemi delle contaminazioni sono dati dalla:
1. competizione da parte delle cellule contaminanti per i nutrienti del terreno di crescita;
2. secrezione di sostanze acide/alcaline, o tossiche (es. perossido di idrogeno – H2O2) che
alterano la crescita;
3. degradazione di arginine e purine portando all’inibizione della sintesi degli istoni e degli acidi
nucleici;
Batteri. I batteri sono facilmente individuabili al microscopio a contrasto di fase, poiché questi
vanno a modificare una serie di parametri di crescita della coltura cellulare.
Lieviti. Possono avere forme svariate, di solito sono molto piccoli e di colore scuro. La loro forma “a
catenella” è il risultato di una crescita per colonie; tali catenelle risultano rifrangenti se osservate al
microscopio.
Micoplasma. È una delle contaminazioni più frequenti e subdole per le coltivazioni cellulari. Infatti, a
differenza degli altri due classi di microrganismi sopra citati, non può essere osservata al micro-scopio
ottico ma necessita di altri sistemi di rilevazione. I micoplasmi sono dei batteri molto piccoli (0.2 to
0.3 μm in diametro) le cui dimensioni risultano inferiori rispetto ai filtri per i terreni cellulari. Sono gli
organismi più piccoli del regno animale, privi di parete cellulare (questo costituisce una grossa
variabilità della morfologia cellulare) e con una capacità proliferativa accentuata e un genoma di solo
600-2200 kb. Secondo tali caratteristiche si rivelano essere gli organismi più pericolosi dei sistemi
cellulari di laboratorio, per via della loro difficoltà di eliminazione. Di solito quando si osserva una
contaminazione da micoplasma, l’unica strategia che si può attuare è quella di eliminare la coltura
cellulare contaminata e di ripartire da uno stock non contaminato.
COME RILEVARE LE CONTAMINAZIONI. I metodi che permettono di intuire la pre-senza di un
contaminante all’interno della coltura cellulare sono diversi, partendo dall’osservazione al
microscopio ottico. Questo permette all’operatore di identificare la presenza di un agente contami-
nante, anche quando questo è un micoplasma attraverso le variazioni della normale crescita delle
cellule che vengono osservate:
1. variazioni della curva di crescita;
2. cambiamenti di tipo morfologico delle cellule in coltura;
3. ridotta adesione (molto spesso a causa di micoplasma);
4. comparsa di cellule che presentano vacuoli;
5. sofferenza generale delle cellule contaminate.
47
I sistemi che consentono di individuare le contaminazioni (quando queste sono macroscopiche),
prevedono l’osservazione di alcuni parametri che sono sostanzialmente delle alterazioni nel terreno
di crescita:
1. comparsa di torbidità;
2. cambiamenti nella velocità di crescita;
3. viraggio improvvisto dell’indicatore del pH (utilizzando il rosso fenolo, se si assiste ad un cam-
bio di colore da rosso a giallo può determinare la presenza di un agente contaminante);
4. riotta adesione;
5. presenza di cellule multinucleate;
6. vacuolizzazione delle cellule;
7. corpi di inclusione;
8. lisi cellulare.
Lieviti, batteri e fungi mostrano effetti visibili sulla coltura (cambiamento torbidità e pH del medium) e possono essere visti al microscopio. Come rilevare una contaminazione da Micoplasma. Il Micoplasma può essere rilevato per staining
diretto del DNA con un intercalante fluorescente del DNA (Hoechst 33258). La colorazione che si
ottiene avrà un differente esito a seconda se le cellule siano contaminate o meno da micoplasma. Se
le cellule non sono contaminate, l’agente intercalante colorerà solamente i nuclei delle cellule;
mentre in presenza di una contaminazione da micoplasma, tale agente si intercala anche nel DNA del
micoplasma e si ottiene la tipica colorazione “a cielo stellato” in cui si osservano i nuclei delle cellule
di dimensioni maggiori e a fianco piccole macchie di fluorescenza che caratterizzano la presenza
dell’agente contaminante. Tuttavia, esiste una tecnica più efficace per osservare la presenza di mico-
plasma, ovvero la PCR. Per effettuare la PCR, l’operatore di avvale di specifici kit in cui vengono forni-
ti i reagenti (primer) specifici per il DNA del micoplasma. Si preleva una piccola aliquota del terreno
di crescita, e si scalda portando a bollore per circa 10 min in modo da denaturare il DNA cellulare e
successivamente si aggiungono i reagenti specifici all’interno del kit. Alla fine della PCR è necessario
eseguire l’elettroforesi su gel e osservare il risultato ottenuto. Se è presente il micoplasma si ottiene
una banda di amplificato, in caso contrario non apparirà alcuna banda. Il modo migliore per eliminare
una contaminazione è buttare via la linea cellulare, sterilizzando tutto e ripartendo da una linea
cellulare non contaminata.
48
4. Colture batteriche
La scelta di coltivare e studiare i batteri nasce dal fatto che queste cellule procariotiche sono molto
semplici, e si sono rivelate fondamentale importanza per lo studio di determinati aspetti della biologia
molecolare piuttosto che della biochimica. Tali cellule possono essere utilizzate per ingegnerizzare
colture di cellule di mammifero.
4.1 Utilizzo di colture di batteri in biologia molecolare
La maggior parte degli studi condotti e delle scoperte fatte in merito alla sintesi, alla replicazione e
su diverse vie metaboliche cellulari sono stati ottenuti su queste cellule proprio per la loro semplicità.
Le cellule procariote utilizzate per la produzione (librerie genomiche, cromosomiali, a DNA
complementare), esoprattutto l’amplificazione, di DNA geneticamente modificato, quindi subclonag-
gio di cDNA. Infine possono essere utilizzate per la produzione di proteine.
Vantaggi e svantaggi sull’uso di cellule procariotiche. I principali vantaggi dell’utiliz-zo di
cellule batteriche rispetto alle cellule eucariotiche sono:
1. Facilità di crescita su terreni di coltura sia solidi che liquidi in grosse quantità per via dei tempi
di replicazione molto più rapidi delle cellule eucariotiche;
2. Maggiore economicità;
3. Il genoma batterico è facilmente modificabile (con vettori contenenti DNA Ricombinante) e
tale modifica apportata può essere amplificata con estrema facilità e rapidità.
Gli svantaggi nell’utilizzo delle colture batteriche sono legati soprattutto al loro utilizzo nella produ-
zione di proteine; infatti i batteri sono in grado di effettuare le modiche post-traduzionali e di
conseguenza la proteina prodotta potrebbe risultare inattiva.
Batteri più utilizzati. Uno dei batteri più utilizzati sia per la produzione di proteine che di
materiale genetico è l’Escherichia Coli. La maggior parte deriva dal ceppo E.Coli K-12. È un micro-
organismo caratterizzato da un genoma che è costituito da cromosoma circolare di 4 milioni di bp
(paia di basi). L’E-coli, cresce rapidamente in medium minimale con glucosio (fonte di carbonio ed
energia), sali (fonte di azoto, fosforo, metalli pesanti). Inoltre, la sua crescita è estremamente favorita
in medium ricchi contenente tutti gli amminoacidi essenziali, precursori di nucleotidi, vitamine ecc.
ESEMPIO DI MEDIUM MINIMALE ESEMPIO DI MEDIUM RICCO
M9 medium (per litro) 6 g Na2HPO4 3 g KH2PO4 1 g NH4Cl 0.5 g NaCl 1 ml di 1M MgSO4 7H2O 10 ml 20% glucosio (o glicerolo)
Luria Bertani (LB) Broth per litro 10 g tryptone 5 g estratti di lievito 5 g NaCl 1 ml di 1N NaOH
49
E’ il terreno di crescita ricco è più utilizzato. I Sali disciolti hanno la stessa funzione del medium
minimale, ovvero servono a garantire che la soluzione in cui viene coltivato il microrganismo sia iso-
tonica. Il tryptone è un digerito pancreatico della caseina (proteina abbondante nel latte) e fornisce i
peptidi essenziali alla crescita dei batteri. Gli estratti di lievito sono ottenuti attraverso un processo
di digestione di particolari colture di lieviti, successivamente essiccati ed indotto un processo di
autolisi delle membrane (che porta alla liberazione di enzimi digestivi che vanno a degradare soprat-
tutto le componenti solubili presenti all’interno dei lieviti); tali estratti sono una fonte essenziale di
amminoacidi, proteine, zuccheri e acidi nucleici. Al fine di migliorare tale estrazione e far sì che i
componenti risultino solubili si procede alla separazione allontanando i residui delle membrane. È
possibile acquistare LB già pronto in polvere, da disciogliere in acqua distillata. Si raccomanda di
sterilizzare con calore umido (autoclave) la soluzione ottenuta.
4.2 Crescita dei batteri
I batteri possono crescere in modo ubiquitario sia in terreno solido che liquido; in entrambi i casi la
temperatura di coltura si aggira intorno ai 37°C. A differenza delle colture cellulari eucariotiche, non
è necessaria la regolazione degli scambi gassosi (CO2), ma è sufficiente disporre di una camera calda
(incubatore) per facilitarne la crescita.
Figura 7. Curva di crescita di batteri.
L’andamento della curva di crescita è perfettamente identico a quello delle cellule eucariotiche.
Quello che cambia sostanzialmente è il tempo necessario a raddoppiare il numero di cellule che, ne
caso dei batteri, è molto più rapido (infatti viene espresso in termini di minuti anziché giorni come
50
per le cellule di mammifero). Come per le cellule eucariotiche di mammifero, anche le colture
batteriche (soprattutto in coltura liquida) seguono un ciclo di crescita che prevede tre fasi:
1. Fase LAG (o di latenza) - è la fase iniziale in cui si osserva un primo adattamento al terreno in
cui le divisioni sono ridotte.
2. Fase LOG (o di crescita esponenziale) – si inizia ad entrare in fase log, quando si osserva una
replicazione ogni circa 20-30 min, fino al raggiungimento di un livello esponenziale di crescita
(early, middle, late log phase);
3. Fase stazionaria (o di saturazione) – si raggiunge quando avviene il consumo dei nutrienti
essenziali presenti nel terreno di coltura ed iniziano ad accumularsi le sostanze tossiche
prodotte.
4.3 Colture batteriche solide e liquide
COLTURE BATTERICHE LIQUIDE. Vengono seminati pochi batteri in un terreno molto ridotto
(2-3 mL di coltura liquida); tale sospensione viene incubata a 37°C per 24 ore. In questo primo
passaggio si realizza la fase di adattamento (Fase LAG). Nel momento in cui i batteri passano alla fase
logaritmica (FASE LOG) vengono amplificati diluendo la sospensione di partenza con più terreno,
rilanciando la crescita per un’altra notte. Durante questo primo step è molto importante controllare
la crescita batterica attraverso due diverse metodiche:
1. osservare la coltura attraverso un vetrino di conteggio al microscopio ottico.
2. attraverso uno spettrofotometro si va a leggere il valore di assorbanza della sospensione
batterica a 600 nanometri (OD600). La formula che permette di calcolare la densità cellulare a
partire dall’OD600 è la seguente: OD600 = 1 corrisponde a circa 8x108 cellule/ml.
I batteri che crescono in coltura liquida, di solito, vengono cresciuti all’interno di beute con terreno
di coltura di tipo LB (precedentemente sterilizzato in autoclave). Le beute solitamente, non vengono
sigillate ermeticamente ma vengono chiuse in maniera blanda per consentire l’ossigenazione delle
colture. Le beute con al loro interno le colture batteriche vengono poste su di un agitatore che
consente di mantenere la coltura in continua agitazione (anche riscaldata) per tutto il tempo della
crescita. Questo è importante, così come per tutte le colture cellulari liquide, per garantire una cor-
retta ossigenazione anche dei tessuti o delle cellule più interne alla coltura. Questo tipo di coltura ci
permette di ottenere un numero elevato di cellule batteriche in coltura.
COLTURE BATTERICHE SOLIDE. I batteri che vengono coltivati in coltura solida quando non è
necessario ottenerne grandi quantità, ma invece è di interesse quando si vuole andare a se- parare
una colonia dall’altra. Difatti viene molto utilizzata la coltura solida nel momento in cui un
determinato ceppo batterico viene geneticamente modificato e quindi si ha l’esigenza di separare
quei batteri di interesse rispetto a quelli non modificati. Le colture batteriche solide vengono genera-
te utilizzando dei terreni in partenza liquidi (LB) ai quali viene addizionato un agente gelificante (1.5%
di agar). L’agar è il più noto agente gelificante, un polisaccaride che deriva da un’alga marina, costitui-
to sostanzialmente da zuccheri. Nel momento in cui questo viene addizionato al LB e fatto solidificare
all’interno di un contenitore (es. dishes del Petri). Dopo che la gelificazione è avvenuta, si ottiene uno
strato di LB solido su cui poter seminare i batteri di interesse. Nel momento in cui si vuole andare a
selezionare un clone con specifiche caratteristiche piuttosto che un altro, il terreno viene addizionato
51
con dei marcatori selettivi (termolabili) che consentono all’operatore di individuare quale delle
colonie presenti è quella che esprime la mutazione di interesse. Una volta selezionato il ceppo mutato
è possibile passarlo in coltura liquida per poterlo amplificare.
4.4 Conservazione dei batteri
Anche i batteri, come le cellule di mammifero, possono essere conservate efficacemente attraverso
congelamento. Durante tale fase viene addizionato il crioprotettore. Rispetto alle cellule di mammi-
fero, quelle batteriche non vengono mantenute a temperature così basse, difatti non si utilizza l’azoto
liquido ma possono essere mantenuti ad una temperatura di -80°C. Di solito si predilige l’utilizzo di
glicerolo al 30% anziché DMSO al 7%. Come si è visto in precedenza il glicerolo e il DMSO sono sos-
tanze a diversa composizione chimica che hanno in comune elevata solubilità in acqua e tossicità
dipendente dalla concentrazione di utilizzo. La loro azione protettiva si esplica in vari modi:
1. con un’azione diretta sulla membrana cellulare;
2. si sostituiscono all’acqua e diminuiscono la formazione dei cristalli di ghiaccio;
3. abbassano il punto di congelamento della soluzione e permettono una maggiore disidra-
tazione delle cellule durante il congelamento lento.
4.5 Trasformazione dei batteri
Un batterio può essere modificato, attraverso l’inserimento di DNA esogeno all’interno di un pro-
cariote e, di conseguenza, sfruttato per amplificare tale modifica apportata. Per far avvenire tale
operazione è necessario rendere il batterio competente alla trasformazione; in sostanza, è necessario
apportare delle modifiche sia alla sua membrana, e se è provvisto di parete anche su quest’ultima, in
modo tale da renderle permeabili all’ingresso di molecole di DNA al suo interno. Ovviamente, in
condizioni normali, una membrana plasmatica non è assolutamente permeabile al DNA poiché
quest’ultimo è carico negativamente e lo strato esterno della membrana è idrofobico; quindi le due
strutture sono tra loro incompatibili. La tecnica più utilizzata per rendere il batterio competente alla
trasformazione è quella di andare a sottoporre quest’ultimo ad una soluzione di cloruro di calcio
(CaCl2) che modifica le caratteristiche della membrana. Purché la tecnica si dimostri efficace, è ne-
cessario che la coltura di E. coli si trovi all’inizio della fase logaritmica (fase che determina, in linea
generale, una maggiore riproducibilità degli esperimenti). Infatti, qualora vengono apportate modi-
fiche cellulari a livello genico (introduzione di DNA esogeno reso permeabile alla membrana) all’inizio
della fase logaritmica è possibile selezionare e amplificare, con maggiore successo, le colonie bat-
teriche che hanno integrato tale mutazione. Il processo di trasformazione dei batteri si divide in tre
fasi: 1) preparazione con CaCl2 e 2) trasformazione.
① PREPARAZIONE DELLE CELLULE COMPETENTI CON CALCIO CLORURO.
1. Si parte generalmente da una colonia singola di E. coli (TOP10 o DH5a), cresciuta in un volume
molto ridotto di LB (10 ml), procedendo con il “lancio della coltura” (si fa partire la coltura di
crescita batterica) in incubazione a 37°C per una notte.
2. Il giorno successivo viene presa una piccola aliquota (circa100m) e inoculata in 50 ml di LB e
si fa crescere a 37°C, seguendo l’assorbanza di crescita (OD600).
52
3. Quando l’assorbanza di crescita OD600 è uguale 0,5 sta a significare che la coltura cellulare si
trova in fase logaritmica precoce (early log phase), periodo ottimale per la preparazione delle
cellule competenti. Si fa raffreddare in ghiaccio per 5 min (allo scopo di rallentare o arrestare
la crescita) e successivamente recuperare i batteri della sospensione per centrifugazione.
4. Si va a risospendere il pellet di batteri in 10ml di CaCl2 freddo (60mM CaCl2, 15% di glicerolo)
e centrifugare. Il calcio cloruro ha la funzione di formare dei piccoli precipitati che si deposita-
no sulla membrana cellulare del batterio, e nel momento in cui si inserisce DNA esogeno, il
CaCl2 andrà a mascherare le cariche negative del DNA e favorire il suo ingresso all’interno
della cellula batterica.
5. La soluzione viene risospesa in 500µl di CaCl2 freddo.
6. Vengono fatte delle aliquote da 100ml e crioconservate a -80°C (le cellule rese competenti
restano tali per circa tre mesi).
② TRASFORMAZIONE DELLE CELLULE COMPETENTI. Le cellule competenti ottenute con la tecnica
del calcio cloruro possono essere utilizzate per l’inserimento del DNA esogeno di nostro interesse in
modo tale che poi, nel momento cui queste cellule vengono amplificate, è possibile ottenere una
quantità sufficiente di DNA che servirà successivamente a modificare le cellule eucariotiche.
1. A 100µl di cellule competenti in CaCl2 freddo aggiungere circa 10-20 ng di DNA plasmidico; 2. La sospensione viene incubata in ghiaccio per circa 30 minuti. 3. La sospensione viene incubata a 42°C per 2 minuti, temperatura utile non solo per la soprav-
vivenza del batterio, ma anche perché tale temperatura aumenta la permeabilità della
membrana (la rende più lassa) e favorisce l’ingresso del DNA che si è depositato sul suo
versante esterno. Trascorsi 2 minuti circa, si raffredda in ghiaccio in modo da provocare un
forte shock termico. Quest’ultima operazione serve a ripristinare la condizione della mem-
brana (dopo l’ingresso del DNA plasmidico), che rimanendo permeabile, potrebbe risultare
tossica per il batterio.
4. Si centrifuga e si risospende il pellet di batteri in 400µl di LB sterile e si fa crescere per 1 ora
sotto agitazione a 37°C (225 rpm) per garantire la massima ossigenazione di tutta la coltura
batterica).
5. Si centrifugare e si risospende nuovamente il pellet di batteri in 50µl di LB sterile e piastrare
su piastre di agar/LB (terreno solido) in modo da separare il più possibile un batterio dall’altro
per ottenere delle colonie singole. Al terreno di crescita viene aggiunto un antibiotico per la
crescita selettiva (amp, kana ecc) utile per l’ottenimento di una colonia singola da poter
amplificare. Normalmente, quando si vuole ottenere una trasformazione batterica con un
particolare gene di interesse è necessario verificare la presenza di un gene che codifichi per
una resistenza verso un antibiotico tra quelli addizionati al terreno. Solo così è possibile far
crescere selettivamente sul terreno di coltura solamente quei batteri che hanno acquisito le
caratteristiche genetiche di nostro interesse. In caso contrario, gli altri batteri non saranno in
grado di produrre resistenza ad un antibiotico e di conseguenza non sopravvivono.
6. Al momento in cui viene effettuata la semina, questa verrà incubata per una notte intera alla
temperatura di 37°C.
7. Il giorno successivo bisogna osservare la presenza d colonie di crescita dei batteri.
53
4.6 Amplificazione dei batteri
Alla trasformazione segue l’amplificazione delle specie batteriche che hanno mostrato le carat-
teristiche genetiche di interesse. Si selezionano una o più singole colonie e si trasferiscono, attraverso
uno strumento di plastica sterile, toccando una colonia batterica con la punta dello strumento
(picking) e, successivamente, questa viene immersa in LB liquido autoclavato. La coltura ottenuta
viene fatta crescere in agitazione tutta la notte a 37°C. Il passaggio successivo consiste nell’estrazione
del DNA esogeno di interesse.
4.7 Estrazione del DNA plasmidico dai batteri
L’estrazione si basa sul principio della lisi alcalina di una opportuna quantità di batteri trasformati
(cresciuti o/n a 37°C), la successiva separazione del DNA plasmidico su una resina e l’eliminazione
delle proteine, RNA, eventuali agenti contaminanti, ecc. Il DNA alla fine viene lavato, staccato dalla
resina e risospeso in H2O sterile. Attraverso dei kit commerciali (nei quali viene fornita una particolare
resina ad alta affinità per il DNA plasmidico) è possibile eseguire questa operazione isolando il
materiale genomico da tutto il resto. Il protocollo che regola la procedura di estrazione si divide in
diverse fasi:
1. Si parte da una colonia singola, ottenuta dalla trasformazione dei batteri, che viene inoculata
in 5 ml di LB e si fa crescere per 2 ore a 37°C. Si utilizza un volume abbondante del terreno di
crescita allo scopo di far permettere la crescita abbondante della colonia selezionata in modo
tale da ricavare una cospicua quantità di genoma in esame.
2. Trasferire i 5ml in 500ml di LB sterile contenente antibiotico di selezione e fare crescere per
una notte a 37°C. Una volta cresciuti, i batteri, devono essere pellettati per centrifugazione
(circa 3000 rpm per 30 minuti a 4°C).
3. Successivamente il pellet viene risospeso in un buffer di risospensione (contenete TrisCl, EDTA
ed RNAsi). L’RNAsi è importante durante il processo di lisi cellulare degrada selettivamente
l’RNA per far sì che si ottenga solo il filamento del DNA plasmidico.
4. Viene aggiunto un buffer di lisi (contenente NaOH e SDS) e incubare a RT per 5 minuti. La soda
(NaOH) e l’SDS vanno a degradare le membrane e la parete (qualora fosse presente) e
consentono la precipitazione del DNA genomico (completamente denaturato).
5. Attraverso l’aggiunta di un buffer di neutralizzazione (contenente potassio acetato) si assiste
alla precipitazione delle proteine e del DNA genomico. Si lascia in incubazione in ghiaccio per
20 minuti.
6. La sospensione viene centrifugata a 20000g a 4 °C per 30 minuti, allo scopo di eliminare il
pellet costituito principalmente dalle membrane e da altri detriti cellulari; mente in soluzione
restano le proteine e gli acidi nucleici.
7. Caricare il surnatante su una colonna contenente una resina a scambio ionico ad alta affinità
per gli acidi nucleici (nello specifico per il DNA plasmidico che essendo denaturato tende a
precipitare e ad addensarsi sulla colonna).
8. E’ necessario lavare la colonna per due volte con buffer a concentrazione salina media, in
modo tale da eliminare qualsiasi contaminante del DNA plasmidico.
54
9. Eluizione del DNA aggiungendo un buffer ad alti Sali che compete con la resina a scambio
ionico per il legame con il DNA plasmidico.
10. La soluzione che contiene il DNA viene addizionata ad isopropanolo che facilita la
precipitazione del DNA stesso. L’ispropanolo viene aggiunto lentamente, assistendo alla
formazione di una soluzione bifasica.
11. Far precipitare il DNA aggiungendo miscelare per inversione subito prima di centrifugare (a
15000g) a 4 °C per 30 minuti.
12. Il pellet di DNA ottenuto viene lavato con con 5ml di EtOH (etanolo) al 70% eliminando delica-
tamente il surnatante.
13. Centrifugare a 15000g a 4 °C per 10 minuti.
14. Eliminare con delicatezza il surnatante e asciugare il pellet ottenuto all’aria.
15. Risospendere il pellet in un opportuno volume di acqua.
4.8 Ceppi batterici: E.coli TOP 10
Le cellule competenti possono essere anche acquistate già pronte “One Shot” (che si possono
utilizzare una sola volta perché se replicate perdono la competenza). I ceppi batterici utilizzati in
laboratorio sono geneticamente modificati per ottimizzare le rese di produzione di plasmidi/proteine.
Uno dei ceppi più utilizzati è l’E. coli TOP 10. L’esigenza della modificazione genetica nasce dal fatto
che i batteri hanno sviluppato un sistema degradativo che permette loro di difendersi dall’ingresso
di DNA esogeno e quindi questo non viene amplificato. Sui ceppi batterici che vengono veduti viene
ne viene indicato il loro fenotipo e il genotipo di utilizzo. In questi genotipi sono indicati espres-
samente i singoli geni batterici deleti per far sì che il batterio non sia in grado degradare il DNA di
interesse. In particolar modo, vengono deleti tutti quei geni che attivano le metilasi, ovvero enzimi
che riconoscono e digeriscono il DNA metilato (con gruppi metilici in particolari siti); oppure ad
esempio quei geni che codificano per enzimi di restrizione, come EcoKI, che riconosce e degrada DNA
non metilato in particolari siti. Altre modifiche che vengono effettuate sono, ad esempio, sugli enzimi
che impediscono la ricombinazione del DNA e sulle endonucleasi, queste ultime due modifiche
sembrano ridurre al minimo la capacità del batterio di rigettare il DNA esogeno. Di solito, il genoma
del batterio viene modificato anche in altri geni per permettere di individuare facilmente quali batteri
hanno integrato il DNA di interesse. Ad esempio una delezione parziale del gene lacZ che codifica per
la beta-galattosidasi, oppure una delezione a carico del gene dell’operone del lattosio, permettono
di individuare facilmente quali batteri sono nuovamente in grado di crescere in un terreno in presenza
di lattosio.
55
5. Vettori batterici
I vettori di clonaggio sono particolari molecole di DNA, naturale o anche artificiale, impiegate nelle
tecnologie molecolari di clonaggio. Esistono differenti tipi di vettori di clonaggio. I più semplici, e
anche i più usati comunemente, sono di tre tipi:
1. Plasmidi, naturalmente presenti nei batteri;
2. Batteriofagi labda o correlati;
3. Cosmidi.
5.1 Vettori plasmidici per batteri (o plasmidi)
Sono delle strutture di DNA circolare extra-cromosomiale in grado di auto-replicare. Sono stati
identificati in molti ceppi di E. coli. Queste struttu-re vengono solitamente replicate insieme al DNA
cromosomiale. La replicazione può richiedere la produzione di proteine specifiche da parte del
plasmide o utilizzare quelle batteriche dell’ospite.
ELEMENTI ESSENZIALI DI UN PLASMIDE BATTERICO. Tutti i plasmidi utilizzati in biologia molecolare sono sintetici e devono possedere almeno tre proprietà in comune:
1. origine di replicazione batterica, che è quella regione che consente allo strumento di replica-
zione dei batteri di riconoscere il plasmide e di duplicarlo (parametro di amplificazione). E’
una sequenza di DNA che contiene il sito di inizio della replicazione (sito ori); comprende
anche i geni che codificano tutti gli mRNA e le proteine necessarie alla replicazione (possibili
fattori di trascrizione specifici).
2. un marker selettivo codificato da un determinato gene. Il marker selettivo deve essere
dominante, è un gene che codifica per alcuni enzimi in grado di degradare antibiotici specifici.
I marcatori selettivi più utilizzati sono quelli che conferiscono un certo grado di resistenza:
a. Resistenza all’ampicillina e alla penicillina. I batteri posseggono, oltre alla membrana
cellulare degli organismi pluricellulari, una parete cellulare esterna rigida che, oltre a
fornire supporto e protezione, previene la rottura osmotica nei medium ipotonici. La
parete cellulare batterica deve allargarsi e duplicarsi nel corso della crescita e divisione
cellulare, a tal proposito è necessaria una costante sintesi ex nuovo di tutto il materiale
della parete. I derivati della penicillina (ampicillina) agiscono inibendo la biosintesi ex
novo della parete batterica rendendo il batteriovulnerabile alla rottura osmotica.
Nello specifico, inibiscono l’enzima responsabile della transpeptidazione perché il loro
anello beta-lattamico simula la struttura della Dalanilalanina (sito di legame per gli
enzimi di transpeptidazione). Le transpeptidasi sono un complesso di proteine deno-
minate proteine leganti la penicillina (PBP). L’instaurarsi della resistenza avviene
quando i batteri producono specifici enzimi, le beta-lattamasi, che aprono l’anello
beta-lattamico inattivandolo. Le amidasi, invece, intervengono a livello del gruppo
ammidico. A seguito della resistenza, quello che si osserva è la crescita del batterio e
la sua replicazione anche in presenza di antibiotico.
56
b. Resistenza alla kanamicina e alla tetraciclina. Rappresenta il secondo tipo di marker
selettivo che viene utilizzato sui batteri. Questi due antibiotici vanno a bloccare la
sintesi proteica. Agiscono a livello ribosomiale, nello specifico la tetraciclina agisce
sulla subunità 30s andando ad inibire il legame dell’aminoacil-tRNA al sito A del ribo-
soma; mentre la kanamicina va a inibire legame del primo aminoacido al complesso di
iniziazione.
3. siti di clonaggio, è indispensabile perché permette l’inserimento del gene di interesse
all’interno del plasmide. E’ un sito di taglio per un enzima di restrizione specifico che può
essere utilizzato per inserire DNA esterno, senza interferire con le funzioni basali del plasmide.
Nei plasmidi è presente una regione chiamata Multiple Cloning Site (MCS) o Polylinker, cioè
una regione in cui sono presenti dei siti di taglio unici (non presenti in altre regioni del plas-
mide) per diversi enzimi di restrizione. Tale regione viene utilizzata per inserire il DNA
esogeno. Questo è vantaggioso perché consente di scegliere di scegliere la regione ottimale
per l’inserimento del DNA di interesse.
Figura 8. Mappa di un plasmide modello utilizzato come vettore di clonaggio composto di:
sequenza di origine di replicazione (ori), gene per la resistenza all’ampicillina (AmpR), gene per la
beta-galattosidasi (lacZ+) e regioni con siti di restrizione.
In fig.8 viene rappresentato un esempio di un polylinker dove sulla destra dell’immagine
vengono riportati diversi enzimi di restrizione. Ciascuno di questi enzimi è in grado di
riconoscere selettivamente e digerire una sequenza specifica di DNA rompendo la struttura
ciclica del plasmide e lasciando delle estremità che possono essere coesive o blunt. In fig. 9 è
rappresentato un esempio di Multiple Cloning Site, ingrandito nella porzione a destra dell’im-
magine. Viene indicata la sequenza di taglio specifica di ciascun enzima. Gli enzimi presenti
nell’MCS, tagliano una sola vota all’interno del plasmide; quindi messo a contatto il plasmide
con uno specifico enzima di restrizione, questo si aprirà unicamente in quel punto.
57
Figura 9. Multiple Cloning Site (MCS).
≡ ESEMPIO 1. In un esempio di modificazione viene riportato un plasmidio con tutte e tre le
caratteristiche necessarie già elencate. A titolo esemplificativo, per l’MCS sono indicati tre
enzimi BamHI, KpnI e ApaI. Supponiamo di voler digerire questo plasmide utilizzando due dei
tre enzimi citati (BamHI e ApaI), quello che si ottiene è l’apertura del DNA plasmidico e la
formazione di un plasmide che avrà un’estremità compatibile digerita da BamHI e
un’estremità caratteristica ottenuta per digestione dell’altro enzima. A questo punto sarà
necessario far digerire il DNA esogeno che si vuole inserire all’interno del plasmide con gli
stessi enzimi utilizzati precedentemente, in modo tale da avere estremità compatibili con il
plasmide stesso. Infatti, miscelando i due prodotti di digestione con l’addizione dell’enzima
ligasi (che consente il legame tra i filamenti di DNA), alla fine del processo si ottiene un nuovo
plasmide con DNA circolare che avrà inserito all’interno del MCS il gene di interesse. È
importante ricordare che nella fase di clonaggio viene perso il sito di clonaggio per l’enzima
che si trova in tutta la regione compresa tra BamHI e ApaI. Nel caso specifico viene perso
l’enzima KpnI. Questo vuol dire che se si va a digerire con KpnI il plasmide finale ottenuto, tale
plas-mide non può essere digerito; a meno che KpnI non abbia un sito di restrizione all’interno
del gene di interesse.
≡ ESEMPIO 2. Un altro esempio è quello in cui si possono osservare due marker selettivi
all’interno del plasmide, uno per resistenza all’ampicillina e quello per la resistenza alla
tetraciclina. Oltre a questi due maker è possibile osservare un sito di restrizione per l’enzima
BamHI che cade all’interno della sequenza che codifica per la resistenza alla tetraciclina.
Effettuando una digestione con BamHI, sia del plasmide che del nostro inserto, e successiva-
mente una ligazione si potrebbe assistere alla formazione di due diverse miscele plasmidiche
all’interno della sospensione. Questo perché la digestione con un unico enzima porta alla
formazione di estremità compatibili che per effetto dell’enzima ligasi può:
a. richiudersi su sé stesso tornando indietro al plasmide di partenza (in assenza del
frammento di DNA esogeno inserto);
58
b. legare il frammento di DNA esogeno attraverso le sue due estremità compatibili con quelle
del plasmide e – in questo caso – si assiste alla perdita della resistenza alla tetraciclina
(viene perso il gene che codifica per tale resistenza a seguito dell’inserimento del
frammento di DNA esogeno), ma non a quella verso l’ampicillina.
Quindi nella stessa provetta si otterrà una miscela composta in parte dalla situazione rap-
presentata nel punto (a) e una parte di quella rappresentata nel punto (b). Dato che la
situazione che interessa all’operatore è quella in (b), come si fa a discriminare tra i due vettori?
Viene sfruttata la diversa resistenza alla tetraciclina. Dunque, per poter selezionare il vettore
(b) di interesse basterà trasfor-mare un ceppo batterico competente, utilizzando la miscela
che contiene i due plasmidi. Dopo tale trasformazione si procede alla semina di tale ceppo su
un terreno solido contenente ampicillina. Si procede all’incubazione per una notte e il giorno
successivo si vanno ad osservare le colonie che sono cresciute in tale terreno. Queste colonie
potranno avere al loro interno il plasmide (a) oppure il plasmide (b) (perché entrambi hanno
mantenuto il gene che codifica per la resistenza all’ampicillina). Viene effettuata un’operazio-
ne definita Replica Plating che consiste nell’applicare una sorta di stampo ricoperto di velluto
sterile sulla coltura batterica toccando la superficie a contatto con le colonie; e, suc-
cessivamente tali colonie prelevate andranno trasferite su una piastra nuova. In questo caso,
si va ad effettuare una replica su piastre che contengono da una parte ampicillina e dall’altra
tetraciclina. Le colonie che vengono riseminate nel terreno che contiene ampicillina, saranno
in grado di crescere sia quelle che sono state trasformate con il vettore (a) sia quelle
trasformate con il vettore (b). Nella piastra che contiene tetraciclina, potranno crescere solo
le colonie che sono state trasformate con il vettore (a), mentre quelle trasformate con vettore
(b) saranno destinate a morte. Per differenza sarà possibile individuare sulla piastra che
contiene ampicillina quali sono le colonie trasformate con il vettore (b). Perché è necessario
effettuare una replica e non è sufficiente piastrare direttamente in un terreno contenente
tetraciclina? Il vettore di interesse è il (b), ovvero quello che ha perso la resistenza verso la
tetraciclina; quindi seminando e piastrando i batteri in un terreno contenente tetraciclina si
andrebbero a perdere tutti i batteri di interesse che contengono il plasmide (b). La prima
semina con ampicillina consente di andare a selezionare, tra tutti i batteri trasformati presenti
all’interno della sospensione, quali sono quelli effettivamente trasformati (o col vettore (a) o
col vettore (b)); infatti può succedere che durante la fase di trasformazione alcuni dei batteri
preseti non integrino alcun DNA plasmidico per cui non sono in grado di crescere nemmeno
in ampicillina. La seconda fase permette di selezionare anche quei batteri che sono in grado
di crescere anche in tetraciclina, quindi trasformati con il vettore (a). Per differenza si ricavano
i batteri ottenuti con (b).
≡ ESEMPIO 3. Un altro esempio si basa su un sistema naturale presente all’interno dei batteri
che è l’operone lattosio, che consente al batterio di sintetizzare gli enzimi necessari al
metabolismo del lattosio. Normalmente i batteri crescono in presenza di glucosio nel terreno
di coltura e, di conseguenza, la trascrizione dei geni codificanti per l’operone lac viene inibita
dal repressore lac. In presenza di lattosio (o componenti correlati) il repressore lac non può
più legare il promotore LAC e la trascrizione può iniziare, originando un singolo mRNA che
codifica per lacZ, lacY, lacA. Due di questi geni sono essenziali per la crescita in lattosio.
59
L’operone lattosio ha una regolazione negativa (feedback negativo), garantita dalla presenza
di tale repressore lac codificato dal gene I normalmente trascritto e tradotto in una proteina
che va a legarsi al promotore dell’operone lac creando un ingombro sterico che impedisce la
trascri-zione dei geni a valle (lacZ, lacY, lacA). Quando il lattosio è presente nel terreno, questo
va a legarsi all’inibitore provocando un cambiamento conformazionale nell’inibitore stesso
che si stacca dal promotore dell’operone lattosio rendendo questo accessibile per la
trascrizione (produzione delle proteine necessarie al metabolismo del lattosio).
Figura 10. Regolazione a Feedback negativo dell'operone lac.
In particolar modo vengono sintetizzate tre diverse proteine:
a. la permeasi, codificata dal gene lacY ed è necessaria per l’ingresso del lattosio nella cellula;
b. la beta-galattosidasi, codificata dal gene lacZ che scinde il lattosio in glucosio e galattosio
per poi essere facilmente metabolizzati dal batterio.
c. la tiogalattoside transacetilasi, codificata dal gene lacA indispensabile per il metabolismo.
Questo sistema può essere sfruttato a nostro vantaggio per andare a vedere quali batteri sono
stati trasformati con il plasmide contenente il gene di interesse. Questo è possibile utilizzando
il prodotto del gene lacZ, la beta-galattosidasi, sfruttando la caratteristica di questa proteina
di poter essere separata in due sub-unità alfa e omega che possono dare origine ad un feno-
meno detto alta com-plementazione. Grazie a tale fenomeno possono essere separate e
prodotte singolarmente; nel momento in cui si trovano entrambe nello stesso contenitore (o
60
nella stessa cellula), possono ricostituire l’enzima di partenza perfettamente funzionante. Il
sistema prevede che venga usato uno specifico ceppo batterico, E. Coli DH5α, geneticamente
modificato in modo da produrre solo la sub-unita omega della beta-galattosidasi (per elimi-
nazione dei geni lacA, lacZ e lacY); successivamente si inserisce il gene che codifica per la sub-
unità alfa all’interno del plasmide utilizzato per modificare tale battere. Il ceppo batterico di E.
Coli DH5α può essere trasformato con vettore pUC19 contenente il gene che codifica per il
frammento alfa. Come si possono discriminare i batteri che sono stati realmente trasformati
con questo vettore? Questo è possibile crescendo i batteri in un terreno che contiene due
particolari composti:
a. IPTG (isopropil-1-tio-b-D-galattoside) che inattiva il repressore lac e consente l’espressione del
frammento omega (codificato dal genoma del batterio DH5α);
b. Xgal (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galattoside), è un analogo del lattosio che viene meta-
bolizzato a composto blu dalla b-galattosidasi.
Nelle colonie in cui è avvenuta la complementazione, ovvero quelle che hanno prodotto il
frammento omega (prodotto da tutti i batteri trasformati con il vettore) e che possono produrre
anche il fram-mento alfa e quindi dar luogo ad una beta-galattosidasi funzionale che sarà in grado
di metabolizzare il composto Xgal (tale reazione è facilmente identificabile per via del composto
blu che si viene a formare sulla piastra). E’ possibile identificare i batteri che hanno inserito il gene
di interesse? Tale operazione è possibile in quanto il vettore pUC19 è strutturato in modo tale da
avere i tre parametri necessari (origine di replicazione, resistenza all’ampicillina e il Multiple
cloning site. In questo caso specifico, il Multiple cloning Site, è presente all’interno del gene che
codifica per il frammento alfa; nel momento in cui si inserisce il gene di interesse si andrà a
distruggere la sequenza che codifica per il frammento alfa della beta-galattosidasi. Da quanto
detto si deduce che i batteri che hanno integrato il gene di interesse all’interno della sequenza he
codifica per il frammento alfa non saranno in grado di dare alfa-complementazione e le colonie
assumeranno un colore bianco (non si può ottenere la conversione dell’Xgal e il substrato non
diviene blu).
( × ) Riassumendo. A partire da un frammento di pUC19 che normalmente codificherebbe
per la resistenza all’ampicillina e quello per il frammento alfa della beta-galattosidasi; all’interno
di tale frammento è posizionato il MCS. Dunque è possibile scegliere un enzima che tagli in tale
regione di clonaggio al fine di inserire il DNA di interesse. A questo punto viene digerito sia il
plasmide pUC19 che il DNA di interesse con lo stesso enzima. Successivamente vengono messi
entrambi a contatto con l’enzima ligasi per far avvenire la ligazione e si ottiene una sospensione
che può ottenere due diversi tipi di plasmide:
a. Il plasmide A, il quale è in grado di richiudersi su sé stesso tornando indietro al plasmide di
partenza (in assenza del frammento di DNA esogeno inserto); i batteri che contengono questo
plasmide produrranno un frammento alfa funzionale capace di dar luogo a complementa-
zione (colonie di colore blu).
b. Il plasmide B, il quale è capace di legare il frammento di DNA esogeno all’interno della
sequenza che codificava per il frammento alfa, per cui questi plasmidi hanno perso la capacità
di produrre un frammento alfa funzionale e i batteri che hanno integrato questo plasmide
daranno luogo a colonie di tipo bianco.
61
Entrambi i plasmidi portano la resistenza all’ampicillina, quindi come è possibile selezionare (per
poi successivamente amplificare) i batteri contenenti il plasmide di interesse? È utile un processo
di ligazione per trasformare un ceppo di DH5α che produce il frammento omega della β-
galattosidasi, se cresciuto in presenza di IPTG che rimuove il repressore. Una volta trasformati,
questi andranno seminati su una piastra di LB solido che conterrà al suo interno tre diverse
molecole (utili successiva-mente per lo screening):
a. l’ampicillina, che consente di selezionare tra tutti i batteri presenti, quelli che sono stati
trasformati (che hanno preso uno dei due plasmidi).
b. IPTG, che viene successivamente addizionato e consente a tutti i batteri in coltura di produrre
il frammento omega.
c. Xgal, che viene successivamente addizionato e consente di stabilire quali tra tutti i batteri si
sono trasformati con il vettore A (che darà origine a colonie di tipo blu), oppure con il vettore
B (che darà origine a colonie bianche).
Quelli appena visti sono i tre elementi fondamentali per un vettore plasmidico per i batteri. Nel
momento i cui si vuole utilizzare tale plasmide per modificare geneticamente una cellula eucariotica,
è necessario inserire all’interno di questo plasmide più sequenze, che possono essere:
1. una Sequenza promotrice. Il promotore è una serie di brevi sequenze che:
a. danno inizio alla trascrizione;
b. contengono al loro interno degli elementi di regolazione positiva che facilitano e pro-
muovono la trascrizione (Enhancer). Quasi tutti i promotori utilizzati per la produzione e
per l’espressione di proteine all’interno di cellule eucariotiche sono promotori derivati dai
virus come l’SV40 early gene enhancer (attivo su molti tipi cellulari), il LTR - long terminal
repeat (Raus Sarcoma Virus e CMV). La scelta dei promotori virali è dovuta al fatto che
questi sono forti e vengono trascritti molte volte con semplicità. Quindi porre un gene di
interesse sotto il controllo di un promotore virale garantisce una maggiore facilità di
espressione all’interno della cellula bersaglio. Esistono anche dei promotori minimali, o
cellulo-specifici; infatti scegliendo tale promotore si può scegliere quale gene deve essere
espresso. In alcuni casi è vantaggioso scegliere un promotore che possa essere regolato.
La sequenza promotrice contiene anche elementi di regolazione negativa (Silencer) che
inibiscono la trascrizione.
2. il DNA di interesse;
3. la sequenza di terminazione, è un’altra importante sequenza da inserire all’interno del plasmide
per garantire che questo venga espresso. Tale sequenza consiste nel sito di poliadenilazione.
Infatti, molto spesso quando si fa un clonaggio, quello che viene inserito è una sequenza di cDNA,
ovvero una sequenza complementare all’RNA messaggero. E’ necessario aggiungere
a. due sequenze ricche di GU o U poste a valle del sito di poliadenilazione;
b. sequenze di 6 nucleotidi AAUAAA localizzate 11-30 nucleotidi posti a monte del sito di
poliadenilazione.
Questo garantisce che il cDNA venga trascritto sull’RNA messaggero e che quest’ultimo venga
correttamente maturato.
4. dei fattori per la replicazione.
62
5.2 Batteriofagi
Struttura del Fago lambda. Un batteriofago è un virus capace di infettare i batteri. Il fago λ è
uno tra i batte-riofagi più utilizzati; ha una struttura che comprende una testa proteica icosaedrica
(capside), un collare, una coda non contrattile e un sistema di fibre poste nella sua porzione terminale
che gli permettono di aderire alla parete o alla membrana cellulare del batterio ospite.
Figura 11. Struttura del fago λ.
Il genoma del batteriofago. All’interno della capsula proteica che compone la testa si trova il
genoma che, per il fago λ, è un ds DNA di 48.5 kb. È una sequenza lineare che presenta, alle due
estremità, due siti terminali molto importanti definiti COS. In seguito all’infezione di un batterio
sensibile, il fago lambda inietta il suo DNA lineare che circolarizza grazie alle sequenze COS presenti
all’estremità (il DNA circolare è molto più stabile rispetto al DNA lineare). I siti COS sono costituiti da
12 paia di basi complementari, tra loro coesivi. Il genoma del fago λ, codifica principalmente per le
proteine strutturali del capside e della coda; altre sequenze, invece, possono essere di attacco alla
cellula ospite, di ricombinazione (che consentono al virus di ricombinare in suo genoma con quello
batterico) ed in fine sequenze di replicazione. Le sequenze COS sono responsabili del riconoscimento
del materiale genetico da inserire all’interno del capside; in assenza tali sequenze il DNA non viene
inserito.
63
Modalità di sopravvivenza nell’ospite. Nel momento in cui il fago infetta il batterio, può andare
incontro a due vie:
1. Via litica – quando il virus intraprende la via litica, questa porta il batterio a morte per permet-
tere la fuoriuscita dei nuovi batteriofagi prodotti dopo l’infezione della cellula ospite. Il ciclo
litico viene attuato per ottenere la replicazione del batteriofago (che senza la cellula ospite
non avrebbe modo per riprodursi). I batteriofagi generati vanno ad infettare altre cellule
batteriche. Nel momento in cui il fago si avvicina al batterio, inserisce il suo DNA all’interno
del batterio. Se le condizioni sono favorevoli, spesso il virus porta ad un’attivazione del
processo litico causato dalla digestione del DNA batterico in modo tale da sfruttare tutto il
sistema di replicazione della cellula ospite per riuscire a replicare il suo genoma, trascrivere e
opportunamente sintetizzare tutte le proteine necessarie per riprodurre i vari componenti
(capside, coda e fibre). Tale operazione gli consente di addensare all’interno dell’ambiente
cellulare nuovi batteriofagi formati che, non appena questi raggiungono quantità critiche per
la cellula, verranno liberati dopo aver indotto la lisi del batterio.
2. Via lisogena – in alcuni casi, il batterio viene mantenuto vitale e il batteriofago integra il suo
genoma con il comosoma dell’ospite, e questo gli permette di mantenere l’infezione per lungo
tempo (il virus diviene quiescente – profago non infettivo - e continua a vivere all’interno del
batterio). Tutte le volte che il batterio duplica il suo DNA contemporaneamente replica anche
Figura 12. Sequenze COS (Circolarizzazione genomica).
64
quello del fago. In alcuni casi però può succedere che, grazie alla presenza delle sequenze
COS, il profago si possa separare dal cromosoma (questo viene circolarizzato) e si innesca il
ciclo litico.
Figura 12. Via litica e via lisogena.
Integrazione del genoma fagico. L'integrazione del genoma circolare fagico lambda all'inter-no di
quello circolare batterico avviene in una speciale regione. La sequenza precisa sul genoma di E. coli è
chiamata attB (dall'inglese Bacterial attachment, sito di attacco batterico) ed è composta
essenzialmente di tre segmenti, detti B-O-B’. La sequenza omologa sul genoma del fago è attP
(dall'inglese Phagic attachment, sito di attacco fagico) ed è composta delle regioni P-O-P'. Nel mo-
mento in cui avviene l’integrazione si ha una ricombinazione dei siti dove la sequenza B si lega con la
sequenza P’ e, analogamente, la sequenza P con quella B’. Una volta avvenuta l’integrazione, si
formano due nuovi siti (non più attP e attB) che vengono chiamati attL e attR, che fiancheggiano il
DNA fagico (dove L e R stanno per Left and Right). La reazione operata dalla integrasi (INT, ricombinasi
di λ – enzima del fago lambda). Lo stesso enzima può catalizzare anche la reazione di excisione, nel
momento in cui dovesse riattivarsi un ciclo di tipo litico.
Clonaggio di un fago lambda. È possibile sfruttare il genoma del fago lambda e la sua mo-dalità
di inserimento all’interno del batterio, per poter inserire all’interno di quest’ultimo un fram-mento
di DNA esogeno di interesse. Questo perché il DNA del fago può essere modificabile, e l’integrazione
dell’inserto di DNA di interesse può avvenire eliminando tutti i geni che codificano per le proteine
strutturali (testa e coda), allo scopo di ottenere un fago incapace di replicare. Questa operazione è
importantissima perché permette un facile inserimento di DNA all’interno della cellula batterica
65
senza dover modificare la struttura della membrana ma semplicemente sfruttando le capacità
parassitarie del fago. L’unica limitazione è quella di rispettare le dimensioni massime (48 kb) del DNA
del fago contenuto nel capside proteico che ha una dimensione non espandibile; per cui, eliminando
le sequenze non necessarie (attraverso enzimi di restrizione) si riesce a creare dello spazio utile
all’inserimento di ulteriori informazioni (DNA ricombinante di interesse). L’operazione di clonag-gio
richiede l’inserimento del DNA ricombinante all’interno di una struttura fagica completa purché sia
possibile il trasferimento del materiale genetico. Vengono utilizzati ceppi batterici infettati con fagi
lamba mutati geneticamente che producono esclusivamente la componente strutturale: solo le teste
o solo le code (vengono mantenute solo le sequenze che codificano per le proteine strutturali del
virus). Si esegue il packaging in vitro aggiungendo il genoma del fago con il DNA di interesse, insieme
alle teste e le code precedentemente estratte dal batterio. In sostanza il packaging non è altro che
l’inserimento del DNA del fago all’interno del capside (ottenimento del fago maturo). Il batteriofago
modificato potrà successivamente infettare determinati ceppi batterici e trasferire loro il materiale
genetico di studio che, per la sua capacità di circolarizzare, può essere considerato come un plasmide.
La procedura di packaging si rivela particolarmente efficiente.
Crescita di un fago lambda. A seguito dell’ottenimento del fago geneticamente modifica-to, si
può andare a miscelare quest’ultimo con dei batteri su un terreno di coltura che mantiene in vita i
batteri. Viene dato il tempo al fago di interagire con i batteri infettandoli e, successivamente, si va a
seminare tali batteri (contenenti il genoma di interesse) su un terreno solido. Incubando la pia-stra
per qualche giorno si osserva che i batteri infettati con il fago verranno lisati, per cui si osservano
delle placche di lisi al cui interno si ritrova la nuova progenie di batteriofagi con il genoma di interesse.
Differenza tra la trasformazione batterica e trasfezione con fago λ. La formazione delle placche di lisi
caratterizza l’infezione da batteriofago. Si può osservare che il processo di infezione con fago è meno
efficiente rispetto a quello della trasformazione batterica, però il vantaggio che si può trarre dall’uti-
lizzo di un fago è dato dalla possibilità di inserimento di un DNA di dimensioni maggiori, proprio
perché viene sfruttata la capacità infettiva del fago piuttosto che la trasformazione utilizzando il calcio
cloruro.
5.3 Cosmidi
I cosmidi vengono utilizzati per il clonaggio di genomi di dimensioni medio-piccole (o singoli geni).
Non sono sufficienti per clonare l’intero genoma umano. Sono molecole di sintesi, non esistenti in
natura e che hanno la capacità di trasferire maggiore quantità di DNA di quanto possa fare un
plasmide o un fago. I cosmidi sono stati progettati per unire alcune proprietà dei plasmidi e dei fagi:
1. si replicano come i plasmidi poiché contengono la sequenza ori,
2. si impaccano nelle teste proteiche a formare le particelle virali come i fagi poiché conten-
gono le estremità COS. Grazie alla presenza di tali siti COS.
Elementi strutturali importanti. Gli elementi strutturali importanti dei cosmidi sono i seguenti:
1. inizio di replicazione ori, non vi sono geni per la replicazione fagica o lalisi, quindi non si
formeranno placche;
2. vengono assolutamente mantenuti i siti COS per poter effettuare il packaging in vitro;
66
3. di solito viene inserito un Polylinker (pUC) per poter effetuare il clonaggio;
4. l’importanza di marcatori genetici selezionabili (geni che codificano per la resistenza
all’Ampicillina), per la selezione delle colonie ricombinanti su agar solido.
Il meccanismo è molto simile a quello dei plasmidi; non placche di lisi ma colonie.
Figura 13. Struttura semplificata di un cosmide.
Nella struttura del cosmide, si possono chiaramente individuare:
1. l’origine di replicazione;
2. i due siti COS per la ricombinazione;
3. una sequenza che codifica per la resistenza ad un antibiotico, in questo caso alla tetra-
ciclina (TetR);
4. dei siti di restrizione.
Dimensioni del cosmide di solito sono di circa 5 kb, e l’inserto dovrà essere almeno di 32-45 Kb per
consentire il packaging in vitro (37-51 Kb totali).
Clonaggio in cosmidi. I due siti COS sono separati da un sito di restrizione per ScaI, la di-gestione
di questo punto permette la linearizzazione del cosmide (che simula quello dl fago). Inoltre è presente
un’altra regione, presente al di fuori delle due sequenze COS, che viene riconosciuta e tagliata da un
67
altro enzima di restrizione (BamHI). Quando di vuole effettuare un clonaggio viene digerito per primo
con ScaI, in modo da linearizzare il cosmide; successivamente una seconda di-gestione con BamHI
creando due estremità compatibili con tale enzima. In seguito si va ad idrolizzare il DNA di interesse
(in rosso) con BamHI. Prima di effettuare tale operazione è necessario che le estremità del DNA siano
defosforilate per evitare il legame tra i due frammenti terminali (previene la ciclizzazione); in questo
modo tali frammenti per poter essere inseriti necessitano di fosfato che viene a trovarsi a livello delle
sequenze BamHI recise del cosmide. Nel momento in cui si va a miscelare il DNA del cosmide e quello
di interesse, in presenza dell’enzima ligasi, si abbia una reazione di ligazione che porta alla formazione
del prodotto finale. Il cosmide linearizzato che è stato ottenuto può essere inserito all’interno di un
capside (solamente se è linearizzato e non diversamente) attraverso il meccanismo di packaging in
vitro. Successivamente all’infezione del batterio da parte del fago ottenuto, grazie alla presenza delle
sequenze COS, il DNA circolarizza a plasmide (come risultato si ottengono dei batteri trasformati con
plasmide). Per poter identificare quali batteri sono stati trasfor-mati con il cosmide, si va a sfruttare
il principio della resistenza alla tetraciclina riportata dalla se-quenza genica del cosmide.
5.4 Vettori e dimensioni degli inserti clonabili
A seconda delle dimensioni dell’inserto clonabile è possibile scegliere il vettore più adatto:
VETTORE
FORMA
OSPITE
CAPACITA’ TIPICA DI TRASPORTO
(dimensione dell’inserto che
accetta)
PLASMIDE DNA circolare DS E. coli Fino a 15 kb
BATTERIOFAGO λ Virus (DNA lineare DS) E. coli Fino a 25 kb
COSMIDE DNA circolare DS E. coli 30-45 kb
BAC Cromosoma Artificiale
Batterico
E. coli 100 – 500 kb
YAC Cromosoma Artificiale
di Lievito
Lievito 250 – 2000 kb
5.5 Laboratorio per i batteri
Solitamente i batteri possono essere facilmente manipolati a meno che non siano ceppi batterici
altamente patogeni per l’uomo e che non necessitino alti livelli di protezione. L’occorrente essenziale
per un laboratorio per batteri è: 1) Bancone, 2) Guanti, 3) Beute/piastre petri/ anse per batteri/
eppendorf/ etc…, 4) Centrifughe da banco/ centrifughe refrigerate/ super centrifughe, 5) Incubatore/
camera calda/ agitatori, 6)LB e agar, 7) Autoclave, 8) Smaltimento rifiuti biologici.
68
6. La trasfezione:
vettori virali e non virali
6.1 Sistemi di trasferimento genico (trasduzione)
Il processo che prevede il trasferimento di materiale genico prende generalmente il nome di trasdu-
zione; tuttavia può cambiare nome a seconda dell’organismo ricevente. Infatti, quando l’ospite è rap-
presentato dai microrganismi, il processo prende il nome di trasformazione; quando invece il riceven-
te è una cellula eucariotica (in particolare di mammifero), tale processo prende il nome di trasfezione;
quando il trasferimento genico è mediato da un virus questo prende il nome di infezione.
Perché trasferire nelle cellule frammenti di DNA/RNA esogeno? Le ragioni che motivano l’uso di questi
sistemi sono svariate. Nella ricerca, ad esempio, tale processo consente di ottenere delle cellule
ingegnerizzate (o geneticamente modificate) che sono in grado di produrre una determinata proteina
di interesse, consentendo l’espressione di un determinato gene e di studiarne la sua struttura;
permettono di tracciare il metabolismo di una specifica proteina all’interno della cellula qualora
questa venga resa fluorescente. In sostanza, le cellule in coltura sono utili:
1. all’identificazione di sequenze regolatorie;
2. all’identificazione della struttura e della funzione di un gene;
3. alla produzione di proteine come oggetto di studio oppure per sintetizzare nuovi farmaci.
Riguardo agli studi in vivo, questo processo riguarda la produzione di animali transgenici, ovvero una
serie di modelli per la comprensione delle basi molecolari di malattie umane. Nella pratica clinica,
invece, la modifica genica (terapia genica) viene utilizzata anche sull’uomo per consentire il ripristino
di funzioni metaboliche deficitarie (si tratta di un riespressione di un determinato gene che, mutato
o represso, e che portava ad una perdita di funzione), oppure l’aumento delle difese naturali. Nel momento in cui si inserisce del materiale genetico (RNA o DNA), quello che si può ottenere, con
differenti strategie, è:
1. una espressione o sovraespressione di un determinato gene (di solito attraverso l’utilizzo di
plasmidi - pDNA);
2. il silenziamento dell’espressione di un particolare gene (solitamente attraverso siRNA o
miRNA).
6.2 Ottimizzazione del processo
La trasfezione, come tutti i processi, può essere ottimizzata.
I parametri da tenere in considerazione sono:
1. DNA da trasfettare – il materiale genetico che da trasfettare deve essere privo di contaminanti (i
principali contaminanti sono le proteine e l’RNA che potrebbe interferire ad esempio con i metodi
chimici dove c’è la necessità di mascherare le cariche negative del DNA). Inoltre, la soluzione di
DNA deve essere necessariamente sterile e priva di contaminanti batterici.
69
2. Scelta del tipo cellulare.
3. Scelta del tipo di vettore – adatto per aumentare l’espressione in linee cellulari di mammifero.
4. Tempo di trasfezione – da un tempo minimo di 30 min ad un tempo massimo di 4 ore.
5. Scelta del terreno di coltura – scelta del siero o meno e degli antibiotici.
6.3 Fattori che influenzano la trasfezione
1. STATO DI SALUTE DELLE CELLULE – Le cellule devono essere mantenute nella fase log di
crescita; devono essere coltivate in un medium di crescita appropriato e in condizione di
temperatura e umidita corrette; e, devono essere prive di contaminazioni.
2. CONFLUENZA E FASE DI CRESCITA DELLA COLTURA - la densità media di crescita dipende dalla
linea cellulare, generalmente e compresa tra il 40 e 80%.
a. densità troppo bassa: i reagenti di trasfezione possono risultare troppo concentrati e tos-
sici, le cellule crescono troppo poco;
b. densità troppo alta: le cellule hanno inibizione da contatto, si riduce la superficie di
membrana disponibile all’ingresso del DNA.
Le cellule in attiva divisione si trasfettano meglio delle cellule quiescienti (la rottura della
membrana nucleare durante la mitosi, favorisce l’ingresso del DNA esogeno nel nucleo).Il
numero di passaggi della coltura deve essere il piu basso possibile, comunque inferiore a 50.
Le caratteristiche di una linea cellulare possono cambiare con l’aumentare dei passaggi,
queste cellule possono inserire nel loro genoma delle mutazioni e risultare significativamente
diverse rispetto alle cellule di partenza; questo potrebbe influenzare anche l’efficienza di
trasfezione e la riproducibilità di un esperimento. Solitamente le cellule dopo un elevato
numero di passaggi si trasfettano in maniera meno efficiente. Quindi è sempre meglio
standardizzare la procedura su cellule che hanno subito meno passaggi possibili.
3. QUALITA’ E QUANTITA’ DEL DNA – E’ un fattore molto importante per la trasfezione, infatti
e necessario utilizzare plasmidi di alta-qualità, privi di contaminanti proteiche, di RNA e di
sostanze chimiche usate per la purificazione. Non ci devono essere endotossine. Solitamente
il DNA e risospeso in acqua sterile o buffer TE, in una concentrazione compresa tra 0.2-1
mg/ml. La quantità ideale di DNA da trasfettare dipende dal tipo cellulare, dal metodo di tras-
fezione, etc e va quindi determinata sperimentalmente (NOTA: il DNA ad alte concentrazioni
e tossico per le cellule).
6.4 Metodi di Trasfezione
La trasfezione consiste nell’inserimento di DNA o RNA esogeno all’interno di cellule eucariotiche
bersaglio. A seguito della trascrizione, ottenere l’epressione/silenziamento del gene d’interesse ed
andarne a caratterizzare gli effetti di tale espressione genica (proteina). Le problematiche principale
legate al processo di trasfezione sono legate al fatto che il DNA e l’RNA sono molecole fortemente
polari (cariche negativamente) e la membrana cellulare è lipofila; dunque le due strutture risultano
poco compatibili, motivo per cui c’è la necessita di mascherare in qualche modo la carica negativa ed
aumentare la compatibilità degli acidi nucleici con la membrana in modo tale da consentire l’ingresso
70
all’interno della cellula. Il processo di trasfezione prevede l’utilizzo o la creazione di un vettore,
all’interno del quale viene posta la molecola da trasportare (cargo); il complesso formato dal vettore
e dal cargo facilità tale processo di trasfezione nell’ospite. Generalmente il processo di trasfezione
prevede che l’ingresso del materiale genico avvenga attraverso endocitosi ma non è proprio così. Di
solito, il vettore con all’interno il cargo viene internalizzato per endocitosi formando un ensosoma
precoce che maturerà per diventare un endosoma tardivo. Durante la trasfezione è molto importante
favorire il processo di escape, ovvero la fuoriuscite dell’endosoma tardivo prima che questo vada a
fondersi con il lisosoma (è necessario evitare che il contenenuto del endosoma tardivo vada a finire
nel lisosoma perché altrimenti questo verrebbe degradato) così che, ad esempio, il plasmide liberato
possa andare a svolgere la sua funzione all’interno della cellula.
6.5 Il cargo
Si distinguono diversi tipi di cargo genetici:
1. Plasmide (pDNA), DNA double-strand circolare (quello più utilizzato in assoluto). Il plasmide viene
prima amplificato nei batteri e poi successivamente utilizzato sulle cellule eucariotiche. Infatti uno
dei vantaggi è proprio questo, un plasmide è molto facile da amplificazione se si dispone di una
coltura di batteri, da ottenere e da manipolare. Lo svantaggio principale è legato alla sua minore
durata nel tempo (48-72 ore al massimo), infatti non riuscendosi ad integrare con il genoma della
cellula eucariotica, viene perso nel corso delle duplicazioni cellulari. Un altro svantaggio è dato
dall’impossibilità di caricare dimensioni eccessive di materiale genetico su un plasmide, infatti
diverrebbe difficoltoso l’attraversamento della membrana plasmatica.
Sono riportati alcuni esempi di modifiche apportate al plasmide in modo da ottimizzare la sua
durata di espressione del gene contenuto al suo interno.
≡ ESEMPIO 1. Tale sistema viene denominato Enhanced Episomal Vectors (EEV). La strategia
adottata è stata quella di inserire una sequenza virale all’interno del DNA double-strand circolare
che codifica per una proteina specifica, la Epstein-Barr Nuclear Antigen-1 (oriP-EBNA1), che nel
momento in cui viene trascritta e tradotta tale proteina accoppia la duplicazione del plasmide alla
duplicazione della cellula ospite. Quindi il plasmide continua ad essere presente anche per
l’apparato di trascrizione cellulare fin quando la cellula ospite duplica. Ciò significa che finché
viene mantenuta costante la coltura, il plasmide (non integra nel genoma ma rimane episomiale)
con questo sistema di abbinamento della duplicazione permane sempre all’interno della cellula.
≡ ESEMPIO 2. Il Minicircle è una strategia che è stata disegnata al fine di aumentare sia la durata
di espressione del transgene, ma soprattutto riesce ad ovviare al problema della dimensione del
plasmide stesso. Il minicircle ha la caratteristica di essere molto piccolo e di essere facilmente
trasfettabile all’interno della cellula ospite con una durata di espressione molto maggiore rispetto
ai plasmidi classici (72 ore – 3 settimane). Il funzionamento del sistema del minicircle parte da
una struttura definita plasmide parentale che possiede al suo interno le seguenti strutture:
a. un’origine di replicazione per i batteri;
b. un particolare gene che consente di selezionare quali batteri sono stati trasfettati col plasmi-
de grazie alla sua resistenza alla Kanamicina (KanR);
c. un gene promotore che controlla il gene di interesse;
71
d. tre sequenze particolari (attP e attB viste precedentemente nei cosmidi e che consentono di
effettuare un processo di ricombinazione una volta tagliate in modo opportuno; una terza
sequenza importante indicata con 32xSce-I sites, che manifesta la presenza di 32 siti di taglio
per l’enzima Sce-I, la presenza di così tanti siti aumenta la probabilità di un taglio efficace).
La struttura del plasmide parentale è molto grande e non è semplice veicolarlo all’interno di cellu-
le eucariotiche se non è stato precedentemente amplificato all’interno del batterio (che ha una
capacità di trasformazione maggiore rispetto a quella di trasfezione di una cellula eucariotica;
quindi è più facile introdurre materiale genetico all’interno di un batterio). Nel momento in cui il
costrutto viene generato, successivamente si procede con l’amplificazione batterica per produrre
dei minicircle; tale operazione è possibile grazie ad uno specifico ceppo batterico di E.coli, il
YCY10P3S2T, un ceppo ingegnerizzato per l’espressione in modo inducibile da Arabinosio. Viene
fatto amplificare il plasmide parentale nei batteri in incubazione per una notte, e al termine di
tale periodo (si presuppone che la coltura abbia prodotto una quantità sufficiente di plasmide) si
addiziona l’Arabinosio al terreno di crescita. Questo zucchero permette al batterio di esprime
sequenzialmente due diverse molecole enzimatiche:
a. PhiC31 integrasi, il quale agisce andando a tagliare le sequenze attP e attB separando in due
porzioni il plasmide parentale così queste due porzioni possono richiudersi su loro stesse in
modo tale da formare le sequenze attL e attR (come avveniva per i plasmidi nel momento in
cui andavano ad integrare). Alla fine di tale processo si ottengono due diversi plasmidi: uno è
il minicircle e l’altro è il backbone batterico (contiene tutte le sequenze necessarie a produrre
il plasmide all’interno dei batteri, per la replicazione e quelle relative alla resistenza alla
kanamicina. Il minicircle, in modo complementare, contiene tutte le sequenze necessarie
all’espressione del transgene di interesse nella cellula eucariotica e la coda di poly-A.
b. I-SceI endonucleasi (enzima di restrizione). Una volta ottenuti il minicircle e il backbone batte-
rico dovrebbe essere necessaria la lisi della cellula batterica per recuperare il minicircle. Il
problema sostanzialmente risiede nei sistemi di recupero di tale materiale genetico poiché i
sistemi di separazione del DNA batterico si basano (come precedentemente visto) su parti-
colari resine ad alta affinità per il DNA plasmidico. In questo caso, avendo ottenuto due plas-
midi (minicircle e il backbone batterico), attraverso tale operazione non risulterebbero distin-
guibili. L’endonucleasi, entra in gioco digerendo il backbone batterico nei suoi 32 siti di taglio
per Sce-I e linearizzando tale struttura che, solo a questo punto, potrà essere distinta dalla
colonna. Questo meccanismo permette il recupero selettivo del minicircle.
2. Antisense Oligo Nucleotide (AON). Queste molecole vengono utilizzate quando si vuole silenziare
l’espressione di un determinato gene. Gli AON sono polimeri sintetici. I monomeri possono essere
sia desossiribonuclotidi o ribonucleotidi. Sono denominati oligo perché hanno una lunghezza
compresa tra 15-20 nucleotidi (sequenze abbastanza corte); mentre vengono defiiti antisenso
perché la loro sequenza (3′ → 5′) è complementare alle sequenze del mRNA del gene da
silenziare. I meccanismi di silenziamento di un gene da parte degli AON sono essenzialmente due:
a. attraverso l’attivazione di un enzima denominato RNA-si H che è un enzima cellulare che viene
attivato qualora si formino delle molecole con RNA Duble Strand (DS), ovvero delle molecole
di RNA a doppio filamento, tale enzima ne promuove la degradazione;
72
b. determinazione di un ingombro sterico. L’AON solitamente va a posizionarsi sul messaggero
in una regione che precede o sta a cavallo del sito di inizio della traduzione, impedendo l’at-
tacco del ribosoma con conseguente mancata traduzione del mRNA e l’espressione della pro-
teina di interesse.
Caratteristiche funzionali e generazioni di AON. Gli AON per poter funzionare correttamente de-
vono soddisfare i seguenti punti:
a. devono essere capaci di entrare all’interno delle cellule bersaglio;
b. devono, ove possibile, evitare di essere digerite a loro volta dalle nucleasi;
c. non devono avere effetti dannosi per la cellula in cui vengono transfettati.
Per ottenere queste caratteristiche, solitamente gli AON, vengono modificati soprattutto al fine
di aumentarne la resistenza da parte delle nucleasi (queste molecole degradano con molta facilità
gli AON) e di aumentare l’affinità con il target. Le modifiche che possono essere fatte sul substrato
zuccherino, sulla base o sul backbone. Gli Oligo Nucleotidi Antisenso possono essere distinti in tre
generazioni a seconda delle modificazioni che sono state effettuate nel corso del tempo:
a. AON di prima generazione – ottenuti per modifiche del backbone. Le modificazioni più fre-
quente è quella che prevede la sostituzione di un ossigeno non a ponte con un atomo di zolfo.
Questo fa sì che venga aumentata la resistenza della molecola, che si abbia un maggiore
uptake e che aumenti la capacità di attivare l’RNA-si H. Gli svantaggi principali di questa prima
generazione sono quelli legati ad una maggiore citotossicità e ad una bassa permeabilità della
barriera ematoencefalica (BEE); questi due svantaggi potrebbero costituire una grossa
limitazione nel loro utilizzo.
b. AON di seconda generazione – ottenuti per modifiche a livello dello zucchero. In particolar
modo se ne distinguono di due tipologie:
• 2’-O-Me e 2’-O-MOE, che prevedono delle modifiche in pos 2’ del ribosio.
• locked nucleic acid (LNA), che prevedono delle modifiche al carbonio in 4’ legato
all’ossidrile in 2’.
In entrambi i casi si ha come vantaggio l’aumentata ibridazione con target e una maggiore
resistenza alle nucleasi. Lo svantaggio principale è dato dall’incapacità di entrambe le tipologie
di reclutare l’RNA-si H, e quindi possono solo funzionare per ingombro sterico. Altri AON di
seconda generazione sono stati ottenuti per modifiche a livello delle basi azotate. La terza
generazione ha come vantaggio quello di indurre un’aumentata ibridazione con il target; ma
come svantaggio una ridotta resistenza alle nucleasi.
c. AON di terza generazione - ottenuti per modifiche dell’anello furanico del nucleotide. Quelli
più utilizzati di solito sono di due tipi:
• Il Peptide nucleic acid (PNA), è costituito dagli analoghi peptidici dei nucleotidi. Questi
peptidi hanno il vantaggio di non attivare l’RNA-si H, e quindi possono funzionare per
ingombro sterico e hanno un’elevata affinità e specificità di ibridazione con il target
(producono un silenziamento molto efficiente). Il vantaggio di interagire per ingombro
sterico garantisce una maggiore attività dell’AON che dura nel tempo perché questi
non vengono degradati.
• Il Phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO), gli AON appartenenti a questa
tipologia vengono più comunemente chiamati “morfolino” dal nome dell’anello della
73
struttura che li caratterizza. La loro funzione è data per ingombro sterico. Vengono
spesso utilizzati nei modelli in vivo animali, in quanto si sono dimostrati parecchio
efficaci nel silenziamento genico da un punto di vista della durata, e una ridotta cito-
tossicità rispetto agli AON visti in precedenza.
3. RNA interference (RNAi). Queste molecole vengono utilizzate quando si vuole silenziare
l’espressione di un determinato gene. Quello dell’RNAi è un processo fisiologico che avviene
all’interno delle cellule (a seguito della trascrizione) per regolare la vita di un determi-nato mRNA
e si basa sulla generazione di sequenze di Double Strand RNA (DS) che vengono processati al fine
di ottenere molecole di micro RNA che verranno poi utilizzate (da un complesso multiproteico)
come stampo per L’RNA che deve essere degradato. Esistono due diverse moleco-le che possono
originare dall’RNA interference:
a. Il Small interfering RNAs (siRNAs) - I componenti cellulari necessari per generare i siRNA sono
quattro:
• Dicer (RNAse di tipo III ribonucleasi RNA dipendente) è l’enzima iniziatore dell’RNAi per la
prodizione dei siRNA. Questo enzima processa il dsRNA (a doppio filamento) in sRNA (fila-
mento singolo).
• Small interfering RNA, ovvero il siRNA vero e proprio, dato da sequenze di 21-23 nucleotidi
di dsRNA, prodotti dalla cellula a partire dal taglio di un dsRNA di partenza. Vengono
incorpora-ti allinterno dell’enzima RISC e fungono da guida per la degradazione di
specifiche sequenze dell’mRNA (proprio per la complementarietà del siRNA rispetto al
mRNA).
• RNA-Induced Silencing Complex (RISC), ovvero un complesso enzimatico che lega l’mRNA
messaggero endogeno complementare al siRNA presente al suo interno. È un complesso
nucleasico costituito sia da proteine che da RNA.
• RNA-Dependent RNA Polymerase (RdRP), amplifica l’effetto di silenziamento.
Partendo da una molecola di dsRNA che viene tagliato dal Dicer per ottenere coppie più corte
di RNA non complementari alle estremità (leggermente sfalsate). Queste coppie sono i siRNA,
i quali vengono riconosciuti e legati al complesso RISC in modo da legare solo un singolo strand
(ovvero solo quello complementare al mRNA da degradare) e degrada la sequenza che
corrisponde al messaggero stesso (per complementarietà) in modo da silenziare l’espressione
genica di quel segmento di mRNA. I vantaggi nell’utilizzo del siRNA rispetto agli AON sono
dovuti ad una maggiore efficacia e sensibilità. Il siRNA che viene sintetizzato può essere fornito
e introdotto all’interno della cellula la quale può farlo funzionare in maniera fisiologica.
Mentre gli AON vengono degradati a seguito dell’attivazione dellRNA-si H, invece il siRNA
viene mantenuto all’interno del complesso RISC (portando alla degradazione del messaggero).
Modificare un AON richiede costi elevati, a differenza dei siRNA che sono particolarmente
semplici da produrre e da trasfettare all’interno di un vettore.
b. Il Micro RNAs (miRNAs). Prevede componenti aggiuntivi oltre quelli del siRNA che sono il
Drosha e l’Argonauta. Il funzionamento del micro RNA prevede la formazione di strutture
dette stem loop, che vengono processate dall’enzima Drosha e successivamente trasportate
dal nucleo al citoplasma dove successivamente vengono digerite ad opera del Dicer e caricate
sul complesso RISC. A questo punto, il processo è uguale a quello del siRNA.
74
6.6 I vettori
Sono i veicoli per l’introduzione e l’espressione di DNA/RNA esogeni in cellule bersaglio. I vettori si distinguono in due grosse categorie: virali e non virali.
1. Vettori non virali (attraverso metodi fisici e chimici): a. Plasmidi nudi b. Elettroporazione in vivo c. Liposomi d. Amine, proteine cariche positivamente
2. Vettori virali (attraverso metodi virali): a. Adenovirus b. Retrovirus c. Virus adeno-associati d. Lentivirus (derivati da HIV) e. Herpesvirus
Vettore ideale. i requisiti per un vettore ideale sono i seguenti:
1. Ampio Tropismo di espressione, per garantire la localizzazione del transgene sia a livello trasduzionale (il vettore infetta cellule specifiche), che a livello trascrizionale (il gene viene espresso solo in alcune cellule).
2. Durata di espressione, per far sì che l’effetto duri nel tempo. 3. Livello di espressione, possibilmente regolabile, soprattutto se il vettore trasporta una pro-
teina mutata e che può essere tossica per la cellula. 4. Scarsa tossicità.
Metodi di trasfezione. La scelta del metodo di trasfezione più appropriato dipende da diversi fattori: 1. tipo cellulare (linea immortalizzata, linea primaria – le linee primarie sono difficilissime da
trafettare, mentre le cellule immortalizzate più facilmente accettano DNA esogeno che viene mantenuto ed espresso per più tempo a causa delle loro frequenti replicazioni che rendono il macchinario cellulare sempre attivo alla traduzione e trascrizione del DNA esogeno);
2. dimensione del transgene, più questo è grande più bisognerà passare ad un metodo fisico piuttosto che un altro;
3. sicurezza (virus implicano un livello di sicurezza maggiore rispetto alle tecniche non virali); 4. efficienza desiderata; 5. costo; 6. tempo etc.
Non tutti i metodi di trasfezione possono essere utilizzati in maniera standard con tutti i tipi cellulari
o in tutti gli esperimenti. Esiste una notevole variabilità in termini di efficienza, vitalità, espressione
genica ottenuta, etc. E’ necessario settare le condizioni di trasfezione ottimale per ciascuna linea
cellulare e per ciascun gene di interesse.
① METODI FISICI E CHIMICI PER VETTORI NON VIRALI.
1. Metodi chimici. I metodi chimici sono tecniche che prevedono l’utilizzo di molecole ‘carrier’
per poter superare la barriera costituita dalla membrana cellulare. Non si hanno reazioni
chimiche con formazione di legami, il principio consiste nell’interazione tra gli acidi nucleici
carichi negativamente con molecole cariche positivamente (mascheramento delle cariche
negative), come polimeri o lipidi, che permettano agli acidi nucleici di entrare in contatto con
75
le componenti della membrana cariche negativamente e quindi di poter essere incorporati
nella cellula mediante endocitosi, e quindi rilasciati nel citoplasma.
a. DEAE (Diethylaminoethyl)-dextran. E’ stato il primo metodo non virale, messo a punto da
Vaheri and Pagano in 1965. Il destrano è un polisaccaride costituito da unita di D-glucosio
legate mediante legami di tipo alfa1/4 o alfa1/6. Quando viene associato a gruppi carichi
positivamente DEAE (dietilamminoetile) e in grado di legare il DNA (attraverso legami non
covalenti) e di mediarne l’ingresso attraverso le membrane, schermando le sue cariche
negative. Il principio sul quale si basa il DEAE è, per l’appunto, la formazione di un
complesso tra il DEAE-destrano e il DNA caratterizzato dall’avere un eccesso di carica
positiva (fornito dal DEAE- destrano) che facilita l’avvicinamento del DNA alla membrana
(avente il suo foglietto extracellulare leggermente carico negativamente e per questa
ragione è incompatibile col DNA). Grazie ad un pre-trattamento con glicerolo o DMSO che
sono in grado di modificare temporaneamente la permeabilità della membrana al DNA e
il su uptake avviene per endocitosi. Il vantaggio dell’utilizzo di questa tecnica è dovuto
alla sua semplicità, seppur poco costosa risulta poco efficiente per via dell’alta tossicità
scaturita dall’uso di glicerolo e DMSO che possono essere dannosi per la cellula (shock
osmotico). Un’altra strategia utile per aumentare l’efficienza di trasfezione consiste
nell’utilizzo di questi due composti in abbinamento ad un altro composto, la clorochna,
che si lega al DNA e inibisce la sua degradazione lisosomiale (excape).
76
b. Calcio fosfato. È un metodo simile a quello del DEAE-Dextran, testato e sviluppato da
Graham e van der Ebb nel 1973. Il principio si basa sul mascheramento della carica
negativa del DNA grazie ad un eccesso di carica positiva. Il metodo prevede che il DNA del
plasmide venga mischiato direttamente con una soluzione concentrata di CaCl2, e
successivamente viene aggiunto goccia a goccia a un buffer fosfato per formare un fine
precipitato caratterizzato da un eccesso di carica positiva che ingloba il DNA plasmidico.
In questo caso, probabilmente, l’uptake del DNA avviene per endocitosi. Nel momento in
cui il precipitato entra all’interno della cellula, la situazione di pH all’interno del citosol
viene a mutare, questo fa sì che il precipitato di disgreghi e venga rilasciato il DNA plasmi-
dico che è libero di entrare nel nucleo. I vantaggi dell’utilizzo del calcio fosfato sono molto
simili a quelli del DEAE-Dextran e prevedono l’economicità e la versatilità. Gli svantaggi
riguardanti tale metodo sono determinati:
• da una bassa efficienza;
• da una elevata tossicità per le cellule;
• non è funzionante verso alcuni tipi di cellule;
ESEMPIO DI PROTOCOLLO STANDARD (utilizzando la tecnica del DEAE- Destrano)
1. Piastrare le cellule per l’esperimento: a. piastrare il giorno prima della trasfezione - è importante che le cellule si trovino in fase
logaritmica al momento della trasfezione, poiché queste sono in fase di replicazione esponenziale, se si effettua una trasfezione con plasmide bisogna tener presente che questo deve entrare all’interno del nucleo una volta entrato nel citosol, questa operazione viene facilitata durante la replicazione cellulare perché il nucleo viene disassemblato e sarà più facile per il plasmide interagire con il DNA della cellula. Un’altra motivazione per cui vengono scelte le cellule in fase log, soprattutto in quei DEAE-Dextran casi in cui si vuole sovraesprimere una determinata proteina è importante che le cellule abbiano un assetto metabolico attivo e un sistema di trascri-zione e traduzione attivo.
b. il giorno della trasfezione le cellule devono avere una confluenza del 30-60%, perché l’esperimento di trascrizione prevede che il DNA venga internalizzato dando alla cellula il tempo necessario (circa 48 ore) per poter trascrivere e tradurre il DNA; se le cellule sono già in confluenza si andrebbe incontro alla fase stazionaria entro le 48 ore e si rischierebbe di avere cellule più attive.
2. Preparare il MIX di trasfezione: diluire il DNA in un tampone opportuno (ad es. tampone fosfato – PBS), aggiungere il DEAE-Dextran e mischiare delicatamente in modo da favorire la formazione del complesso di DEAE-destrano e DNA;
3. Aspirare il medium dalle cellule. Lavarle due volte con un tampone fosfato (PBS) che deve avere una caratteristica isotonicità rispetto alle cellule stesse.
4. Aggiungere il mix DNA/DEAE-dextran alle cellule. 5. Incubare le piastre a 37 °C per 30 minuti. 6. Aggiungere delicatamente il medium (perché le cellule non possono stare a contatto con il
tampone fosfato per un tempo molto lungo), il terreno di coltura deve essere comprensivo di nutrienti e del siero. Incubare fino a 2.5 ore a 37 °C poi cambiare il medium (e con esso vengono sottratti tutti i reagenti di trasfezione) e fare shock con DMSO, per favorire la permeabilità della membrana cellulare e per permettere al DNA (depositato sulle membrane) di penetrare all’interno della cellula.
77
• a differenza del precedente metodo risulta più delicato dal punto di vista tecnico
poiché l’efficienza dipende dal tipo di precipitato che si ottiene (forma e
dimensione) che dipendono dalla soluzione di calcio fosfato e quindi le variazioni
di pH possono influenzare l’efficienza di trasfezione.
c. Lipofezione. È uno dei metodi chimici più utilizzati in quanto meno tossico e più efficiente.
Tra i metodi di trasfezione appartenenti a questa categoria, distinguiamo:
A) Lipidi cationici;
B) Reagenti liposomiali a multicomponente: combinazioni di lipidi e polimeri
C) Reagenti liposomiali a multicomponente coniugati con anticorpi o ligandi che aiuta-
no il targeting specifico.
Generalmente vengono utilizzati lipidi cationici che mimano la struttura di un fosfolipide,
infatti sono composti da:
• una testa carica positivamente (ammina) che costituisce il dominio cationico;
• un gruppo linker come unestere o un etere (spaziatore);
• due o più code idrofobiche (ancore idrofobiche);
Nel momento in cui questi lipidi cationici vengono introdotti in acqua formano delle
strutture a micella cava, i liposomi, che ha affinità chimica con la struttura della membrana
cellulare. La disposizione dei lipidi all’interno del liposoma sarà tale che le teste polari si
disporranno sul esterno e lungo il lume interno a contatto con i liquidi acquosi, mentre le
code idrofobiche sul versante interno vicine le une con le altre (allontanandosi
dall’ambiente acquoso). Se questi lipidi vengono messi a contatto con il DNA plasmidico,
questo verrà attratto e complessato dalle teste polari cariche positivamente. Grazie a
questo principio il DNA può stratificarsi o sulla superficie esterna o all’interno della
particella liposomica. In questo modi di andranno a mascherare efficacemente le cariche
negative del DNA plasmidico. Per di più, essendo la membrana del liposoma altamente
ESEMPIO DI PROTOCOLLO STANDARD (utilizzando la tecnica del calcio fosfato)
1. Piastrare le cellule per l’esperimento: a. piastrare il giorno prima della trasfezione; b. il giorno della trasfezione le cellule devono avere una confluenza del 30-60%
2. La mattina della trasfezione è necessario cambiare il medium (per lavorare quanto più possibile in condizioni iso-osmotiche e isotoniche).
3. Dopo almeno 2 ore, trasfettare le cellule:
• mettere buffer fosfato in tubi sterili;
• aggiungere il DNA e mischiare,
• aggiungere goccia a goccia il CaCl2;
• incubare 20 minuti (per consentire la formazione dei precipitati di DNA e calcio).
• aggiungere la soluzione di precipitati goccia a goccia sulle cellule e mettere nell’incubatore.
• cambiare il medium il giorno successivo (a differenza di come di faceva per il DEAE-Dextran.
78
compatibile con la membrana cellulare, dunque verrà facilmente favorita l’interna-
lizzazione di tale struttura all’interno della cellula bersaglio senza la necessità di utilizzare
dei composti (come glicerolo e DMSO) che alterano la permeabilità della membrana.
Questi lipidi cationici sono un misto di lipidi policationici e neutri, permette la formazione
di vescicole liposomiali unilamellari (proprio per l’aggiunta dei lipidi neutri) che portano
una carica netta positiva; questo meccanismo gli permette di sfuggire facilmente
(excaping del DNA) dall’endosoma. La testa cationica del composto lipidico si associa ai
gruppi P negativi dell’acido nucleico. Si suppone che complessi lipidi-DNA si fondano con
le membrane cellulari rilasciando spontaneamente il loro contenuto nelle cellule; oppure
quello che pensa nella maggior parte dei casi è che la vescicola stessa venga internalizzata
nel citosol per endocitosi.
Figura 14. Trasfezione ed endocitosi mediata da Lipoplex. Lipidi cationici che formano strutture micellari
chiamate i liposomi sono complessati con il DNA per creare lipoplessi. Le strutture si fondono con la
membrana cellulare, almeno a volte dopo interazioni con proteoglicani di superficie. I complessi sono
interiorizzati dall'endocitosi, con conseguente formazione di una vescicola micellare invertita a doppio strato.
Durante la maturazione del endosoma in un lisosoma, la parete endosomiale potrebbe rompersi, rilasciando
il DNA contenuto nel citoplasma e potenzialmente verso il nucleo. Il DNA importato nel nucleo potrebbe
risultare in un gene espressione. In alternativa, il DNA potrebbe essere degradato all'interno del lisosoma.
Come precedentemente riportato, il principale problema di questi composti è la loro
degradazione liposomiale. Per ovviare alla degradazione lisosomiale, i lipidi cationici
vengono mischiati con lipidi neutri (lipidi Helper; es DOPE), che permettono la formazione
di vescicole unilammellari a netta carica positiva. Gli acidi nucleici si assorbono in questa
struttura impacchettata. L’Uptake avviene presumibilmente mediante endocitosi. Il lipide
helper permette al DNA di uscire dall’endosoma. Questa tecnica ha il vantaggio di avere
una bassissima tossicità per la cellula ed un’alta efficienza di trasfezione, che seppur
proprietà al quanto soddisfacenti rimangono inferiori rispetto agli svantaggi che sono
legati alla loro difficoltà di produzione (infatti i liposomi devono essere per forza acqui-
stati) e per tale ragione presentano un costo poco economico.
LIPOFECTAMINA: Reagenti e metodo. La lipofectamina fu uno dei primi reagenti sviluppati
nel campo della lipofezione. Si tratta di un mix 3:1 di lipidi cationici e lipidi neutri.
Generalmente la lipofectamina può essere addizionata a degli agenti che vengono detti
79
direzionanti. Un esempio di agente direzionante è la transferrina, un ligando che viene
addizionato al mix di liposoma e DNA perché presenta numerosi recettori di membrana
specifici per la transferina (normalmente espressi in molti tipi cellulari diversi) che facilita
l’avvicinamento della vescicola del liposoma con il DNA alla membrana plasmatica, e
l’interazione proteina-proteina fa sì che la vescicola si fonda con essa e successivamente
indotta a rilasciare il suo contenuto nel citosol.
Quando le cellule vengono coltivate in assenza di siero, però, si attivano tutta una serie
di meccanismi catabolici che ad esempio portano alla produzione di metaboliti di
rapido utilizzo che possono essere utilizzati al posto dei componenti del siero. Tali
risposte potrebbero influenzare i risultati dell’esperimento. A tal proposito sono stati
formulati dei terreni specifici per la lipofezione che consentono di lavorare a basse
concentrazioni di siero.
Altri formulati di lipofectamina. Nel corso del tempo si sono susseguite varie
formulazioni di lipofectamina. La Lipofectamina 3000 è quella che viene utilizzata di
più in assoluto che, rispetto alla lipo-fectamina descritta in precedenza, ha come
vantaggio una durata minore in termini di tempo (5 min) di complessazione del DNA.
Infatti per la lipofectamina vista pre-cedentemente occorrono circa 30 min affinché
questa riesca a complessare il DNA plasmidico. La lipofectamina 3000 non necessita di
un cambio di terreno, né prima e né dopo la transfezione (questo è un punto molto
importante perché il cambio del terreno può divenire un’operazione al quanto
ESEMPIO DI PROTOCOLLO STANDARD (utilizzando lipofectamina)
1. Le cellule vengono seminate il giorno prima e devono arrivare a una confluenza del
50-80% (ottimizzazione della densità cellulare);
2. Si effettua la trasfezione vera e propria:
a. Si va a diluire il DNA in medium privo di siero e antibiotici perché è stato
dimostrato che questi inibiscono, o riducono l’efficacia, dei liposomi in fase di
transfezione. La rimozione degli antibiotici può essere mantenuta per tutta la
notte dall’inizio della transfezione in poi; mentre il siero viene riaggiunto di solito
3 ore dopo la transfezione (operazione consigliabile).
b. Viene addizioanata la Transferrina e viene lasciato reagire per circa 15 min in
incubazione in modo che si formi il complesso DNA-transferrina.
c. Si addiziona la Lipofectamina in D-MEM privo di siero e si lascia reagire per 15 min
sempre in incubazione.
d. Si effettua l’eliminazione del medium di crescita dalle piastre; e si riag-giunge un
medium privo di siero e Antibiotici (a metà del volume).
3. Dopo 30 min dall’inizio della transfezione le cellule possono essere incuba per circa 3
ore.
4. Si aggiunge il siero (in proporzione doppia) e gli antibiotici in modo da rimet-tere le
cellule in una condizione per loro ottimale.
5. Il giorno successivo si esegue il cambio del medium e relativi trattamenti.
80
stressogena per le cellule, le quali necessariamente devono re-instaurare nuove
connessioni e riadattarsi al nuovo terreno di crescita); quindi il fatto di non dover
intervenire sulle condizioni di crescita durante la lipofezione rappresenta un grosso
vantaggio di questa tecnica. Tutte le altre formulazioni successive hanno certamente
lo scopo di ridurre i tempi di complessazione e soprattutto vantano una minore
tossicità e una migliore efficienza di trasfezione. La lipofectamina RNAimax è stata
formulata in modo specifico per la trasfezione dei siRNA e dei miRNA; tiene conto del
fatto che il cargo non è ds-DNA ma è RNA. Un’altra formulazione, il LipofectamineR
MessengerMAX™ mRNA Transfection Reagent, è una nuova tecnologia che permette
di trasfettare direttamente un mRNA partendo dalla formazione di un complesso che
coinvolge direttamente l’RNA messaggero. Il vantaggio è legato ai tempi ridotti che
intercorrono nell’espressione del transgene di interesse. Infatti, fornendo un RNA
messaggero già pronto, questo nel momento in cui viene liberato all’interno del
citoplasma è già disponibile per il macchinario cellulare e per la traduzione a proteina.
Di contro, nella trasfettazione del DNA, questo deve prima riuscire ad effettuare
l’excape dall’endosoma, successivamente dal citoplasma trasportato al nucleo,
trascritto, maturato, esportato e solo a questo punto è reso disponibile per l’apparato
di traduzione. Il kit che viene fornito per effettuare questa operazione di trascrizione
consiste in un vettore di espressione (plasmide a DNA) che consente di clonare
all’interno del plasmide oppure di amplificare mediante un sistema PCR, così da ge-
nerare l’RNA messaggero e di poterlo successivamente isolare. Una volta ottenuto
l’RNA messaggero può essere messo a contatto con i liposomi contenuti nel kit e
avviare il processo di trasfezione.
2. Metodi fisici. I metodi fisici permettono di trasferire direttamente nel citosol o nel nucleo
acidi nucleici, senza l’uso di sostanze chimiche. I metodi fisici più utilizzati sono i seguenti:
a. Microiniezione – Metodo fisico per elezione, usato principalmente per la manipolazione
di singole cellule (es. oociti, poiché sono sufficientemente grandi per essere iniettati). Si
basa sull’inserimento di DNA o RNA nella cellula (nel citoplasma o nel nucleo) attraverso
un capillare di vetro, con un sistema ad alta pressione senza danneggiare la cellula stessa.
Date le ridotte dimensioni delle cellule (alcune decine di mm di diametro) la microinie-
zione richiede una sofisticata apparecchiatura che comprende:
• un microscopio;
• un micromanipolatore (per regolare l’inserimento del fluido);
• un iniettore;
come vantaggio di questa tecnica si ha il 100% di efficienza, poiché inserendo diret-
tamente il DNA all’interno del citoplasma del nucleo oltrepassando l’ostacolo fisico della
membrana. Lo svantaggio principale è che si può trasfettare solo un numero limitato di
cellule e quindi la tecnica è molto costosa ed applicabile solo a particolari tipi cellulari ed
è operatore dipendente. È una tecnica molto utilizzata oggi per la fecondazione assistita
e in questo caso il DNA viene inserito nel pro-nucleo.
b. Metodi balistici. Il principio al base di queste metodologie è quello che il DNA viene coat-
tato (adsorbito) su particelle di oro o tungsteno. Le particelle sono accelarate da un forza
81
esterna, applicando un alto voltaggio o attraverso una pressione esercitata da un gas. Nel
momento in cui tali particelle impattano con la membrana plasmatica (o con la parete
cellulare vegetale) vanno a formare dei pori attraverso i quali il DNA viene fisicamente
inserito all’interno della cellula bersaglio. Di solito si utilizza un sistema a pressione
regolabile ad elio per sparare microcarriers d’oro rivestiti di DNA dalla parete interna di
una cartuccia di plastica direttamente sul bersaglio; oppure un sistema per accelerare
microproiettili d’oro o di tungsteno rivestiti di DNA su un bersaglio posto in una camera
sottovuoto. Per l’utilizzo di questa tecnica è bene tenere in considerazione una serie di
parametri fisici molto importanti:
• Velocità con cui la particella colpisce il target – tale velocità è dipendente dal tipo di
proiettile (materiale che li costituisce), dalla forza che gli viene applicata per poter
accelerare o decelerare e in fine dalla distanza del target.
• Rivestimento dei proiettili – influenza fortemente l’efficienza;
• Numero di particelle che entrano nel tessuto – il numero delle particelle che si vuole
“sparare” all’interno delle cellule deve essere determinato poiché esiste un equilibrio
tra efficienza e vitalità cellulare; infatti maggiori saranno le particelle e maggiori sarà
l’efficienza ma di contro saranno maggiori i pori che vengono generati sulla membrana
e questo potrebbe contribuire ad abbassare la vitalità cellulare. Quindi è necessario
trovare un buon compromesso che va determinato sperimentalmente.
I principali strumenti che possono essere utilizzati per la trasfezione con metodi balistici
sono due:
• Sistema della camera a vuoto – è un sistema che accelera microproiettili d’oro o
di tungsteno rivestiti di DNA su un bersaglio posto in una camera sottovuoto sfrut-
tando la pressione dell’elio. • Gene-gun – i proiettili vengono caricati all’interno della “pistola”, lo sparo è otte-
nuto con un’onda supersonica di elio, che passando all’interno della cartuccia, pro-
ietta fuori il contenuto.
Figura 15. Gene-gun.
I vantaggi di questa tecnica si basano principalmente sulle cellule vegetali perché consentono di
lavorare in Situ dato che le cellule vegetali sono difficili da trasfettare per via del fatto che
queste sono provviste di parete cellulare, oltre alla membrana. È una tecnica applicabile
a quei sistemi cellulari poco responsivi ad altri carrier per il trasferimento genico anche in
vivo; dà la possibilità di fare studi di espressione genica in condizioni fisiologiche (espres-
82
sione tessuto specifiche o studi sullo sviluppo). Inoltre, consente di usare meno DNA e
meno cellule di partenza. Gli svantaggi correlati a questa tecnica sono relativi alla sua
maggiore invasività, alla correlazione dipendente della sua efficienza per il tipo cellulare,
occorrono molti parametri da stabilire e controllare, e inoltre per tali ragioni e per il
materiale di cui sono fatti i proiettili si rivela una tecnica molto costosa.
c. Elettroporazione. Se le cellule vengono poste in una soluzione contenente DNA, e
vengono esposte ad un breve impulso elettrico che produce transitoriamente dei pori
nelle loro membrane e il DNA viene veicolato senza necessità di altri reagenti nelle cellule.
Prima dell’impulso elettrico la cellula è completamente integra e impermeabile all’in-
gresso di molecole di DNA; nel momento in cui viene applicato il campo elettrico si osserva
la comparsa di pori temporanei che possono essere sfruttati dal materiale genetico per
entrare all’interno dell’ambiente cellulare. La comparsa dei pori si pensi sia dovuta ad una
temporanea perturbazione dovuta al campo elettrico che interagisce con le cariche della
membrana, che da neutra viene polarizzata. Cessata tale perturbazione, la membrana
torna allo stato originario e il DNA che è entrato viene intrappolato all’in-terno. La tecnica
dell’elettroporazione necessita di uno strumento che è l’elettroporatore, il quale consente
di generare e di regolare un determinato campo elettrico all’interno di una provetta.
L’unica limitazione di questa tecnica è che le cellule si devono trovare in sospensione,
ovvero devono essere staccate dal terreno di coltura e poste temporanea-mente
all’interno di una provetta sterile a contatto con il DNA; al termine devono essere semi-
nate nuovamente. Il vantaggio di questa tecnica risiede principalmente sulla sua efficienza
nel trasfettare anche tipi cellulari difficilmente trasfettabili con metodi chimici. Un altro
vantaggio è che il DNA entra all’interno senza passare per il compartimento endosomiale
e si riduece il rischio di degradazione dello stesso. Gli svantaggi, invece, sono legati
principalmente ad una elevata tossicità (50%) per cui vi è la necessità di ottimizzare le
condizioni del campo elettrico in intensità e durata.
d. Nucleofezione. Vantaggi e svantaggi dei vettori non virali.
Vantaggi. Tra i vantaggi legati dei vettori non virali abbiamo i seguenti:
• dai vettori non virali è impossibile la generazione di nuovi virus patogeni;
• riduzione del rischio di reazione immunitaria (porterebbe ad una alterazione della
normale crescita della coltura cellulare e in alcuni casi anche a tossicità della linea
stessa;
• possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre mole-
cole di DNA anche molto grandi;
• offrono la possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo (in alcuni casi).
Svantaggi. Tra gli svantaggi invece abbiamo i seguenti:
• scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione (effetti non duraturi) e spes-
so hanno una ridotta capacità di dare origine a delle linee cellulari che vengono
modificate in modo stabile – poiché la strategia che spesso si utilizza prevede che
il transgene (nel caso del plasmide) resti in forma episomiale al di fuori del genoma;
83
• Se integrati possono a loro volta possono dare mutagenesi inserzionale e la mo-
difica viene mantenuta nel tempo.
② VETTORI VIRALI (VIRUS).
Un virus (dal latino vīrus, -i, "veleno") è un'entità biologica con caratteristiche di parassita endocel-
lulare obbligato, in quanto si replica esclusivamente all'interno delle cellule degli organismi. Infatti,
questo parassita sfrutta l’assetto metabolico della cellula ospite per produrre le sue proteine strut-
turali. I virus possono infettare tutte le forme di vita, dagli animali, alle piante, ai microrganismi
(compresi altri agenti infettanti come i batteri) e anche altri virus. Quando non si trovano all'interno
di una cellula infetta o nella fase di infettarne una, i virus esistono in forma di particelle indipendenti
e inattive. Queste particelle virali, note anche come virioni, sono costituite da due o tre parti:
1. il materiale genetico costituito da DNA o RNA, lunghe molecole che trasportano le informa-
zioni genetiche;
2. un rivestimento proteico, chiamato capside, che circonda e protegge il materiale genetico;
3. e in alcuni casi una sacca di lipidi che circonda il rivestimento proteico quando sono fuori dalla
cellula (enveloped viruses).
I virioni possono avere forme semplici, elicoidali e icosaedriche, ma anche architetture più complesse.
La maggior parte dei virus possiede virioni che sono troppo piccoli (10-100nm) per essere visti con
un microscopio ottico. In media il virione ha una dimensione di circa un centesimo della dimensione
media di un batterio. I virus si sono evoluti per trasferire il loro materiale genetico nelle cellule in
maniera efficiente e selettiva e per questo vengono utilizzati come vettore per infettare cellule di
mammifero.
Meccanismo di infezione. Quando un virus aderisce alla cellula bersaglio è a partire da questo
momento che inizia il processo di infezione. Il virus inietta il suo materiale genetico all’interno
dell’ospite, il quale viene replicato sfruttando il macchinario cellulare. Dalla moltitudine di copie del
genoma virale duplicato, alcune vengono trascritte in modo da poter avviare tutti quei processi
metabolici che portano all’assemblaggio della componente strutturale di un nuovo virione. Una volta
sintetizzato il capside, il materiale genetico viene inserito al suo interno. Nel momento in cui questi
virioni raggiungono una concentrazione critica, portano la cellula a lisi e la liberazione di nuove
particelle infettive nell’ambiente esterno pronte a dare origine ad una nuova infezione. I virus
vengono definiti come delle vere e proprie “macchine da infezione” ed è il principale motivo per quale
vengono sfruttati come vettori al fine di veicolare il materiale genetico.
Virus come vettore. I vettori virali si ottengono:
1. inserendo il gene di interesse nel genoma del virus, sotto il controllo di un promotore forte
(promotore virale che promuove la trascrizione del gene posto a valle – questo garantisce,
nel momento in cui il gene viene inserito nella cellula bersaglio e viene trascritto rapidamente,
di avere un maggior numero di copie e la massima espressione del nostro transgene.
2. modificando il genoma virale in modo da rendere il virus incapace di riprodursi in maniera
autonoma (virus difettivo). Questo è importante per evitare la diffusione di virus ricombinanti;
3. il genoma virale ingegnerizzato con le tecniche del DNA ricombinante (il genoma del virus
viene di solito digerito in provetta utilizzando degli enzimi di restrizione adatti e di una ligasi),
e trasfettato in particolari linee cellulari capaci di produrre le componenti strutturali del virus
84
(capside e coda) per generare nuove particelle virali ricombinanti, all’interno delle quali, viene
inserito successivamente il genoma modificato.
4. Le linee cellulari che vengono utilizzate sono dette linee di packaging, e sono in grado di
complementare i difetti introdotti nel genoma.
Vantaggi e svantaggi dei vettori virali. Il principale vantaggio dell’utilizzo di vettori virali consiste
nell’elevata efficienza di trasduzione del transgene (che può raggiungere il 100%). Gli svantaggi sono
dati dai seguenti punti:
1. Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti
nell’ospite (svantaggio principale) – per cui questi necessitano di maggiori condizioni di
sicurezza per essere manipolati (è necessario evitare nella maniera più assoluta che i virioni
fuoriescano dal laboratorio);
2. Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma);
3. Molecole di DNA di dimensioni limitate;
4. Reazioni immunitarie;
5. Costi elevati (poiché questi sono difficili da produrre in grandi quantità).
Come si costruisce un vettore virale (virus difettivi). I vettori virali vengono definiti come virus difettivi,
ovvero dei virus che sono stati privati di alcuni geni fondamentali alla sintesi della struttura del virione
(geni che codificano per il capside). Quindi, tali virus difettivi possono essere prodotti solo in parti-
colari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus (cellule di packaging). La loro pre-
parazione deve seguire queste fasi obbligate:
1. Costruzione del genoma ricombinante, che successivamente viene inserito all’interno del
genoma del virus privato di alcuni geni strutturali;
2. Trasfezione del DNA (o RNA) nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali (cellule
di packaging) – vengono prodotte solo le componenti strutturali – nel momento in cui tali
strutture (capside) vengono riempite con il genoma ricombinante, si formano dei virioni
completi capaci di infettare delle cellule bersaglio.
3. Vengono raccolte le cellule, e i virioni secreti nel terreno (liberati dalle cellule di packaging),
si procede con la titolazione dei virioni per millilitro e analisi del virus (costatate l’effettiva
capacità di infezione del virus e che questa non sia possibile una seconda volta dopo la prima
infezione di interesse - in sostanza, bisogna assicurarsi che i virus prodotti non diano origine
a virioni maturi anche se questi sono stati privati dei geni codificanti per il capside).
Linee cellulari di Packaging. Sono linee cellulari trasfettate (transientemente o stabilmente) con geni
virali codificanti per proteine strutturali del virus, necessarie per l’assemblaggio dei virioni. La loro
trasfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione
maturo. In questo modo si ottiene un vettore virale completo e pronto per la trasfezione.
85
Figura 16. Funzionamento delle Packaging cell.
Nella figura 16, viene riassunto il funzionamento delle packaging cells. Le cellule di “impacchetta-
mento” sono cellule che vengono munite di costrutti che codificano per le proteine strutturali del
virus. Sono sprovviste di DNA al loro interno finché non gli viene fornito il vettore di trasfezione con
il gene di interesse. A seguito della trasfezione la cellula di packaging produce e rilascia nel terreno di
coltura i virioni maturi, che successivamente possono essere raccolti e usati per infettare le cellule di
interesse. Quindi le packaging cell possono essere considerate come delle “fabbriche” per i virioni.
Se introdotto del DNA all’interno delle packaging cells, tale DNA può essere introdotto all’interno del
capside virale e generare delle particelle infettive che possono infettare delle cellule target. I tali
cellule bersaglio, tutto ciò che era contenuto nel genoma virale viene espresso e successivamente
duplicato. Il materiale genetico non può essere utilizzato per l’assemblamento di nuovi virioni in
quanto il genoma virale è stato precedentemente privato dei geni codificanti per il capside.
L’impossibilità di generare nuovi virioni infettivi a seguito della prima infezione è di fondamentale
importanza al fine di garantire la sicurezza del sistema, dell’operatore e dell’ambiente.
Virus utilizzati per i vettori. I principali virus che vengono utilizzati per generare dei vettori virali sono:
1. Retrovirus. Possono infettare solo cellule in divisione e si integrano stabilmente (attraverso il
loro genoma) in maniera casuale – questo potrebbe essere un problema perché il gene di
interesse potrebbe andare ad inserirsi in una sequenza e andare a silenziare l’espressione
genica di un determinato gene cellulare, o viceversa andare ad integrarsi in una regione che
non viene espressa nonostante l’infezione sia avvenuta in modo efficiente. Di questa
categoria fanno parte:
a. Retrovirus murini (Moloney murine leukemia virus) – Non sono noti membri capaci di
provocare malattie nell’uomo. Vengono inattivati dal complemento umano. Possiedono
un envelope (rivestimento) lipidico e non resistono al disseccamento. Hanno un genoma
abbastanza piccolo (10 Kb) costituito da una molecola di RNAss; dopo l’infezione il
genoma è retrotrascritto a DNAds che viene integrato nel genoma dell’ospite (possibile
mutagenesi). È opportuno ricordare che i retrovirus infettano solo cellule in divisione.
Questa può essere una limitazione qualora si voglia utilizzare questa tipologia di virus per
generare per andare ad infettare delle cellule post-mitotiche.
86
ciclo vitale di un retrovirus. Il ciclo vitale parte con il riconoscimento di una proteina sulla
superficie della particella virale da parte di una proteina presente sulla superficie della
cellula ospite. Il riconoscimento proteina-proteina fa sì che il virus venga ancora-to sulla
superficie della cellula bersaglio così che questo possa rilasciarvi il suo contenuto all’in-
terno. Nel momento in cui avviene la fusione, si ha quello che viene definito uncutting,
ovvero l’eliminazione delle parti strutturali del virus. Il genoma che si libera all’interno
dell’ospite viene retrotrascitto e, una volta giunto nl nucleo, può integrare il DNA cellulare
formando il pro-virus. Il genoma virale verrà contemporaneamente duplicato insieme a
quello dell’ospite, poi trascritto e tradotto per dare origine a nuove particelle virali
potenzialmente infettive che, in seguito, verranno espulse all’esterno della cella cellula.
Figura 17. Ciclo vitale di un retrovirus.
Genoma retrovirale. Il genoma retrovirale, in modo molto semplificato, è costituito da tre
geni principali che sono:
• gag: codifica per le proteine del core
• pol: codifica per la trascrittasi inversa necessaria per poter trascrivere il genoma da DNA a RNA (che verrà integrato nella cellula bersagli)
• env: codifica per la sostanza lipidica e proteica dell’envelope.
Molto importanti sono anche le sequenze terminali di questo genoma, denominate LTR
(Long Terminal Repeat), che comprendono promotore/enhancers e sequenze necessarie
per l’integrazione del genoma all’interno dell’ospite. Un’altra sequenza importantissima
è la sequenza Ψ che prende il nome di sequenza di packaging, la quale viene riconosciuta
dalle proteine strutturali e stabilisce quale è il tipo di genoma che dovrà essere inserito
all’interno del capside.
87
Vettori retrovirali e replicazione deficitaria. La rimozione dei geni che codificano per le
proteine strutturali permette l’inserimento del genoma di interesse. Tale delezione è
importante perché ci assicura che il virus non dia luogo ad una seconda infezione. Il
vettore che si ottiene non è in grado di produrre le proteine virali necessarie per un altro
ciclo di infezione (vettore difettivo nella replicazione). I geni virali gag, pol ed env sono
sostituiti con il cDNA del gene di interesse. Le sequenze LTR devono essere mantenute
(necessarie per l’integrazione e la trascrizione), così come va mantenuta la sequenza di
packaging (Ψ) che è indispensabile per l’introduzione del DNA ricombinante all’interno del
capside. Infatti il genoma ottenuto deve essere trasfettato in una linea cellulare di
packaging che è in grado di produrre le proteine strutturali, di riconoscere il genoma
ricombinante come endogeno da inserire all’interno del capside (perché tale genoma
possiede la sequenza Ψ). Le sequenze LTR e Ψ rimarranno in cis, mentre le sequenze GAG,
POL ed ENV verranno complementate in trans, quando vengono prodotti dalle cellule di
packaging.
Dopo aver introdotto il genoma ricombinato è necessario che questo sia posto sotto il
controllo di un gene promotore (virale o eucariotico) che ne consente l’espressione; e
spesso anche un gene che codifica per la resistenza (marker di selezione per neomicina o
beta-galattosidasi) e che permette di capire quali cellule sono state infettate. Il transgene
non può superare una dimensione massima di 9kb. Lo step successivo sarà quello di
inserire il genoma ricombinante all’interno di una linea cellulare di packaging che
consentirà l’assemblaggio di virioni maturi infettivi. Le cellule di packaging sono cellule
che vengono trasfettate stabilemnte con dei geni che codificano per i geni GAG, POL ed
ENV. Questo fa sì che all’interno della stessa cellula si avrà la produzione dei capsidi e
dell’envelope all’interno del quale verrà inserito il vettore geneticamente modificato
(perché viene mantenuta la sequenza Ψ). Alla fine verranno rilasciate delleparticelle virali
complete che potranno generare un solo ciclo di infezione.
Figura 18. Genoma retrovirale.
LTR Ψ GAG POL ENV LTR
LTR Ψ GAG POL ENV LTR
LTR Ψ cDNA LTR
LTR Ψ neo prom. cDNA LTR
Figura 19. Formazione di un virus difettivo.
88
Vantaggi e svantaggi. I vantaggi dell’utilizzo di retrovirus murini è principalmente quello
di non provocare malattie nell’uomo, di indurre una risposta immunitaria molto debole
nell’ospite. I transgeni possono essere espressi per tutta la vita dell’ospite. Possono dar
luogo ad integrazione stabile del materiale genetico recato dal vettore nel genoma delle
cellule bersaglio. Sfruttando lo pseudotyping sono in grado di infettare efficientemente
una vasta gamma di tipi cellulari. Presentano un’alta efficienza di trasduzione. Lo svantag-
gio principale è dato dal fatto che sono in grado di infettare solo cellule in attiva
divisione.Presentano un potenziale oncogeno perché si integrano nel genoma dell’ospite
in molteplici siti. Sono difficili da coltivare e vengono solitamente recuperate con un basso
titolo (basso numero di virioni per ml, 106-107 particelle virali per ml). Possono subire inat-
tivazione trascrizionale in vivo.
b. Lentivirus. Come i retrovirus, i lentivirus possono essere usati come vettori virali. Sono derivati del virus dell'HIV. Questi possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale. Le proteine virali necessarie per l’infezione iniziale vengono fornite in trans da:
I. CELLULE DI PACKAGING.Lo sviluppo dei vettori lentivirali ha previsto uno sviluppo sequenziale che va dai lentivirus di prima generazione fino a quelli di terza generazione. Lentivirus di prima generazione. Prevedevano l’utilizzo di cellule di packaging
trasfettate stabilmente con il genoma di un retrovirus MLV privato di Ψ. La linea
cellulare ottenuta complementava costrutti privi di gag, pol e env, ma i titoli
ottenuti sono bassi e la frequenza di ricombinazione con produzione di revertanti
replicazione competenti (RCR) è troppo elevata. In pratica, si aveva un evento di
ricombinazione tra il genoma ricombinante che conteneva la sequenza di
packaging e il plasmide che conteneva i costrutti GAG, POL ed ENV e le sequenze
LTR, facilmente riacquistava la sequenza Ψ. Alla fine si aveva la produzione di
revertanti replicazione competenti (RCR) che riacquistavano la capacità di
replicare in modo autonomo. Ovviamente questo era molto pericoloso.
Lentivirus di seconda generazione. Per ridurre il rischio di ottenere RCR per i
lentivirus di seconda generazione si è deciso di utilizzare cellule di packaging
trasfettate stabilmente con un plasmide che codifica per i geni gag, pol e env senza
la sequenza di packaging e nemmeno il LTR.
Lentivirus di terza generazione. Per ridurre ulteriormente il rischio di ricom-
binazione, la tecnica utilizzata consiste nel separare su plasmidi differenti i geni
che codificano per le proteine strutturali che verranno poi complementate dalle
cellule di packaging. In particolar modo i geni gag e pol vengono espressi su un
plasmide diverso da quello esprimente env, e non più sotto il controllo di LTR..
Questa tecnica prende il nome di “split genome”. Questi plasmidi, insieme al gene
di interesse, vengono co-trasfettati all’interno delle cellule di packaging per la
produzione di vettori virali. Splittando il genoma di un virus si riduce la probabilità
che grazie ad un evento di ricombinazione, questo riacquisisca tutti i geni strut-
turali di cui era stato privato, andando incontro alla formazione di RCR.
89
II. VIRUS HELPER. Un altro modo per ottenere un vettore lentivirale è quello di
inserire i geni strutturali all’interno di un virus helper, privato della sequenza di
packaging. Quello che generalmente viene fatto è trasfettare le cellule con vettore
geneticamente modificato e contemporaneamente infettarle con il virus helper,
in modo da complementare in trans le particelle virali mancanti, ottenendo così,
un vettore virale perfettamente infettivo. Ogni retrovirus è in grado di infettare un
particolare tipo cellulare grazie all’ espressione di specifiche proteine codificate
dai geni env. Spesso, quando si costruiscono dei vettori retrovirali, si sfrutta lo
speudotyping, ovvero la caratteristica di incorporare le proteine env di un altro
retrovirus - modificando i geni env è possibile modificare il tropismo virale (viene
modificato il bersaglio di un determinato retrovirus scegliendo di aumentare
l’efficienza di infezione verso un tipo cellulare di interesse) e/o aumentare il titolo.
del vettore. Le proteine env endogene o eterologhe vengono fornite in trans ad
un retrovirus difettivo per la replicazione.
Vantaggi e svantaggi. Il vantaggio principale è dato dalla loro capacità infettiva
verso cellule in divisione e cellule quiescenti. I transgeni possono essere espressi
per tutta la vita dell’ospite. Un altro vantaggio è dato dall’integrazione del mate-
riale genetico recato dal vettore nel genoma delle cellule bersaglio. Solitamente
non sono inattivati dal complemento. Possono essere somministrati in vivo. Gli
svantaggi sono legati principalmente alla loro virulenza in quanto sono in grado di
provocare malattia nell’uomo. Sono difficili da coltivare. Inoltre hanno un elevato
potenziale oncogeno perché si integrano nel genoma dell’ospite in molteplici siti,
e talvolta vengono ad alterare l’espressione di alcuni geni coinvolti nella regola-
zione del ciclo cellulare.
2. Adenovirus. sono quelli più utilizzati perché sono in grado di esprimere ad alti livelli il trans-
gene inserito al loro interno, non si integrano stabilmente e come svantaggio danno grosse
reazioni immunitarie nelle cellule bersaglio. Sono virus a DNA con un genoma molto più gran-
de di quello di un retrovirus e ai lentivirus costituito da 36kb. Sono virus privi di envelope
esterno e presentano solamente il capside che ha una struttura icosaedrica regolare. Il ge-
noma è fiancheggiato da sequenze ITR (inverted terminal repeats) che servono come origine
di replicazione. Dopo l’infezione il virus entra nel nucleo della cellula ospite e viene replicato
rimanendo in forma episomiale (ovvero non viene integrato nel genoma dell’ospite). Il loro
vantaggio principale è dato dalla capacità di infettare cellule in replicazione e cellule
quiescenti. Come i retrovirus possono essere dotati di ampio trofismo.
Processo di internalizzazione. Gli Adenovirus sono internalizzati dalle cellule attraverso un
processo di endocitosi mediata da recettore. Nel caso dell’Adenovirus i recettori coinvolti nel
riconoscimento (a livello della membrana cellulare dell’ospite) sono CAR e un’integrina.
Questi recettori sono espressi in molti tipi cellulari, ma a livelli diversi di espressione.
L’efficienza di infezione dipende quindi dal numero di recettori che si trovano sulle cellule da
infettare; maggiore sarà tale numero, altrettanto maggiore sarà il grado di infezione.
90
Figura 21. ciclo di infezione di un adenovirus.
Nell’immagine 21, viene raffigurato il ciclo di infezione dell’adenovirus. In primo luogo
si ha il riconoscimento tra una proteina presente sulla superficie virale ed un recettore
proteico presente sulla superficie cellulare. Nel momento in cui avviene il ricono-
scimento si ha il processo di endocitosi mediata da recettore e la particella virale viene
successivamente inegrata all’interno di un endosoma. Quest’ultimo andrà incontro a
Figura 20. Internalizzazione dell'adenovirus.
91
modificazioni che portano la sua forma precoce a quella tardiva (endosoma tardivo –
fino al lisosoma). Il ciclo replicativo dell’adenovirus può essere suddiviso in due fasi:
fase precoce (early-phase) o fase tardiva (late-phase). La trasformazione dell’endo-
soma porta ad una progressiva acidificazione del lume endosomiale, al quale il virione
riesce a sfuggire liberando il suo contenuto (genoma) all’interno del nucleo della
cellula bersaglio. A questo punto ha inizio la fase precoce, in cui si osserva la
trascrizione di geni precoci che hanno il compito di attivare il macchinario replicativo
della cellula e bloccare tutti i punti di controllo del ciclo cellulare in modo che la cellula
non vada incontro ad apoptosi. Una volta attivato il suo ciclo di replicazione, la cellula
duplica con esso anche il genoma virale. Alla fase precoce segue quella tardiva in cui
vengono prodotti e attivati dei geni tardivi (late-genes) che codificano per le proteine
strutturali. Alla fine del ciclo si ha l’assemblaggio di nuovi virioni che possono essere
rilasciati dalla cellula in seguito a lisi indotta della sua membrana plasmatica.
Nel genoma di un adenovirus sono presenti diversi geni: i geni early (E) e i geni late (L).
dei geni early quelli di maggiore importanza sono i geni E1A e E1B.
a. E1A: coinvolto nell’attivazione della trascrizione e nella promozione dell’entrata della
cellula ospite in fase S (lega Rb inducendo il rilascio del fattore di trascrizione E2F). E1A
funziona come l’antigene T di SV40 visto in precedenza per l’immortalizzazione cellulare.
b. E1B: blocca azione di p53 (sempre come l’antigene T di SV40), evitando entrata della
cellula in apoptosi.
c. E2: codifica per 3 proteine coinvolte nella replicazione del DNA e nella modulazione della
trascrizione (DNA-pol; proteina terminale e DNA-binding protein;
d. E3: è responsabile della risposta immunitaria da parte della cellula bersaglio e nel mediare
la lisi cellulare dopo l’assemblaggio delle particelle adenovirali.;
e. E4: regola la trascrizione, la transizione dell’espressione da early a late gene, la
replicazione virale e l’assemblaggio dei virioni;
f. L1-5: coinvolti nella produzione e nell’assemblaggio delle proteine del capside;
Nel normale ciclo vitale degli adenovirus, i geni E1 (immediate early) sono trascritti per primi.
Questi hanno funzioni regolatorie e stimolano la trascrizione dei geni E2, E3 e E4 (early).
Quando si vuole utilizzare un adenovirus come vettore virale è necessario andare a modificare
il genoma dell’adenovirus per eliminare i geni strutturali in modo tale da creare spazio per
l’inserimento del genoma di interesse e soprattutto evitare che il vettore virale sia in grado di
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %
E1A E1B E3
E2B E2A E4
Figura 22. Genoma di un adenovirus.
L1 L2 L3 L4 L5
92
cominciare nuovamente a replicare in maniera autonoma. Oggi sono stati messi a punto
sistemi ricombinanti di adenovirus per l’impiego di laboratorio, più semplici da utilizzare e
meno pericolosi. Sono molto usati anche per il silenziamento genico.
Generazioni di vettori adenovirali.
Prima generazione. I vettori adenovirali di prima generazione furono ottenuti sostituendo
i geni E1a e E1b con il transgene di interesse, posto sotto il controllo di un elemento
enhancer e di un promotore. Il vettore così ottenuto è replicazione-difettivo e le funzioni
replicative vengono fornite in trans dalle cellule di packaging (proprio come avviene nei
vettori retrovirali). Il problema principale di questa strategia fu quello di ottenere un
elevato grado di tossicità e l’attivazione della risposta immunitaria poiché, nonostante
l’eliminazione dei geni E1, il virus si esprime a bassi livelli nelle cellule infettate.
Seconda generazione. I vettori di seconda generazione furono ottenuti eliminando anche
gli altri livelli, dando come vantaggio un aumento della grandezza del transgene, una
ridotta attivazione della risposta immunitaria e un’aumentata persistenza di espressione
del vettore.
Helper dipendenti (o Gutless). Sono vettori adenovirali di nuova generazione caratterizzati
da un’alta capacità. Questi vettori sfruttano il fatto che tutte le proteine adenovirali
possono essere complementate in trans, quindi quasi tutta la sequenza codificante può
essere sostituita dal transgene che può avere dimensioni comprese tra 100b e i 36 Kb. Le
uniche sequenze essenziali in cis sono le ITRs e la sequenza Ψ. I vettori gutless vengono
ottenuti da un vettore virale (plasmide) che contiene solo sequenze ITRs e Ψ e il transgene
di interesse (finacheggiato dalle sequenze ITRs e preceduto dalla sequenza di packaging).
Si utilizzano delle cellule di packaging (293) che esprimono solamente il gene E1, che poi
vengono trasfettateutilizzando un metodo di trasfezione non virale (ad esempio lipo-
fezione) e contemporaneamente tali cellule vengono infettate con un virus helper che
contiene e fornisce gli elementi strutturali nel suo genoma ma privato delle sequenze E1
ed E3 (tecnica dello split genomico – perché le cellule di packaging esprimono il gene E1
mentre tutti gli altri geni sono veicolati dal virus helper). L’unico costrutto che contiene la
sequenza di packaging è quello fornito mediante metodo di trasfezione non virale e che
contiene il gene ricombinante.
Vantaggi e svantaggi dei vettori adenovirali. Il vantaggio principale è quello di essere
sicuri, in quanto non integrano il genoma; sono facili da ottenere in alti titoli e altrettanto
facili da manipolare; infettano anche cellule quiescenti e il genoma che può essere
introdotto all’interno del capside di un adenovirus è abbastanza grande (fino a 36kb). Lo
svantaggio è quello che non integrando il genoma, l’espressione del gene che si ottiene è
transiente; inoltre si può avere un’attivazione significativa della risposta immunitaria.
3. Virus adeno-associati (AAV). Sono virus ad integrazione sito-specifica e per tale ragione è
possibile ottenere un’espressione stabile nel tempo. Sono difficili da produrre ad alto titolo.
Sono virus privi di envelope e il loro capside è di forma icosaedrica. All’interno del capside è
contenuto il genoma a DNA single strand con polarità positiva o negativa. Tale genoma è
molto semplice ed è fiancheggiato da sequenze ITRs, che contengono la sequenza di
packaging; è composto unicamente da due tipi di geni:
93
a. Geni cap (che codificano per le proteine del capside);
b. Gene rep (che codificano per le proteine necessarie per la replicazione e l’integrazione).
Ciclo virale di replicazione e di infezione degli adeno-asociati. Anche in questo caso, l’in-
ternalizzazione di tali molecole prevede il riconoscimento proteina-recettore, la forma-zione
dell’endosoma, l’escape del virus dall’endosoma e l’inserimento di questo all’interno del
nucleo. Il virus, essendo a (ss)DNA viene duplicato e trascritto per l’ottenimento delle proteine
virali. Vengono definiti adeno-associati perché per replicare necessita della presenza in
contemporanea di un adenovirus (AV) o di un Herpes simplex virus (HSV). In assenza di uno di
questi due virus, l’adeno-associato non duplica il duo DNA, ma lo integra in modo stabile
all’interno della cellula ospite in una regione ben precisa del cromosoma 19 (19q 13,3q-te).
Una successiva superinfezione con AV o HSV attiva la replicazione del virus integrato e dà
origine a nuovi virioni potenzialmente infettivi. Formazione di vettori adeno-associati. Prevede, come per la formazione degli altri vettori
virali visti in precedenza, la delezione dei geni strutturali che codificano per le proteine del
capside (cap e rep) e sostituiti con il gene di interesse. Viene lasciato invariato tutto il resto,
in quanto le sequenze ITRs contengono tutte le informazioni necessarie per l’integrazione e
per il packaging. I geni eliminati vengono poi complementati in trans dalle cellule di packaging.
La linea cellulare 293 viene trasfettata con un plasmide (sistema non virale) contenente i geni
cap e rep e successivamente infettata con il vettore contenente il gene di interesse fiancheg-
giato dalle sequenze ITRs e dalle sequenze di packaging. Per ottenere dei vettori adeno-
associati è necessario che le cellule di packaging contenga-no anche i geni dell’adenovirus, in
particolare è sufficiente l’espressione del gene E1. Per tale ragione le cellule di packaging
vengono trasfettate con un plasmide che contiene i geni cap e rep e successivamente con un
adenovirus helper difettivo per E1. Recentemente è stato sviluppato un nuovo sistema di
produzione in cui il virus helper è sostituito con un plasmide mini-Ad (contiene parte del
genoma di adenovirus).
Figura 23. Trasfezione di adeno-associati.
94
Vantaggi e svantaggi. Il vantaggio principale nell’utilizzo di adeno-associati è dato dalla
mancata patogenicità verso l’uomo. Vengono ottenuti facilmente con alti titoli. Manifestano
un’alta efficienza di trasferimento genico e un ampio trofismo. Sono in grado di infettare sia
cellule in divisione che quiescenti. Possono integrare il transgene all’interno della cellula
bersaglio e di conseguenza è possibile ottenere delle trasfezioni stabili. Gli svantaggi sono
principalmente due: 1) Dovuto alle dimensioni ridotte del transgene da inserire (4.7 Kb). Re-
centemente la capacità di questi vettori è stata aumentata sfruttando concatamerizzazione
del genoma dei AAV dopo il trasferimento. Si usano due vettori, ciascuno codificante metà
della proteina di interesse. 2) Dovuto al vettore ricombinante non ha integrazione sito
specifica e, una volta tolti i geni rep e cap, talvolta resta in forma episomiale.
4. Herpes simplex virus. Sono cellule ad infezione selettiva dei neuroni ma, al contempo, sono
noti per i loro importanti effetti citotossici. Sono virus molto grandi con un genoma costituito
da circa 80 geni (di cui almeno metà di questi non sono essenziali, quindi il vantaggio
principale è dato dalla capacità di trasportate un genoma ricombinante decisamente grande).
Il genoma è costituito da (ds)DNA racchiuso in capside icosaedrico ricoperto da envelope di
natura lipidica.
Figura 24. Struttura di un HSV.
95
Figura 25. Meccanismo di infezione.
Meccanismo di infezione. Anche tale infezione da HSV, sfrutta il riconoscimento da parte di
proteine di membrana della cellula bersaglio e la superficie del virale. Infatti, il virus inserisca
su tale superficie delle proteine che mimano il più possibile il legame con la proteina di
membrana e sfruttando tale legame per introdursi all’interno della cellula. Il meccanismo di
infezione dell’HSV è molto particolare. Infatti, nel momento in cui infetta la cellula,
solitamente di tipo epiteliale (infezione primaria), si ha un ciclo di replicazione classico che
porta alla formazione di nuovi virioni infettivi che vengono rilasciati dalla cellula epiteliale
attraverso lisi indotta (ciclo litico). I nuovi virioni prodotti risalgono lungo le terminazioni dei
neuroni sensoriali fino ai gangli dorsali. Qui stabilisce un’infezione latente (che non necessita
di espressione genica) integrandosi nel genoma della cellula bersaglio e rimangono quiescenti
finché Il ciclo litico non viene riattivato periodicamente in condizioni favorevoli (stress). Una
volta riattivato il ciclo litico, le nuove particelle virali vengono rilasciate dalla cellula che li
contiene (senza lisi indotta) e trasportate con trasporto anterogrado fino alle cellule epiteliali
dove, una volta infettate (infezione secondaria) ne inducono il danneggiamento del tessuto
per lisi delle cellule costituenti. La sua latenza a livello dei gangli dorsali fa sì che il virus sia
difficilmente debellabile.
Vettori HSV-1. Grazie alla loro naturale capacità di stabilire infezioni latenti nei neuroni,
vengono utilizzati per il trasporto di geni nel CNS. L’espressione a lungo termine del transgene
viene ottenuta utilizzando dei promotori neurone-specifici, attivati durante il periodo di la-
tenza. Possono trasportare geni di grosse dimensioni (152Kb).
Esistono due tipi di vettori HSV-1:
a. Disabled HSV vectors – virus ricombinanti ottenuti eliminando uno o più geni precoci
immediati (strutturali). Vengono prodotti in cellule di packaging che complementano i
geni mancanti. Sono vettori di ultima generazione prodotti eliminando il gene che codifica
96
per la glicoproteina-H disuperficie di HSV-1 e cresciuti in una linea cellulare che com-
plementa questa proteina. I virus ottenuti sono infettivi, ma possono effettuare un solo
ciclo di infezione.
b. Amplicon HSV vectors – si basano sull’utilizzo di un amplicone, un plasmide contenente:
• un’origine di replicazione batterica (generalmente da Escherichia coli – perché ne
consente una maggiore amplificazione);
• un’origine di replicazione di HSV-1 (OriS) che ne permette il riconoscimento in fase
successiva di trascrizione;
• la sequenza di packaging di HSV-1;
• il transgene.
Tale plasmide viene inserito (mediante un sistema non virale) in una linea cellulare di
packaging infettata da un virus helper difettivo contenente in trans i geni regolatori e
strutturali (per capside ed envelope) mancanti. Tale meccanismo consiste nel separare
quanto più possibile il genoma virale dalle sequenze di packaging con splitting delle se-
quenze virali che codificano per una successiva replicazione.
Produzione di vettori virali. Nel momento in cui si vanno a generare vettori virali bisogna
considerare che è necessario aumentare l’efficienza di produzione, in quanto tali vettori virali prodotti
devono essere particolarmente efficienti da riuscire ad infettare delle cellule bersaglio, o per essere
utilizzati in vivo per generare degli animali transgenici. Tre fattori determinano l’efficienza di
produzione di un vettore virale:
1. la natura del vettore – a seconda della natura del vettore utilizzato è possibile ottenere un
titolo più o meno elevato.
2. la linea cellulare di packaging – attraverso modificazioni del ciclo cellulare di tali cellule al fine
di favorire le fasi di replicazione virale e inibizione dell’apoptosi (es. alcuni virus, quali SV40 e
Epstein-Barr hanno evoluto sistemi anti-apoptotici). Questo garantisce una maggiore prdut-
tività da parte di queste cellule.
3. le condizioni di coltura – è possibile ottenere una maggiore efficienza andando a modificare
le condizioni di coltura cellulare, ad esempio temperatura di crescita, concentrazione del
siero, tempo di infezione, confluenza cellulare al tempo dell’infezione (Es. retrovirus ha
emivita aumentata di 4 volte e titolo virale aumentato di 5-10 volte portando la temperatura
di crescita da 37°C a 32°C).
Nella produzione dei vettori virali è molto importante considerare il grado di purezza richiesta (resa
di produzione). Di solito per facilitare la purificazione dei vettori virali dalla coltura cellulare di
packaging si tende a ridurre la concentrazione del siero, o addirittura coltivare le cellule in assenza di
siero nel momento finale in cui queste iniziano a produrre i virus e liberare i nuovi virioni durante il
ciclo litico. Il siero infatti interferisce con la purificazione, o meglio, è stato dimostrato che in assenza
di siero è più facile purificare i virioni. Le tecniche di purificazione dipendono dalla scala di produzione,
in particolar modo, nel momento in cui vengono prodotti dei vettori virali tali tecniche di purificazione
che si basano su:
1. centrifugazione su gradiente di CsCl (usato nei laboratori);
2. cromatografia d’affinità (produzione su larga scala).
97
Le tecniche di purificazione, che esse siano di laboratorio o su larga scala, prevedono una fase iniziale
di amplificazione del vettore. Successivamente il vettore subisce un processo di espansione da parte
delle cellule di packaging dalle quali viene fatto produrre per ottenerne un certo titolo. A seguito
vengono recuperati i virioni prodotti dalle colture di packaging e, successivamente, utilizzati per
infettare altre cellule di packaging e consentire un’ulteriore espansione. Una volta che si è prodotto
un notevole numero di virioni questi devono andare incontro ad un processo di purificazione. Succes-
sivamente se ne determina il titolo finale.
≡ ESEMPIO 1. Produzione di vettori adeno-virali.
1) Inserzione del transgene nel vettore.
Si parte dal vettore adenovirale (Plasmide) che contiene:
a. vettore commerciale (in questo caso adenovirus) deleto in E1 e E3;
b. origine di replicazione batterica (amplificazione);
c. marker specifico che codifica per la resistenza contro l’ampicillina;
d. Multiple Cloning Site che permette l’inserimento del gene di interesse posto sotto il
controllo di un promotore forte (es. CMV);
e. sequenze necessarie per il packaging (ITRs, sequenza ψ, late gene).
Il plasmide modificato con le tecniche del DNA ricombinante all’interno di una provetta
per l’inserimento del gene di interesse.
Il clonaggio del DNA di interesse avviene mediante taglio enzimatico del vettore,
dell’inserto (estremità coesive) e successiva ligazione (ligasi). In seguito il plasmide
modificato verrà amplificato mediante l’utilizzo di colture batteriche, e selezionati grazie
al gene che codifica per la resistenza all’ampicillina (solo i batteri con il gene che codifica
per tale resistenza potranno crescere).
2) Trasfezione della linea 293A con il vettore. Il vettore commerciale viene venduto assieme
alla sua linea cellulare di packaging. La linea cellulare 293A (cellule embrionali renali
umane), che contiene una copia dei geni E1 integrata stabilmente (complementazione
in trans) che erano stati deleti in partenza.
Il plasmide ottenuto nel punto (1) viene trasfettato nelle cellule di packaging con un
metodo di trasfezione non virale (perché questo è un plasmide). A questo punto la coltura
di packaging viene seguita nel tempo e osservare la produzione.
3) Preparazione del lisato virale. Se con il passare del tempo queste iniziano a produrre i
vettori virali di interesse, vengono a formarsi delle evidenti placche di lisi. Se circa il 60-
70% delle cellule sono andate incontro a lisi si procede andando a recuperare il terreno
e le cellule presenti nella piastra di coltura, separando i virioni dai detriti cellulari e dal
citoplasma che si è liberato. Tale separazione che prevede di avere una sospensione
contenete i virioni isolati, generalmente, viene ottenuta per centrifugazione. Succes-
sivamente dei virioni prodotti è necessario calcolare il titolo per millilitro. Congelare tale
stock di virioni titolati a -80°C, questo consente all’operatore di avere a disposizione una
scorta consistente dei virioni infettivi contenenti il gene di interesse. il prossimo step
sarà quello di amplificare questi virioni poiché il numero che si ottiene dalla prima
trasfezione è molto basso; l’amplificazione consiste nel mettere a contatto i virioni
ottenuti con delle cellule di packaging (non è necessario effettuare una trasfezione ma
98
si sfrutta la capacità infettiva dei virioni). Dopo l’infezione verranno prodotti molti più
virioni rispetto a quelli utilizzati in partenza (prima dell’infezione).
Titolazione dello Stock. Per poter utilizzare i vettori virali prodotti è necessario determinare il
titolo della sospensione ottenuta dalle cellule di packaging. Il titolo viene solitamente indicato come
PFU (unità formanti placca). Per la determinazione del titolo si possono utilizzare tre diversi saggi:
1. Test di placca (plaque assay). È quello più semplice, il primo ad essere stato utilizzato e dal
quale derivò la definizione di PFU. Viene fatto su cellule di packaging, ma ugualmente utiliz-
zabile per virus che hanno ciclo litico. Viene eseguito secondo diversi step:
a. Effettuare diluizioni seriali della sospensione contenente i virioni;
b. Preparare delle piastre contenenti cellule di packaging per determinare il titolo della
sospensione di virioni;
c. Utilizzare le varie diluizioni di sospensione di virus per infettare le cellule in terreno liquido
– le diluizioni vengono messe a contatto ciascuna con una piastra diversa di coltre di
packaging;
d. Coprire con agar (agente gelificante) per evitare la diffusione dei virioni che si liberano a
seguito del ciclo litico, e incubare – i virioni liberati potrebbero andare ad infettare la
cellula vicina e amplificarne la lisi (quello che si vuole fare è contare tutte le unità che
formano placca).
e. Contare il numero di placche (PFU=unità formanti placca) osservabili in quei pozzetti dove
la conta è possibile (da 10-5 in poi) e successivamente si calcola il valore medio.
Questo test è cruciale anche nel giudicare l’efficacia del sistema vettore/linea di packaging è
la valutazione della frequenza con la quale si verifica la comparsa di revertanti replicazione
competenti (RCR) nella popolazione di virus prodotto. I RCR sono quegli agenti virali che
hanno riacquistato la capacità di replicare in modo autonomo, per re-inserimento a livello del
loro genoma dei geni strutturali. Se questo accade, non solo si ottengono agenti virali capaci
di infetta e trasferire il materiale genetico al loro interno ma, sono in grado di formare nuovi
virioni che divengono potenzialmente pericolosi per l’operatore e per l’ambiente. A tal
proposito viene effettuato un test di placca su cellule non di packaging in quanto queste sono
cellule che non esprimono le proteine strutturali del virus e quindi non sono in grado di
complementare in trans i geni che mancano dal vettore virale. Il test di placca eseguito a tale
scopo deve avere come risultato la comparsa di nessuna placca di lisi (test negativo); qualora
si formassero delle placche di lisi si va ad eliminare tutto lo stock prodotto dai virioni crio-
conservati a quelli presenti in provetta per la titolazione. Per eliminare qualsiasi residuo o
forma di vita potenzialmente infettivo si utilizza il sodio ipoclorito (candeggina); è necessario
Esempio.
10-4 diluizione: confluenti; indeterminabile. 10-5 diluizione: 59 10-6 diluizione: 4.5
Quindi il titolo di questo stock virale è 5,2 x 106 PFU/ml (i.e. media di 59 x 105 e 4.5 x 106).
99
assicurarsi che nessun agente ricombinante infettivo capace di replicare in maniera autonoma
fuoriesca dalla stanza.
2. Test ELISA. Si utilizza una coppia di anticorpo contro una proteina del capside (es p24
codificata dal gene cap del lentivirus). Si utilizzano, al solito, delle piastre multi-pozzetto che
sono state ricoperto con uno specifico anticorpo selettivo per la proteina di interesse. Si
preleva un’aliquota della sospensione di virioni, si lisa in modo tale che vengano rilasciate le
particelle virali, e si incuba con l’anticorpo per far avvenire il legame (reazione di ricono-
scimento antigene-anticorpo). Successivamente si lava per eliminare l’eccesso di proteina non
legata e sulla piastra resteranno intrappolate solo le proteine che sono state correttamente
riconosciute dall’anticorpo. A questo punto si introduce un secondo anticorpo legato ad una
proteina fluorescente che riconosce la stessa proteina virale ma in un’altra regione. Dunque,
la particella virale riconosciuta dai due anticorpi forma un pozzetto che rimane bloccato sul
fondo del pozzetto. Dato che il secondo anticorpo è fluorescente è possibile leggere la
quantità di fluorescenza presente all’interno del pozzetto che è direttamente proporzionale
alla quantità di proteina virale presente. Da questa analisi si può risalire alla quantità di virioni
presenti nella sospensione.
3. qPCR (PCR quantitativa). Analisi PCR quantitativa effettuata utilizzando una coppia di primers
specifici per una sequenza presente nel genoma del virus (modulo di metodologie biochi-
miche).
6.7 Lavorare con i virus
Il problema di lavorare con i virus è legato alla loro patogenicità nei confronti dell’uomo. Dunque è
necessario che questi vengano manipolati in condizioni opportune tali da garantire la sicurezza
dell’operatore e dell’ambiente. Di solito il livello di sicurezza che si deve utilizzare per l’utilizzo dei
virus è maggiore rispetto a quello che si utilizza ad esempio per una coltura cellulare. Le linee guida
federali che riguardano l’utilizzo di agenti virali o con tutto che e viene a contatto, come pipette usate,
i puntali delle pipette e altre colture di tessuti devono essere candeggiati per garantire la sicurezza
da rischio biologico, e successivamente sterilizzati in autoclave (materiale biohazard). Tutte le
manipolazioni devono essere eseguite all'interno di una cabina di biosicurezza certificata. L’operatore
deve indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali o occhiali protettivi quando si maneggiano
scorte virali e supporti contenenti virus; e, in funzione del rischio legato al tipo di manipolazione è
importante utilizzare dei dispositivi atti a garantire la sicurezza collettiva. I virus vengono classificati
con livelli di sicurezza crescenti che vanno da 2 a 4. Se si lavora con micro-organismi di classe 2, è
necessario utilizzare tutte le misure richieste per la classe 1 con delle aggiunte. A seconda del rischio
crescente dovranno essere adoperate misure di sicurezza ben precise e correlate ad esso. Per la
classe 2 si utilizzano delle cappe con filtro HEPA; per i microrganismi di classe 3 e 4, oltre all’utilizzo
di cappe biohazard bisogna aumentare anche il livello di protezione individuale (per i virus di classe 3
è necessario evitare l’esposizione agli aerosol degli ambienti e per i virus di classe 4 l’operatore deve
essere completamente isolato in ogni sua parte del corpo all’esposizione con tali agenti). L’ambiente
deve costantemente garantire una pressione negativa per far sì che il materiale biologico che si sta
manipolando non fuoriesca dalla stanza (aumentare il contenimento).
100
6.8 Tipo di trasfezione: transiente o stabile?
Nel momento in cui si disegna un esperimento di trasfezione la domanda che bisogna porsi, sia se si
utilizza un vettore virale o non virale, riguarda il grado di espressione del transgene di interesse
all’interno della cellula bersaglio:
“si vuole effettuare una trasfezione transiente (di breve durata) o stabile?”.
Trasfezione transiente. È solitamente immediata. Non prevede l’integrazione del ma-teriale
genetico all’interno del genoma della cellula ospite. La trasfezione transiente viene scelta per
esperimenti a breve termine (analisi ICC, studio del promotore, ecc.) in cui le cellule sono nor-
malmente raccolte 48-72 h dopo la trasfezione. Di solito è un esperimento in cui si lavora in condizioni
di sovra-espressione genica (o di silenziamento) ad altissimi livelli (più di una copia per cellula).
Un’altra caratteristica di questo tipo di trasfezione è che la popolazione cellulare è fortemente dis-
omogenea, ovvero poche cellule con più copie dello stesso plasmide, in quanto il numero di copie del
plasmide inserito all’interno di ciascuna cellula non è facilmente prevedibile; si ha una conseguente
sovra-espressione del plasmide in proteina rispetto magari alla cellula vicina che ha ricevuto un
plasmide soltanto.
Trasfezione stabile. Di solito la trasfezione stabile viene scelta per esperimenti a lungo termine
in cui si ha possibilità di isolare e propagare singoli cloni contenenti il DNA trasfettato. Prevede
l’integrazione (molto spesso casuale) del materiale genetico all’interno del genoma della cellula
ospite con conseguente modificazione permanente di tale cellula. Tale procedura prevede un
processo lungo e laborioso che prevede la selezione di tutte le cellule (un po' come succedeva per i
batteri) che hanno preso il gene di interesse e quante lo hanno perfettamente integrato. Per rendere
possibile questa selezione, molto spesso, il gene di interesse viene abbinato ad un marcatore selettivo
come ad esempio un gene che codifica per una resistenza ad un antibiotico che funziona nelle cellule
eucariotiche. Una volta avvenuta la selezione di tipo clonale, si ottiene una popolazione cellulare
omogenea (integrazione in singola copia) composta da molte cellule e poco plasmide (tutte le cellule
esprimeranno lo stesso quantitativo della proteina di interesse); perché si presuppone che la linea
cellulare selezionata si sia originata da un’unica cellula che ha subito l’integrazione del DNA esogeno
all’interno del suo genoma. Per poter effettuare una trasfezione stabile è necessario partire da una
trasfezione transiente; si parte dalla modificazione di una linea cellulare attraverso l’inserimento di
DNA esogeno all’interno delle cellule bersaglio e si aspetta che il DNA venga espresso. Durante le
prime 48 ore dalla trasfezione (sia stabile che transiente), fino al 50% delle cellule contengono DNA
esogeno (normalmente in forma episomale). In seguito, a causa della degradazione e della diluizione,
le cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono. Se si vuole fare una
trasfezione stabile è necessario selezionare quali cellule (cloni) hanno integrato il transgene; per far
questo si accoppia l’espressione del transgene a quella di un gene che codifica per una resistenza
generalmente ad un antibiotico (marker selettivo). Una volta aggiunto l’antibiotico al terreno di coltu-
ra, solo le cellule che sono in grado di mantenere l’espressione dei geni esogeni saranno in grado di
produrre la resistenza all’antibiotico; quindi solo quelle cellule sopravviveranno. Mantenendo la
pressione selettiva per almeno 21 giorni si riesce pian piano ad eliminare le cellule che non hanno
integrato il gene di interesse dalla coltura cellulare, mantenendo solo quelle cellule che hanno
101
integrato in modo corretto e che duplicando daranno origine a delle vere e proprie colonie che
prendono il nome di cloni. Il marker può essere presente sullo stesso plasmide del gene di nostro
interesse oppure co-trasfettato con un secondo plasmide. Come prima cosa è necessario scegliere
quale marcatore selettivo utilizzare per selezionare le cellule che hanno integrato stabilmente il
nostro gene di interesse.
Geni per markers selettivi. Uno dei markers selettivi più utilizzati è aminoglicoside fosfotransferasi
(Neo), un enzima che è in grado di conferire resistenza agli antibiotici aminoglicosidici (kanamicina,
neomicina, geneticina ecc.). Questi antibiotici tendono a non essere tossici a piccole dosi, per selezio-
nare le cellule sono necessarie dosi elevate che però possono danneggiare anche le cellule trasfet-
tate; dunque è necessario determinare la dose appropriata (attraverso una curva dose-risposta). Un
altro enzima che si può utilizzare è l’igromicina B fosfotransferasi che conferisce resistenza all’igro-
micina (Hyg)
102
6.9 Sistemi inducibili
La trasfezione stabile, rispetto a quella transiente, ha il grosso vantaggio di creare una popolazione
più possibile omogenea e di esprimere il gene di interesse ad un livello basso molto simile a quello
fisiologico; questo consente di generare un modello di studio in grado di avvicinarsi maggiormente
alla realtà. Spesso questo sistema viene utilizzato per creare modelli-malattia, attraverso i quali si può
studiare, ad esempio, l’espressione di determinate proteine coinvolte in alcune patologie. Di solito
vengono prodotte due diverse linee; una linea che esprime la proteina di studio non mutata e,
un’altra linea in parallelo che esprime la proteina mutata. Molto spesso, si può incorrere in un proble-
ma legato alla proteina o al gene mutato, che risiede proprio nella modifica presa come oggetto di
studio che potrebbe generare tossicità per la cellula. Tale problema non si riscontra facilmente
quando si effettua una trasfezione transiente poiché questa richiede tempistiche ridotte; però
qualora si decida di effettuare una trasfezione stabile allora il problema della tossicità potrebbe
essere piuttosto evidente (per accumulo) e di conseguenza potrebbe causare la perdita dell’intera
PROTOCOLLO PER UNA TRASFEZIONE STABILE.
1. Inizialmente le cellule devono essere trasfettate (attraverso trasfezione transiente) con il plasmide
contenente il nostro gene di interesse e il gene che codifica per il marker selettivo (con uno dei me-
todi precedentemente descritti).
2. Dopo due giorni aggiungere alte dosi dell’antibiotico scelto per la selezione per consentire la morta-
lità di tutte quelle cellule che non hanno integrato e che non mantengono il plasmide al loro interno.
Questa operazione viene fatta nelle prime ore perché quasi la metà della popolazione cellulare sarà
in grado di produrre un certo grado di resistenza all’antibiotico addizionato perché il plasmide
rimane in forma episomiale.
3. Queste condizioni vengono mantenute per circa 14 giorni, cambiare il medium e aspettare che
muoiano le cellule non trasfettate (non resistenti) o che non hanno integrato stabilmente il
plasmide (che altrimenti viene perso dopo un certo numero di divisioni). Per tale ragione all’interno
di una dish o di un pozzetto si osserva che le cellule non raggiungeranno mai la confluenza. In questi
14 è sconsigliato di effettuare una subcultura (che ovviamente prevede un distaccamento delle
cellule dal terreno e un successivo re-impianto) perché l’obbiettivo è quello di andare a selezionare
tutte quelle cellule che si sono generate da un’unica cellula e continuano a crescere le une accanto
alle altre formando delle vere e proprie isole (colonie) resistenti che rappresentano una maggiore
omogeneità dell’espressione del transgene esogeno trasfettato.
4. Quando si iniziano a vedere “isole” di cellule resistenti, trasferire i singoli cloni (colonie)
ciascuna in un contenitore differente; di solito di passa da una dish di 10cm di diametro
adoperata all’inizio, ad una multi-well da 96 pozzetti. Nel momento in cui si raggiunge la
confluenza della multi-well da 96 pozzetti, allora le cellule vengono trasferite in superfici
più grandi (multi-well da 48 pozzetti, poi 24, 12,6) fino ad ottenere una dish per ciascuna
colonia. Tale operazione prende il nome di “picking”.
5. A questo punto si ottiene una nuova linea cellulare geneticamente modificata che andrà
crio-conservata.
103
linea cellulare. Questo problema ha portato allo sviluppo di una strategia che consente di generare
una linea stabile che esprime una proteina tossica in modo inducibile. Questo significa che il gene di
interesse viene espresso solamente in presenza di un particolare stimolo. Tale strategia è vantaggiosa
perché permette di regolare l’espressione di un gene e consente di ottenere una linea stabile pur
contenendo un gene tossico che non viene sempre espresso. Solo nel momento in cui si effettua
l’esperimento si andrà ad aggiungere un particolare reagente al terreno di crescita che attiva l’espres-
sione del transgene di interesse in modo da poter seguire l’effetto dell’espressione del gene tossico
all’interno della linea cellulare. Ovviamente una parte delle cellule dovrà mantenere il gene tossico
silenziato in modo che la linea stabile si possa mantenere nel tempo. Uno dei sistemi più utilizzati per
effettuare una espressione inducibile di un gene di interesse all’interno di cellule eucariotiche è il
sistema dell’operone lattosio (vedi pagina 56). Un altro sistema analogo è quello delle tetracicline e
dei suoi analoghi. Quello della tetraciclina è un sistema di repressione che, in assenza di tetraciclina
(Tc) o doxyciclina (Dox), costituisce un blocco del promotore che è regolato dalla tetraciclina stessa.
Infatti in presenza di tale molecola, il repressore si stacca dall’operatore e si ottiene la trascrizione
dei geni. Questo sistema è stato modificato in due modi differenti per poter regolare l’espressione
del gene di interesse:
1. Sistema Tet-On, l’aggiunta di tetraciclina o Doxyciclina “accende” il gene di interesse;
2. Sistema Tet-Off: l’aggiunta di tetraciclina o Doxyciclina mantiene “spento” il gene di interesse.
Figura 26. Sistema Tet-ON e TET-Off presente in E.coli..
Questo sistema è il più utilizzato per ottenere una trascrizione di tipo inducibile. È un sistema che
sfrutta le proteine di E.coli coinvolte nella resistenza alle tetracicline. Il repressore Tet R (tet repressor
protein) regola negativamente l’espressione dei geni coinvolti nella resistenza a valle (trasposone
Tn10). In assenza di tetraciclina, Tet R si lega alla sequenza Tet O (tet operator, sequenza dell’opera-
tore) e blocca la trascrizione. L’aggiunta di tetraciclina o dell’analogo fa sì che abbia un cambio con-
formazionale nel repressore che si stacca dall’operatore e da l’input alla trascrizione. Per gli esperi-
menti in cellule di mammifero Tet R e stata modificata per ottenere due diversi tipi di proteine:
1. tTA (Tc-controlled trans activator), proteina ibrida (37 kDa) ottenuta dalla fusione dei primi
207 aa di Tet R con 127 aa del C-terminale del dominio attivante del VP16 di herpes simplex
104
virus. Questa proteina ottenuta non è più un repressore ma bensì diventa attivatore
trascrizionale in assenza di Doxyciclina.
2. rtTA (reverse tTA), proteina ottenuta modificando 4 aa di Tet R e ha comportamento opposto
a tTA in risposta a Doxyciclina. viene modificata in modo da diventare attivatore trascrizionale
in presenza di Doxyciclina.
Per repressore trascrizionale si intende che nel momento in cui la proteina si lega al promotore crea
un ingombro sterico e ne blocca la trascrizione. Un attivatore trascrizionale, invece, nel momento in
cui si lega al promotore ne promuove la trascrizione.
Nel sistema TET-Off, la proteina coinvolta è la tTA che funziona in assenza di doxyciclina. infatti, in
assenza del substrato, tale proteina può legarsi al substrato e promuovere la trascrizione dei geni a
valle del promotore. In presenza del substrato (doxyciclina o tetraciclina), diversamente, l’attivatore
trascrizionale si stacca dal promotore e l’attivazione trascrizionale viene “spenta”.
Per quanto riguarda il sistema TET-On la proteina coinvolta è la rtTA e, in questo caso, necessita della
presenza di doxyciclina per poter essere affine per il legame con il promotore e promuove la trascri-
zione dei geni a valle. In assenza di Doxyciclina, tale proteina, ha una struttura non affine con il
promotore quindi la trascrizione è mantenuta “spenta”.
105
Figura 27. Sistema TET-off e TET-on nei mammiferi.
Il gene che si vuole regolare deve essere inserito a valle di una sequenza TRE (Tc responsive
elements), sequenze di 42 bp che contengono sequenza Tet O. L’espressione basale del promotore
e molto bassa in assenza di Tc. La differenza tra i due sistemi è data dal tempo e dal consumo di
doxyciclina. Se si utilizza un sistema TET-on bisogna lavorare sempre in presenza di doxyciclina per
manenere il gene “spento”, tranne quando si vuole promuovere la sua espressione. Però a lungo
andare, la doxyciclina potrebbe essere citotossica; ed è appunto un sistema più costoso. Nel sistema
TET-off, basterà aggiungere la doxyclina nel momento in cui si vuole effettuare l’esperimento. Per
questo, tale sistema risulta più economico e più versatile rispetto al TET-on. I due sistemi sono
complementari. Nel sistema Tet-Off è necessario aggiungere Tc o Dox nel medium per mantenere lo
stato inattivo. Le due molecole però hanno emivita breve ed è quindi necessario aggiungerle ogni
circa 48 ore per reprimere l’espressione del gene X. Il sistema Tet-On è responsivo solo alla Dox,
mentre Tet-Off è sensibile a entrambi. Le concentrazioni di Tc o Dox necessarie sono molto basse,
inferiori a dosi citotossiche (sia per colture cellulari che per animali transgenici).
106
Al fine di ottenere una trasfezione stabile utilizzando il sistema TET-on o il sistema TET-off è neces-
sario, in realtà, effettuare due trasfezioni consecutive.
Figura 28. Ottenimento di una trasfezione stabile.
Nella figura 28 in A, rappresenta un sistema TET-off in cui si osserva un plasmide sul quale è possibile
identificare il marcatore per la resistenza all’ampicillina nei batteri (serve per la crescita e
l’amplificazione), un marcatore per la neomicina (per effettuare la selezione delle cellule che sono
state trasfettate in modo stabile negli eucarioti), un gene che codifica per la proteina tTA (attivatore
trascrizionale) posto sotto il controllo di un promotore virale per garantire un’espressione ad alti li-
velli, ed in fine le sequenze di terminazione (poly-A) sempre di origine virale. Il plasmide A una volta
inserito in una coltura cellulare produe la proteina tTA che consentirà il funzionamento del plasmide
rappresentato in B. In quest’ultimo, diversamente da A, si osserva il marcatore di resistenza per
l’ampicillina, un altro marcatore di resistenza (non riportato in figura) diverso dalla neomicina (ad
esempio l’igromicina) che consente di selezionare quali cellule eucariotiche avranno preso il plasmide
in B, non più un promotore del citomegalovirus ma il promotore TRE (pTRE) responsivo alle tetracicli-
ne, ed in fine le sequenze di terminazione (code di poly-A) e un MCS (Multiple Cloning Site) che
permette di clonare la sequenza che codifica per il gene di interesse. Questo processo di trasfezione
stabile prevede l’utilizzo sia del plasmide A che del plasmide B (in cui si inserisce il gene di interesse
sotto il controllo del promotore responsivo alle tetracicline). A questo punto è necesario effettuare
due trasfezioni stabili. La prima trasfezione esprime stabilmente il plasmide A e si selezionano delle
cellule che esprimono in modo stabile e non inducibile la proteina tTA. Successivamente si andrà a
trasfettare in queste cellule il plasmide B che contiene il gene di interesse la cui espressione è regolata
dalle tetracicline. Operativamente la doppia trasfezione (o consecutiva) viene operata scegliendo
prima di tutto il sistema TET-on o TET-off, e successivamente viene selezionato il primo plasmide che
codificherà per la proteina regolatoria.
PRIMA TRASFEZIONE STABILE.
1. Piastrare le cellule e lasciarle crescere fino a circa l’80% di confluenza;
2. Si effettua una trasfezione con vettore pTet On/Off, il plasmide può essere linearizzato
per aumentare l’efficienza di integrazione e per permettere alle cellule di duplicarsi
(per circa 24-48 h) e successivamente aggiungere un agente selezionante (geneticina,
G418, 400-500 ug/ml – concentrazioni elevate). La geneticina è una neomicina la cui
resistenza è codificata dal plasmide trasfettato.
107
3. Si effettua un cambio medium solitamente ogni 48 ore o quando necessario. Dopo
circa 5 gg le cellule che non hanno preso la resistenza iniziano a morire.
4. Mantenere le cellule sotto pressione selettiva in presenza dell’antibiotico per circa 2-
4 settimane, fino a quando inizieranno a morire tutte le cellule e iniziano a comparire
le colonie singole (isole), che hanno mantenuto o integrato l’espressione del plasmide
trasfettato; le colonie devono essere isolate e trasferite ognuna in una well (picking),
dopo di che verranno amplificate.
5. Assicurarsi che il sistema TET-on/TET-off venga espresso correttamente, attraverso
una trasfezione transiente con un plasmide in cui un gene reporter (es. pTRE-luc che
contiene gene per la luciferasi di lucciola regolato dasequenza TRE) posto sotto il
controllo di un promotore responsivo alle tetracicline. Questo metodo consente di
evidenziare quali sono le cellule che esprimono il sistema di regolazione TET.
6. Si selezionano le colonie migliori (maggior differenza indotto-non indotto) e congelare
l’intero stock dei cloni positivi.
I cloni stabili positivi ottenuti nella prima trasfezione vengono trasfettati con il plasmide pTRE-gene X per verificare l’effettiva regolazione genica sul costrutto che si vuole trasfettare stabilmente. SECONDA TRASFEZIONE STABILE.
1. Piastrare le cellule stabili per pTet On/Off e lasciarle crescere fino a circa 80% di
confluenza e in seguito si effettua la trasfezione con il plasmide che codifica per il gene
X sotto il controllo del promotore pTRE responsivo alle tetracicline. In questo plasmide
è presente anche il gene che codifica per la resistenza alla igromicina, oltre a quella
per la geneticina. La presenza di un secondo antibiotico diverso serve a mantenere
stabili le cellule ottenute dalla prima trasfezione e devono essere cresciute sempre in
presenza di neomicina (geneticina) per mantenere l’espressione del primo plasmide.
Il secondo antibiotico (igromicina) serve a selezionare quelle cellule che sono state
trasfettate in modo stabile, quindi a mantenere l’espressione del secondo plasmide.
Se si usasse lo stesso antibiotico non saremmo in grado di discriminare tra le linee
cellulari si dovrebbe fare una seconda selezione perché le cellule non morirebbero.
2. I plasmidi possono essere linearizzati per aumentare efficienza di integrazione.
3. Favorire la replicazione cellulare (24-48 ore) e quindi aggiungere agente selezionante
(igromicina B, 200-400 ug/ml) e Dox nel caso del sistema Tet-Off.
4. Si esegue un cambio del medium ogni 48 ore o quando è necessario. Dopo circa 5
giorni le cellule che non hanno preso la resistenza iniziano a morire.
5. Dopo circa 2-4 settimane iniziano a comparire le colonie singole. Isolare le singole
colonie e trasferire ognuna in una well (amplificazione).
6. Eseguire lo screening per verificare espressione del gene X (in assenza o in presenza
di Doxyciclina a seconda del sistema TET on/off scelto) con la stessa tecnica usata nel
controllo della trasfezione transiente.
7. Si selezionano le colonie migliori (maggior differenza indotto-non indotto).
8. Congelare lo stock dei cloni positivi
108
Un vantaggio delle linee stabili inducibili è che in poco tempo è possibile attivare l’espressione del
gene di interesse a livelli molto alti; in quanto, sarà sufficiente addizionare o sottrarre la doxyciclina
dal sistema TET-on o TET-off per attivare la trascrizione del promotore forte pTRE. È importante
ricordare che per poter effettuare la doppia trasfezione deve essere presente un secondo marker di
selezione che solitamente può essere presente sul costrutto pTRE con il gene X; oppure per una
questione di spazio (nel caso in cui si abbia un gene molto grande da trasfettare) per ridurre le
dimensioni del plasmide viene deletato il marcatore di selezione e si utilizza un terzo plasmide. I due
plasmidi, pTRE con il gene X e plasmide che porta la resistenza all’igromicina, vengono co-trasfettati.
Per essere sicuri che tutte le cellule sono in grado di codificare per la resistenza all’antibiotico abbiano
anche il gene di interesse, quando viene fatto il mix di co-trasfezione è opportuno miscelare i due
plasmidi in rapporto 10-20:1 in modo tale che questo rapporto sia estremamente favorevole per il
pTRE per aumentare probabilità che vengano acquisiti entrambi i vettori dalla cellula e non solo
quello della resistenza.
Un esempio di trasfezione stabile inducibile ottenuta sono le cellule NSC34-TET off. Queste cellule
sono degli ibridomi, motoneuroni murini immortalizzati, trasfettati in maniera stabile e inducibile con
un plasmide che codifica per una proteina responsabile di una malattia moto-neuronale. In questo
caso la proteina è stata fusa con una proteina fluorescente; dunque le cellule che risaltano in verde
sono quelle che esprimono la proteina di interesse. Come si può osservare, l’espressione si ha in
assenza di doxyciclina, mentre in presenza si ottengono dei livelli di espressione molto più bassi. I
numeri che compaiono a fianco di ciascuna linea cellulare indicano i diversi cloni, tra i quali è ne-
cessario selezionare quelli che hanno le caratteristiche migliori.
6.10 Scopo della trasfezione
Finora si è parlato di trasfezione di un DNA di nostro interesse al fine di andare ad esprimere (o
silenziare) una determinata proteina. In questo caso si ha la possibilità di scegliere tra diversi promo-
tori allo scopo di ottenere l’espressione del gene di studio. I promotori più utilizzati sono quelli virali
(solitamente quelli del citomegalovirus o del virus SV40) perché consentono di ottenere un elevato
grado di espressione del transgene (sovraespressione). È possibile scegliere dei promotori che
possono essere regolabili (inducibili) che consentono, di conseguenza, di regolare l’espressione del
transgene. Possono essere scelti dei promotori che si esprimono solo in particolari cellule specifiche
e questo consente di direzionare l’espressione del transgene verso una linea cellulare piuttosto che
un’altra. In tutti questi casi lo scopo della trasfezione è quello di sovra-esprimere un gene di interesse
e quindi poter studiare la proteina di interesse all’interno di un determinato contesto. Spesso, però,
potrebbe capitare che l’oggetto di studio non è la proteina stessa ma semplicemente la regolazione
del suo promotore che definisce le modalità per la sua espressione. Nel caso specifico, quello che
bisogna fare è costruire un plasmide in cui viene inserita la sequenza che codifica per il promotore
del gene di interesse che regola un altro gene detto reporter. Per poter effettuare gli studi di attività
trascrizionale di un promotore si utilizza un vettore denominato promoterless (un vettore privato del
promotore). Un esempio di vettore promoterless è quello in cui è presente l’origine di replicazione
(come in tutti i plasmidi e permette l’amplificazione nei batteri), il marker di resistenza all’ampicillina
la coda di poly-A e il MCS (Multiple Cloning Site, per effettuare un clonaggio con il gene di interesse).
109
Il MCS si trova posizionato dove normalmente di ritrova il promotore che in questo caso è assente;
generalmente viene a trovarsi prima di una sequenza che codifica per una gene reporter (es Luc che
codifica per l’enzima luciferasi).
Figura 29. Vettore Promoterless.
Se non viene apportata alcuna modifica al promoterless e successivamente lo si trasfetta in cellule
bersaglio non si ottiene alcuna espressione dell’enzima luciferasi proprio perché il promotore è
assente. Se invece, attraverso processi digestivi, si inserisce la sequenza che corrisponde al promo-
tore che si vuole studiare all’interno di questo plasmide, possibile regolare l’espressione del gene che
codifica per la l’enzima luciferasi (in questo caso) attraverso il promotore di interesse. L’espressione
di tale gene dipende da quanto è forte il promotore utilizzato. Questi sistemi, molto spesso, vengono
utilizzati per fare degli studi di attività trascrizionale in cui si vuole osservare quanto un determinato
promotore è in grado di promuovere la trascrizione di un gene. Di solito, questi studi, permettono di
capire quali regioni presenti all’interno del promotore sono essenziali per ottenere una buona
trascrizione e quindi una buona espressione del gene reporter. Generalmente quello che si fa è creare
un costrutto con il promotore intero e successivamente si apportano delezioni seriali (o inserzioni in
alcune regioni) per poter paragonare l’effetto di tale modifica rispetto al promotore intero.
Gene Reporter. È un gene che codifica per una proteina con una caratteristica unica e che non
sia presente nelle cellule in cui viene effettuata l’analisi e che sia facilmente misurabile. L’attività
proteica del Reporter non deve interferire con quelle fisiologiche della cellula, ovvero le vie di
segnalazione e il metabolismo cellulare devono rimanere integri. Il saggio sull’attività del reporter
deve essere specifico, riproducibile e immediato. Di solito un gene reporter permette l’immediata
110
identificazione delle cellule positivamente trasfettate (che lo esprimono) e vengono molto utilizzati
per studiare la funzionalità di un promotore (reporter posto sotto il controllo di quel promotore);
oppure molto spesso vengono utilizzati per studiare funzionalità e la localizzazione di un gene di
interesse (es. nella linea cellulare NSC34-TET off, la proteina fluorescente è un buon reporter –
attraverso un microscopio a fluorescenza è possibile osservare la localizzazione della proteina di
interesse all’interno della cellula). Uno de primi geni reporter ad essere stato utilizzato è il
Cloramfenicolo acetil-transferasi; un enzima batterico in grado di conferire resistenza all’antibiotico
cloramfenicolo (inattivazione attraverso acetilazione). Il suo utilizzo come gene reporter al fatto che
veniva abbinato ad un saggio (autoradiografia) in cui le cellule venivano trattate con un antibiotico
marcato con C14; l’antibiotico veniva acetilato solo nelle cellule trasfettate e dove il promotore che
controlla l’enzima attivo e, successivamente, prodotta una miscela proteica di queste cellule e
sottoposta ad autoradiografia era possibile identificare facilmente quali erano i cloni che erano in
grado di effettuare l’acetilazione (nei cloni incapaci di acetilare l’antibiotico si riscontrava assenza di
tale enzima che non era stato integrato). Oggi questo sistema non è più adoperato poiché utilizza
fonti di radiazioni pericolose per l’operatore. Uno degli enzimi maggiormente utilizzati è la luciferasi.
Questo enzima è in grado di convertire attivamente un substrato noto come luciferina nella sua forma
ossidata (ossiluciferina) liberando luce. Attraverso un luminometro è possibile quantificare il conte-
nuto luminoso prodotto da questo enzima all’interno delle cellule; la sua attività è direttamente
proporzionale alla quantità di luce emessa.
Figura 30. Sistema reporter della luciferasi.
Il promoterless codifica per l’enzima luciferasi. Il sistema descritto non presenta il promotore. La
presenza dell’enhancer fa in modo che vengano aumentati i livelli di espressione dell’enzima. Quando
si effettua il clonaggio del gene di interesse e si trasfettano le cellule con questo plasmide si può
andare a dosare la quantità di luciferasi presente all’interno delle cellule. Tale operazione può essere
eseguita effettuando una trasfezione e aspettano che le cellule esprimano il gene; in seguito è possi-
bile addizionare al medium di coltura il substrato per la luciferasi. L’analisi della luce prodotta viene
effettuata sia in cellule vive (attraverso un luminometro), oppure su cellule morte (attraverso un
saggio che prevede la lisi delle membrane cellulari, si recupera il contenuto citoplasmatico conte-
nente l’enzima luciferasi, si incuba con il substrato e si effettua la lettura).
Un gene reporter maggiormente utilizzato in biologia è la proteina GFP (Green Fluorescente Protein),
identificata per la prima volta nella medusa Aequorea Victoria. È una proteina che in natura produce
111
bioluminescenza dovuta al trasferimento di energia (processo Calcio-dipendente associato alla
proteina Aeqorina). La sua esposizione della proteina a raggi ultravioletti produce autofluorescenza
di colore verde in assenza di calcio, Aequorina o qualunque cofattore o substrato. Sono presenti delle
mutazioni puntiformi nel cromoforo che producono varianti di emissioni di luce a differente
lunghezza d’onda; in particolar modo la CFP (Cyan Fluorescent Protein) produce una luce di colore
blu, mentre la YFP (Yellow Fluorescent Protein) di colore giallo. Questa proteina può essere utilizzata
allo stesso modo della luciferasi per produrre un vettore promoterless, in cui l’emissione della luce
verde si ha solo per attivazione del promotore; oppure, molto spesso, viene utilizzata per ottenere
delle proteine di fusione dove la sequenza che codifica per questa proteina viene fusa in frame (in
modo da mantenere il frame di lettura) o all’N-terminale o al C-terminale di un gene che codifica per
la proteina di interesse.
112
7. Tecnologie di editing del genoma
7.1 Modifiche genomiche
Negli anni si sono sviluppate delle tecnologie di modifica molto più avanzate e sofisticate del genoma
di una cellula bersaglio e che consentono di mantenere il background genetico e i livelli di regolazione
di un determinato gene il più possibile a livello fisiologico. Nello specifico sono tecnologie che permet-
tono l’inserimento, ad esempio, di una mutazione di nostro interesse all’interno di un determinato
gene in modo tale da produrre una proteina mutata. Questa operazione viene compiuta all’interno
della cellula bersaglio senza dover andare a sovra-esprimere la proteina mutata e mantenendola
sotto il controllo del suo promotore endogeno. Tramite queste tecnologie è possibile ottenere dei
modelli di studio più simili possibile al reale. Le tecnologie che si sono evolute per andare a modificare
il genoma di una cellula bersaglio prevedono l’utilizzo di quattro classi di proteine che vengono
sfruttate per andare ad apportare modificazioni permanenti nel genoma della cellula bersaglio
(secondo quelle più recenti):
1. clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9);
2. transcription activator-like effector nucleases (TALENs); 3. zinc-finger nucleases (ZFNs); 4. homing endonucleases or meganucleases.
Tutte le tecnologie di “genome editing” si basano su dei sistemi enzimatici presenti in natura e
sfruttano la capacità delle cellule di attivare dei sistemi di riparazione del DNA quando questo viene
danneggiato, o in particolar modo, tagliato su entrambi i suoi filamenti (ds break). Nel momento in
cui si verificano queste situazioni, le cellule sono in grado di attivare due diversi tipi di sistemi di riparo
che differiscono a seconda che sia presente o meno un sistema guida che possa indirizzare tale
meccanismo di riparo:
1. In assenza di uno stampo per effettuare la riparazione viene attivato un meccanismo che
prende il nome di nonhomologous-end-joining (NHEJ), dove l’azione riparativa consiste nel
riassemblare i filamenti i filamenti colpiti da ds-break; durante questa fase può succedere che
la riparazione avvenga correttamente con successo, oppure che nel momento della ripara-
zione vengano inserite erroneamente alcune basi in più che portano a mutazione (puntiforme
in cui può cambiare il frame di lettura, può prevedere l’inserimento di uno stop-codon pre-
maturo) e all’ottenimento di una proteina non funzionante.
2. In presenza di uno stampo che può essere utilizzato dal macchinario di riparazione, in questo
caso si ha un meccanismo denominato homology-directed-repair (HDR), che può essere utiliz-
zato per effettuare un editing molto sofisticato che consente di guidare la riparazione cellu-
lare in modo tale che venga inserita la modifica di interesse.
Tutti i meccanismi di editing genomico di basano sul meccanismo riparatorio attivato dalla cellula nel
caso in cui incorre in un ds-break del DNA in assenza o in presenza di uno stampo (template); in
particolar modo, in assenza di un template il meccanismo di riparo può incorrere all’inserimento di
errori sequenziali. Per tale ragione le tecniche utilizzate consentono di silenziare l’espressione di un
113
determinato gene. Quando invece il template che viene fornito al meccanismo di riparazione ge-
nomica non è endogeno ma ricombinato si può andare an inserire una specifica mutazione oppure
semplicemente correggere una determinata mutazione endogena.
① HOMING ENDONUCLEASES – Enzimi codificati da sequenze di introni che ricono-scono,
legano e tagliano lunghe sequenze di DNA (14–40 bps). Questi enzimi indirizzano verso una specifica
regione del genoma introducendo una rottura del doppio filamento (DSB). Questo DBS viene riparato
utilizzando come stampo la sequenza che contiene il gene che codifica per le homing endonucleases
(questo meccanismo serve in natura a duplicare il gene che codifica per questo enzima e aumentarne
la frequenza allilica). Quindi si è pensato di poter sfruttare il fatto che questo enzima inducesse un
DSB per sfruttare l’apertura nel DNA e inserire la modifica di interesse. La grossa limitazione di questo
sistema sta nel fatto che le sequenze che vengono riconosciute dalle HE sono poche all’interno del
genoma e sono molto lunghe e difficili da modificare. Quindi in realtà non è possibile decidere in
modo specifico il sito sul quale apportare la modifica di interesse (o meglio la modifica verrà inserita
solo in prossimità della sequenza riconosciuta da questi enzimi). Ovviamente questo sistema non può
essere utilizzato per effettuare una correzione di tipo genico.
② ZINC-FINGER (ZFN) SYSTEM - è un altro sistema identificato in natura ed è un sistema più
versatile rispetto al precedente che consente di effettuare il DSB. Il sistema consiste nell’utilizzo di
una coppia di enzimi, detti appunto zinc-finger, che sono in grado di riconoscere sequenze di
lunghezza variabile dalle 8-20 pb. Il monomero superiore riconosce la sequenza complementare da
5’ a 3’, mentre quello inferiore da 3’ a 5’. Solo nel momento in cui ciascun monomero riconosce la
sua sequenza può avvenire il taglio e la formazione del DSB. La versatilità di questo sistema rispetto
al precedente è dovuta al fatto che la sequenza riconosciuta è più corta e poi perché ogni monomero
è costituito da diverse sub-unità ciascuna delle quali è in grado di riconoscere tre nucleotidi. Quindi
Figura 31. Meccanismi di riparazione del DNA cellulare.
114
è possibile comporre un monomero utilizzando le diverse sub-unità in modo tale che sia possibile
riconoscere tutte le eventuali triplette di nucleotidi. Nella pratica non è facile ideare proteine di
questo tipo che riescano a riconoscere effettivamente ogni tripletta però, almeno idealmente, il
sistema permette di riconoscere qualsiasi sequenza al livello del genoma e quindi andare a
direzionare il taglio (a differenza delle HE dove il taglio doveva essere effettuato in maniera obbliga-
toria laddove questi enzimi riconoscevano la regione di taglio). Il riconoscimento è di tipo proteina-
nucleotide.
③ TRANSCRIPTION ACTIVATOR-LIKE EFFECTOR (TALE) NUCLEASES
(TALENs). Sono delle vere e proprie proteine modulari composte da unità multiple (di solito
12-20). Tali moduli permettono il riconoscimento non di una tripletta ma bensì di un singolo nucleo-
tide. Difatti questo sistema manifesta una versatilità ancora maggiore rispetto ai due precedenti;
permette di effettuare un DSB utilizzando sempre il sito catalitico che era presente nelle zinc-finger
riconoscendo e tagliando qualsiasi sequenza presente all’interno del genoma di interesse. Anche in
questo caso il riconoscimento è di tipo proteina-nucleotide. Il vantaggio di questo sistema rispetto ai
precedenti sta nel fatto che è più semplice da ingegnerizzare, presenta una maggiore specificità oltre
alla sua versatilità atta a ridurre il fenomeno di taglio a sequenze simili a quella di interesse all’interno
del genoma (che possono dare un effetto di tipo tossico).
④ CLUSTERED REGULARLY INTERSPACED SHORT PALINDROME REPEATS
(CRISPR/CAS 9). La rivoluzione si ebbe nel 2005 quando fu scoperto che nei batteri, all’interno
del loro genoma, erano presenti delle corte sequenze palindromiche ripetute spaziate in modo
regolare. Si è scoperto che in mezzo a queste sequenze erano presenti degli spaziatori di origine non
batterica, che successivamente venero definite CRISPR. Fu presto scoperto che tali se-quenze erano
spesso associate all’enzima nucleasi (CAS). Questo sistema era alla base dei processi immunitari dei
batteri e degli Archea, che ha permesso soprattutto ai batteri di sopravvivere e fron-teggiare le
infezioni di tipo virale (fagi). È un sistema molto semplice che ha consentito e che tuttora consente ai
batteri di proteggersi nei confronti di un DNA esogeno di origine virale. Quando un virus inserisce il
suo DNA all’interno di un batterio, questo è in grado di riconoscere alcune sequenze presenti
all’interno di questo genoma (in particolare riconosce una sequenza di tre nucleotidi nota come
PAM), una volta riconosciute, va a tagliare in una regione immediatamente adiacente a questa
sequenza del genoma del virus o del plasmide nella quale va ad inserire il suo materiale genetico
ponendolo vicino a queste sequenze CRISPR (che fungono da spaziatori). In questo modo il batterio
riesce ad inserire nel proprio genoma una parte del genoma virale. Nel momento in cui trascriverà il
proprio genoma, verrà al contempo trascritta anche questa piccola sequenza; e il fatto che sia posta
vicino a queste sequenze palindromiche ripetute fa sì che si formeranno delle strutture particolari
che si chiameranno pre-cr -RNA successivamente processate dal sistema batterico per formare le cr-
RNA. Queste ultime hanno una struttura “a loop” che è costante ed è data dalle sequenze
palindromiche ripetute del batterio. Ogni cr-RNA avrà una piccola coda variabile che corrisponde alla
sequenza complementare alla sequenza del genoma del virus (o del DNA esogeno). Il cr-RNA viene
caricato all’interno di un complesso proteico (CAS 9) (che funziona similmente come il dicer) e
funziona da stampo-guida per la degradazione del DNA da parte del CAS 9. Infatti, a seguito di una
nuova infezione da parte dello stesso virus, il batterio riconosce e degrada la sequenza di DNA del
virus infettante (o del DNA plasmidico che verrà completamente inattivato).
115
I componenti essenziali di questo sistema sono:
1. Le componenti CRISPR
2. La proteina CAS 9 (nucleasi in grado di tagliare in modo specifico il DNA) associata alle CRISPR.
Di queste proteine ne esistono di tre tipi.
3. La sequenza PAM (Protospacer adjacent motif) che si trova a fianco di quella sequenza
(costituita da un nucleotide qualsiasi e da due guanine) che viene inserita all’interno del
batterio, oppure nell’uomo quando viene sfruttato questo sistema per modificare il genoma
umano.
4. gRNA (guide-RNA) sono costrutti formati dal cr-RNA e da quello che viene chiamato trans-
activator-cr-RNA.
Figura 32. Funzionamento del CRISPR/CAS 9.
Il funzionamento del CRISPR/CAS 9 avviene secondo diversi step:
1. Fase di acquisizione. È la fase in cui il DNA esogeno viene incorporato all’interno del DNA
batterico a livello dei CRISPR loci. Come è possibile osservare in fig.32, la sequenza più
prossima (di solito a monte) alla sequenza PAM può essere incorporata all’interno del genoma
batterico in uno dei suddetti locus CRISPR che consiste in una serie sequenze palindromiche
di cr-RNA inframezzate da DNA esogeno.
2. Fase di trascrizione del genoma batterico e la formazione del cr-RNA. All’interno del genoma
batterico si ha la regione dei cr-loci che darà origine ad un trascritto primario; immediatamen-
116
te a monte è presente una sequenza che codifica per una struttura nota come tracr-RNA e le
sequenze che codificano per la proteina CAS 9. Ottenuto il trascritto primario, in corrispon-
denza del sito primario, verranno trascritti anche i tracr-RNA necessari per la formazione del
cr-RNA. Si forma, sostanzialmente, una struttura composta dai tracr-RNA e dai singoli cr-RNA.
Tutta questa struttura verrà successivamente riconosciuta e inserita all’interno dell’enzima
CAS 9 con la funzione di guidare la degradazione di un frammento specifico di DNA. Di solito
la CAS 9 effettua un taglio di una sequenza di DNA (pari a 20 nucleotidi) complementare alla
sequenza che si trova adiacente alla PAM sul DNA bersaglio. Quello che viene inserito all’inter-
no del batterio è costituito dal target senza la PAM poiché questa viene unicamente sfruttata
per avere la specificità di taglio (DSB) sulla sequenza target. Se non vi è la sequenza PAM, il
taglio non avviene. Questo sistema è importante perché protegge il batterio dall’auto-
digestione del proprio DNA. Infatti grazie a questa sequenza, la CAS 9 riconosce anche il
proprio materiale genetico che non viene digerito proprio perché non riconosce alcuna
sequenza PAM legata ad esso. Una volta che la CAS 9 viene associata al cr-RNA, e utilizza
questa sequenza per poter scansionare il DNA esogeno al fine di ritrovare il suo target; nel
momento in cui avviene la complementarietà perfetta o quasi perfetta, un sistema di
ricontrollo verifica la presenza della sequenza PAM.
Figura 33. Funzionamento della CAS 9.
117
In una visione ancor più dettagliata, la guida che permette al CAS 9 di effettuare il taglio è fornita da
una struttura composta dal tracr-RNA (una sequenza sempre uguale trascritta dal genoma batterico)
che, a sua volta, si associa con un cr-RNA (costituito da una sequenza complementare al tracr-RNA)
e ad una sequenza target di 20 nucleotidi che è complementare al DNA esogeno sul quale effettuare
il DSB. Nel momento in cui tutta questa struttura viene caricata dalla CAS 9, qualora si ripresenti una
seconda infezione dello stesso virus, attraverso questo sistema la CAS 9 è in grado di legare il DNA
target, di aprirlo, scorrere i suoi filamenti in modo tale da verificare la presenza di questo target. Se
la CAS 9 riscontra una certa complementarietà con le sequenze del DNA esogeno, allora questa
verifica la presenza della sequenza PAM. Ad esito positivo, si verifica una mutazione conformazionale
che permette l’attivazione della CAS 9 per effettuare DSB.
La proteina CAS 9 è composta da due siti attivi:
1. Il sito HNH, quello in cui avviene il riconoscimento e l’alloggiamento della sequenza (strand)
complementare al cr-RNA. In questo sito viene effettuato il taglio tra i nucleotidi adiacenti alla
sequenza PAM.
2. Il sito RuvC, che taglia il secondo filamento non complementare nello stesso punto individuato
dal primo sito.
Tecnologia CRISPR/CAS 9. Rispetto alle altre tecnologie, quello dei CRISPR è di sicuro quello più
versatile di tutti perché il riconoscimento avviene nucleotide-nucleotide e questo assicura una
maggiore specificità, rapidità di utilizzo ed economicità.
Per poter utilizzare questo sistema sono state compiute delle modifiche in particolare:
1. Il cr-RNA e il trasc-RNA sono state fuse in un’unica struttura, il guide-RNA (ovvero un’unica
molecola di RNA che è molto più semplice da produrre);
2. La seconda modica importante è quella a livello della CAS 9, la quale è stata convertita da
endonucleasi a due domini catalitici differenti ad una coppia di nickasi attraverso una muta-
zione del domino RuvC. Il vantaggio di questa modifica è che ciascuna nickasi può essere
associata con uno specifico guide-RNA che riconosce e taglia uno solo dei due filamenti. Viene
sfruttato il fatto che il sistema di riparo riconosce anche un taglio sfalsato come DSB purché il
taglio sui due singoli filamenti sia sufficientemente vicino –si può pensare di disegnare le due
guide-RNA in modo che una sia complementare ad un filamento e l’altra con uno shift di 20-
30 basi, questo permette di aumentare ulteriormente la specificità in quanto è impossibile
trovare due regioni all’interno del genoma che possano essere riconosciute da due guide-RNA
sfalsate (quindi permette di ridurre le mutazioni off-target).
Questo sistema può essere utilizzato per effettuare modificazioni genomiche molto sofisticate. Per
funzionare necessità di un enzima come la CAS 9, di guide-RNA disegnate (attraverso particolari
software) allo scopo di indirizzare il taglio presso la regione di interesse. Affinché la CAS 9 effettui il
taglio, è necessario che sia presente la sequenza PAM e che la sequenza di taglio si trovi in prossimità
a adiacente ad essa. Per l’inserimento di questi elementi all’interno delle cellule per effettuare il
genome editing si utilizza uno dei sistemi di trasfezione descritti precedentemente. Generalmente
viene sfruttato un plasmide commerciale che contiene tutti gli elementi classici di espressione
batterica. Tale plasmide sarà in grado di codificare per la CAS 9 (sotto il controllo di un promotore
forte) e al suo interno, in siti specifici, è possibile inserire e clonare le guide-RNA disegnate per il gene
118
di interesse. In seguito si utilizza il plasmide batterico per trasfettare le cellule bersaglio. La strategia
è quella di disegnare due oligonucleotidi di circa 20pb (paia di basi) che rappresentano il senso (5’-
3’) e l’antisenso (3’-5’) della sequenza target (bisogna tener presente che la sequenza complementare
deve essere disposta vicina ad una sequenza PAM). Si procede con l’annilazione dei due oligonucleo-
tidi al fine di formare un duplex e poterlo inserire all’interno del vettore (ottenuto attraverso cellule
rese competenti e che presentano resistenza alla kanamicina) dopo aver digerito eventualmente
alcuni siti specifici di taglio (attraverso enzimi di restrizione). Si esegue il clonaggio del gene che
codifica per la CAS 9 e si trasfetta in una cellula di mammifero. Importante potrebbe essere (nel
momento della trasfezione) l’aggiunta di un secondo plasmide che prende il nome di donor template.
Difatti, come si era detto precedentemente, nel momento in cui si va ad effettuare un DSB del DNA,
il macchinario cellulare si attiva al riparo del danno; in assenza dello stampo la riparazione avviene o
perfettamente attraverso mutazioni che vedono l’inserimento di nucleotidi in più. A tal proposito
potrebbe essere interessante guidare il riparo del genoma, sfruttando la capacità delle cellule di
ricorrere ad uno stampo di riparazione. Se viene fornito uno stampo esogeno al sistema di ripara-
zione, questo inserisce la modifica di interesse. Sostanzialmente, viene fornita alla cellula un template
che consiste in una sequenza complementare alla regione che fiancheggia il taglio eseguito ad opera
della CAS 9 (up-stream e down-stream) che contiene al centro la modifica di interesse. A seguito del
taglio, infatti, le sequenze fiancheggianti note come braccia omologhe (homology arms) si inseriscono
all’interno del break e forniscono il nuovo stampo per il macchinario di riparazione (la DNA polimerasi
che duplicherà il filamento stampo inserendo la modifica di interesse).
Come si fa a disegnare un donor template per avere un genome editing più accurato possibile? – è
necessario considerare 5 parametri:
1. la distanza dal sito di taglio della CAS 9. Il filamento omologo contenente la modifica che si
va ad inserire ha la maggiore efficienza quanto più questo è vicino al DSB (può discostarsi da
esso per un massimo 10 nucleotidi).
2. identificcare le cr-RNA compatibili. Quando viene effettuato il taglio (DSB) all’interno del ge-
noma, il sistema di riparo delle cellule di mammifero tenderà a riparare tale danno nel minor
tempo possibile. Solitamente viene utilizzato un meccanismo di tipo nonhomologous-end-
joining (NHEJ) (vedi pag. 106) perché è più rapido e semplice. Quindi difficilmente verrà
utilizzato il donor template esogeno fornito. L’obbiettivo è quello di andare ad aumentare la
probabilità dell’utilizzo del donor template funzioni. Questo è possibile rendendo il sistema di
taglio (CAS 9) con le guide-RNA il più efficiente possibile. Vengono scelte accuratamente le
guide-RNA e posizionarle in prossimità di due PAM diverse; e possibilmente la CAS 9 modi-
ficata a double-nickasi. Nel momento in cui questo costrutto verrà trasfettato alla cellula
bersaglio fornendo il donor template; la CAS 9 caricherà le guide-RNA e in maniera piuttosto
efficiente eseguirà il taglio del DNA. Successivamente il macchinario cellulare procederà con
il riparo e a causa della frequenza dei tagli si aumenta la probabilità che almeno una volta il
donor template fornito. Infatti è sufficiente che venga utilizzato il template una volta soltanto
che si è sicuri di aver inserito la modifica genetica di interesse.
3. scegliere il tipo di modifica da effettuare. Al momento in cui il template viene ideato, bisogna
tenendo conto dell’obbiettivo che si propone la modifica da effettuare (inserzione di un gene,
mutagenesi sito-specifica, inserzione/correzione di una mutazione puntiforme).
119
4. lunghezza dei bracci omologi (homology arms). Le sequenze che fiancheggiano la regione che
si vuole modificare e che ne permettono l’inserzione del donor template all’interno del DSB
devono essere di dimensione pari a 30-40 nucleotidi e simmetrici rispetto alla regione in cui
viene effettuata la modifica.
5. modifica del donor template e la sua resistenza alla CAS 9. Vengono apportate delle modifica-
zioni alla sequenza che potrebbe consentire alla CAS 9 di digerire il donor template (poiché
complementare alla sequenza di taglio – contiene le PAM e la sequenza complementare alle
guide-RNA). Le strategie che si possono effettuare a tal proposito sono due:
a. split in due della sequenza target di 20 nucleotidi (riconosciuta dalle guide-RNA) - qualora
questa sia presente nel template – ponendo l’inserto all’interno della sequenza ricono-
sciuta in modo tale questa sequenza sia spezzata in due parti dall’inserto stesso e non sia
riconosciuta dalla CAS 9.
b. modificare la sequenza contenuta all’interno del donor template andando a mutageniz-
zare la PAM, inserendo un nucleotide differente da una guanina in modo tale che la PAM
non venga più riconosciuta come tale; oppure può essere mantenuta intatta la PAM e
modificata quella sequenza riconosciuta dalle guide-RNA – attraverso l’inserimento di
mutazioni puntiformi.
Esistono dei software in commercio che consentono di disegnare in maniera opportuna sia le guide-
RNA che il donor template, o di identificare le sequenze PAM; basta inserire la regione di interesse
che si vuole modificare. Questi software con-sentono di identificare la strategia migliore da adottare
per effettuare il genoma editing e avere la maggiore probabilità possibile che questa avvenga con
successo. Bisogna tenere in considerazione che il genome-editing effettuato utilizzando questo sis-
tema è poco frequente e di difficile realizzazione; per cui, una volta trasfettate le cellule di mammi-
fero con il costrutto che codifica per la CAS 9 e contenente anche le guide-RNA e il donor template,
sarà necessario effettuare uno screening di una moltitudine di cloni cellulari per identificare quello
che ha subito la modifica genica di interesse. Lo screening verrà effettuato con un meccanismo analo-
go a quello visto per le trasfezioni stabili. Molto spesso quando si fa una modifica che prevede
l’utilizzo di un donor template, all’interno di quest’ultimo viene inserito (oltre al gene di interesse) un
gene che codifica per una resistenza ad un determinato antibiotico per selezionare quali cellule saran-
no geneticamente modificate.
120
8. Tecniche di microscopia a
fluorescenza
8.1 Luminescenza
Per luminescenza si intende l’emissione di luce da atomi, molecole o cristalli eccitati elettronicamen-
te. Si può dividere in:
1. luminescenza di tipo luminoso – si parla di fotoluminescenza;
2. luminescenza di tipo chimico – è nota anche come chemioluminescenza.
La fotoluminescenza può essere divisa in due sottogruppi: fluorescenza e fosforescenza. La differenza
principale è che la fluorescenza si ferma appena finisce l’illuminazione. La fosforescenza può durare
anche ore dopo il termine dell’eccitazione. Quindi differiscono per il tempo che impiega la molecola
ad emettere radiazione luminosa.
8.2 Fluorescenza
Introduzione alla fluorescenza. Normalmente quando gli oggetti assorbono energia lumino-sa,
quello che succede quasi sempre è che questi dissipano tale energia assorbita sotto forma di calore;
alcune sostanze però, sono in grado di liberare parte dell’energia assorbita sotto forma di luce con
lunghezza d’onda differente rispetto a quella assorbita. Queste molecole sono note come
fluorescenti. La fluorescenza è il risultato di un processo a tre step che accade in molecole chiamati
fluorofori. Una sonda fluorescente viene disegnata per rispondere a specifici stimoli o per localizzarsi
in una specifica regione di una specie biologica. La fluorescenza prende il suo nome da un minerale
di calcio e fluoro, la fluorite, in cui questa re-emissione luminosa fu osservata per la prima volta.
Quali sono le molecole fluorescenti? Sono molecole contenenti dei sistemi aromatici π ad alta coniu-
gazione. Le molecole più note in biologia cellulare sono la fluoresceina (più utilizzata), le flavine, le
rodamine e le porfirine. Il meccanismo di fluorescenza avviene attraverso tre step:
S
S’
ην EX ην EMI
S0
ENER
GIA
①
②
③
Figura 34. Meccanimo della fluorescenza.
121
① ECCITAZIONE. Un fotone di energia hνex viene fornito da una fonte esterna come una lampada
incadescente od un laser, e viene assorbita dal fluoroforo. L’energia fornita fa in modo che la mole-
cola passi dallo stato fondamentale a quello eccitato.
② ASSORBIMENTO. Il fluoroforo va incontro a cambiamenti conformazionali ed è soggetto ad una
serie di interazioni con l’ambiente molecolare. L’energia S1’ viene parzialmente dissipata portando ad
uno stato eccitato S1.
③ STATO DI EMISSIONE. Un fotone di energia hνem viene emesso ed il fluoroforo torna nello stato
S0. A causa dell’energia di dissipazione, l’energia del fotone è minore, e la sua lunghezza d’onda
maggiore di quelle di eccitazione. La differenza di energia o lunghezza d’onda (hνEX – hνEM) è chiamato
spostamento di Stoke (Stokes shift).
Purché si abbia questo fenomeno è importante che nella molecola vi siano degli elettroni mobili in
grado di passare facilmente da uno stato all’altro.
Figura 35. Stokes Shift. L’energia emessa sarà più grande rispetto a quella di assorbimento, poiché queste sono inversamente proporzionali.
La fluorescenza si ha solo quando il fluorocromo viene illuminato alla corretta lunghezza d’onda. La
lunghezza d’onda dipende dallo spettro di assorbimento del fluoroforo. A tale lunghezza d’onda
infatti corrisponde l’energia necessaria per eccitare gli elettroni dello stato fondamentale e passare
allo stato eccitato.
E= hν ν=c/λ
122
Lunghezza d’onda ed energia sono grandezze inversamente proporzionali. Per ogni molecola esiste
uno spettro di assorbimento ed uno di emissione.
8.3 Proteine fluorescenti
Le molecole fluorescenti più utilizzate in biologia cellulare sono le proteine.
La GFP (Green Fluorescent Protein) è una proteina di 238 aa (27 KDa) isolata dalla medusa Aequorea
victoria. Il suo gene è stato clonato ed è disponibile commercialmente in diversi vettori plasmidici.
Inducendo mutazioni nel gene della GFP sono state prodotte varianti di questa proteina con
caratteristici spettri di assorbimento ed emissione (BFP, CFP, YFP). Il suo ruolo fisiologico è di
trasdurre la chemio-luminescenza blu della proteina aequorina in luce fluorescente verde. Molto
usata per produrre proteine chimeriche fluorescenti, con GFP fusa all’estremità N o C terminale.
Questa tecnica serve per studiare la localizzazione o il livello di espressione di una proteina di
interesse. Le modificazioni di questa proteina hanno permesso l’ottenimento di varianti (blu, giallo
e ciano). Spesso nei plasmidi si trova indicato anche eGFP, dove “e” sta per “enhanced”, questo sta
ad indicare che questa proteina è stata mutagenizzata al fine di aumentarne maggiormente la fluore-
scenza (per renderla più brillante). Molto spesso si utilizzano anche delle proteine di colore rosso che
hanno avuto origine da questa proteina isolata dall’anemone di mare, le quali vengono chiamate
DsRed.Anche in questo caso sono state effettuate delle varianti andando a modificare alcuni
amminoacidi presenti nel fluocromo della proteina. Le varianti sono date da fluorescenza giallo
banana, arancione e rosso.
Ogni proteina fluorescente ha uno spettro che la contraddistingue, quindi è necessario che conoscere
il suo spettro di eccitazione e di emissione. Questo permetterà di sapere a che lunghezza d'onda
potrà essere eccitata tale proteina affinché questa emetta un segnale luminoso. È importante anche
conoscere la lunghezza di emissione perché consentirà di settare il detector su quella lunghezza
d'onda e quindi essere in grado di vedere il segnale qualora sia presente.
Figura 36. Rappresentazione di alcuni spettri di assorbimento (A) e di emissione (B) dei principali fluorofori
usati in ricerca biomedica. Caratteristica tipica della fluorescenza è che, coinvolgendo stati energetici
vibrazionali non radiativi che fanno perdere energia al fluoroforo eccitato, gli spettri di assorbimento in
eccitazione hanno λ minori rispetto a quelli in emissione, come visibile confrontando i due grafici. Questo
permette di rilevare l’emissione fluorescente su una λ differente da quella con cui il fluoroforo è stato eccitato.
123
E’ possibile utilizzare diversi fluorocromi all’interno dello stesso campione e analizzarli in contempo-
ranea se gli spettri dei due fluorocromi non si sovrappongono (ovvero se è possibile eccitare i due
fluorocromi singolarmente). Infatti, più questi sono lontani in lunghezza d’onda più sarà la probabilità
di poterli utilizzare in contemporanea.
8.4 Microscopio a fluorescenza.
Per poter effettuare esperimenti su delle molecole fluorescenti è necessario disporre di un particola-
re microscopio in grado di rilevare la fluorescenza di queste molecole. Tale strumento è anche in
grado di eccitare la molecola fluorescente di interesse ad un’opportuna lunghezza d’onda. Il micro-
scopio a fluorescenza permette di andare a determinare la localizzazione di una proteina o di diverse
proteine, determinare la forma di organi, cellule, strutture intracellulari, valutare la dinamica delle
proteine (in termini di spostamento), studiare le interazioni tra proteine o la loro struttura, valutare
la concentrazione ionica ecc.
Figura 37. Microscopio a fluorescenza.
DESCRIZIONE DI UN MICROSCOPIO A FLUORESCENZA. Un microscopio a fluorescenza è
sostanzialmente composto da:
1. una lampada che consente di generare la radiazione luminosa che eccita il campione. Le
lampade più utilizzato sono lampade a vapori di mercurio e le lampade allo xeno perché sono
lampade ad alta energia e che sono in grado di produrre ed emettere luce a tutte le lunghezze
d’onda dello spettro visibile.
a. lampada a vapori di mercurio - è quella più utilizzata ed è in grado di emettere delle
radiazioni luminose con picchi di emissione a particolare lunghezza d'onda molto
intense.
b. lampada allo xeno - emette con radiazione luminosa con energia minore ma più
costante (senza grossi picchi, ma viene emessa allo stesso modo per tutte le lunghezze
d’onda).
124
2. un sistema di filtri e di obbiettivi che permettono all’operatore di osservare il campione e di
selezione e indirizzare la lunghezza d’onda della radiazione che colpisce il campione. La
radiazione che viene emessa dalle lampade può essere di diverse lunghezze d’onda, quindi è
necessario avere dei sistemi che filtrino, in modo da selezionare tra tutte le lunghezze d’onda
prodotte, soltanto quelle di interesse. Di filtri ce ne sono di diversi tipi all’interno del micro-
scopio a fluorescenza, sostanzialmente divisibili in due categorie:
a. filtri di eccitazione (o filtro barriera) – sono quelli posti subito dopo la lampada, e per-
mettono di selezionare solitamente una sola di queste o un range molto ristretto.
b. filtri di emissione – tra tutte le radiazioni emesse dal campione, selezionano solo quelle
che corrispondono alla lunghezza d’onda del fluorocromo in esame. Tali filtri sono
neces-sari per eliminare eventuali interferenze. Un filtro di emissione è posto poco
prima del detector.
I filtri che si trovano all’interno di un microscopio a fluorescenza sono di tre tipi:
a. Band Pass filter (filtro passabanda) – permette il passaggio solamente delle lunghezze
d’onda che sono comprese all’interno di un range.
b. Short Pass filter - è un filtro passabanda ancor più ristretto e molto spesso utilizzati in
un filtro multibanda in cui sullo stesso filtro vengono selezionate più di una lunghezza
d’onda , o meglio, più di un range ristretto di lunghezze d’onda.
c. Long Pass Filter - lascia passare tutte le lunghezze d’onda al di sopra di una determi-
nata lunghezza d’onda.
3. uno specchio, detto dicroico, che riflette la luce filtrata in emissione e la indirizza sul campione,
e qualora il fluorocromo venga colpito dalla radiazione luminosa alla corretta lunghezza
d’onda di eccitazione, questo successivamente sarà in grado di emettere una lunghezza
d’onda maggiore rispetto a quella di eccitazione. Quindi lo specchio riflette le lunghezze
d’onda inferiori a quella necessaria e lascia passare quelle al di sopra di questa (solo quelle
che vengono emesse).
4. un detector che permette di osservare la luminescenza emessa attraverso:
a. un obiettivo che permette di osservare in maniera oculare le radiazioni luminose e-
messe dal campione in esame;
b. Tubo fotomoltiplicatore (confocale)
c. una CCD camera che converte il segnale luminoso in digitale.
La parte sottostante è identica a quella di un normale microscopio ottico.
Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) – MICROSCOPIA CONFOCALE. E’ una tecnica
basata su un microscopio ottico convenzionale dove al posto di una lampada vi è un raggio laser che
colpisce il campione e viene costruita un’immagine pixel per pixel raccogliendo i fotoni, spesso
attraverso un fotomoltiplicatore. Vengono acquisite immagini per ogni piano del campione. Il
microscopio confocale focalizza la luce su una zona molto piccola del campione, alla profondità desi-
derata, ovvero solo quella zona riceve l’illuminazione (questo riduce la luce diffusa dalle altre zone
del campione) e sarà quella che emetterà fluorescenza. Questa operazione è importante perché,
illuminando una zona più ampia del campione, si potrebbe ottenere un segnale poco nitido dato
dall’interferenze di emissione di un fluorocromo e di quello adiacente. Dunque, l’idea che ha dato
125
origine a questo tipo di microscopio nasce dalla possibilità di illuminare una piccola porzione del
campione come se questo venga sezionato in vari piani; e successivamente, attraverso l’acquisizione
di più piani illuminati è possibile ricostruire l’immagine al computer. La luce viene comunque riflessa
anche dagli strati del campione sopra e sotto il fuoco dell’illuminazione.
Funzionamento. La differenza rispetto ad un microscopio in campo chiaro è data dall’inserimento di
un diaframma (apertura confocale) prima del detector.
Figura 38. a) Microscopio in campo chiaro (wide field); b) microscopio confocale.
Osservando la figura 38, si può distinguere una sorgente luminosa che genera una radiazione
luminosa, che una volta filtrata colpisce lo specchio dicroico e successivamente colpisce il campion in
esame. Nel sistema in campo chiaro (a), una volta selezionato un piano focale, questo non verrà
unicamente investito dal fascio luminoso, ma anche le molecole vicine, e quindi l’emissione del
segnale sarà generato anche da parte di queste, oltre che dal piano. Differentemente, nel sistema
confocale (b), per eliminare queste riflessioni spurie (ovvero tutte le riflessioni che non provengono
dal piano focale), basta inserire un diaframma (uno schermo con un forellino/pinhole) nel punto in
cui la luce riflessa viene focalizzata, lontano dal campione (prima del detector), dallo stesso obiettivo
che si usa per illuminarlo. Con il diaframma è possibile focalizzare la radiazione di interesse. Solo la
126
luce riflessa dal punto desiderato passa per il forellino, mentre quella riflessa dagli altri piani focali
non viene messa a fuoco sul pinhole e non passa. La luce che passa il pinhole raggiunge poi un
rivelatore. Nella microscopia a fluorescenza convenzionale l’immagine è disturbata da tutte le parti
che non sono a fuoco. Nella microscopia confocale i piani non a fuoco sono esclusi dalla formazione
dell’immagine che risulta molto più nitida.
8.5 Applicazioni della fluorescenza in biologia cellulare
IMMUNOFLUORESCENZA. Un’applicazione importante è l’immunofluorescenza. Questa
tecnica riguarda l’utilizzo di molecole fluorescenti (fluorocromi) abbinate ad una reazione di tipo im-
munitario (che prevede l’utilizzo di anticorpi). L’antigene è rappresentato dalla proteina di interesse.
attraverso questa tecnica è possibile andare a rendere fluorescente (mediante l’utilizzo di un fluoro-
cromo) una proteina di studio (riguardo il suo metabolismo, la sua localizzazione, il suo com-
portamento ecc.) in ambiente intracellulare. Di immunofluorescenza ne esistono di due tipi:
1. diretta - si utilizza un anticorpo primario direttamente coniugato al fluorocromo. L’antigene
si deve trovare sulla molecola oggetto di studio e l’anticorpo deve essere in grado di rico-
noscere questo antigene specifico. Nel memento in cui avviene la reazione che coinvolge
antigene e anticorpo, quello che può essere osservato mediante microcopio a fluorescenza è
la presenza della proteina di studio nel punto di fluorescenza.
2. indiretta – si utilizzano due anticorpi differenti; ovvero un anticorpo primario che riconosce
la proteina di interesse, e un anticorpo secondario fluorescente (coniugato al fluorocromo)
che riconosce l’anticorpo primario nella sua regione costante.
L’immunofluorescenza viene eseguita attraverso un protocollo specifico.
Figura 39. Uovo fecondato di riccio di mare in mitosi, analisi per tubulina.
a) Microscopia a fluorescenza convenzionale; b) Microscopia a fluorescenza confocale
127
PROTOCOLLO PER IMMUNOFLUORESCENZA.
Prevede diversi step:
1. FISSAZIONE - è quel processo che consente di portare a morte le cellule del preparato di
interesse in modo tale che queste mantengano la citoarchitettura. Il processo di fissazione
può avvenire utilizzando due tipi di sostanze:
a. Aldeidi – agenti cross-linkanti (paraformaldeide al 4%in PBS, 15-20mins a RT).
La p-foraldeide che è la più utilizzata. Formano ponti di legame tra aa liberi, creando
un network di antigeni liberi. Preservano meglio la citoarchitettura della cellula; certe
volte però mascherano l’antigene e necessitano di ulteriori steps di permeabilizazio-
ne prima dell’incubazione con l’anticorpo.
b. Sostanze organiche – metanolo, acetone, miscele MeOH-acetone (MeOH assoluto -
20°C è quello più utilizzato) Rimuovono i lipidi e fanno precipitare le proteine sull’archi-
tettura. Oltre all’azione fissativa permeabilizzano la cellula all’ingresso dell’anticorpo
ma preservano meno citoarchitettura.
Il metodo scelto si basa sul tipo di antigene.
Dopo la fissazione è possibile effettuare un lavaggio con glicina allo 0,1% in PBS, per
eliminare l’eccesso di reagente che si è visto essere un forte interferente (soprattutto le
aldeidi) con la fluorescenza (riducono l’emissione luminosa).
2. PERMEABILIZZAZIONE – avviene soprattutto se la fissazione è stata effettuata attraverso
l’utilizzo di aldeidi (in particolar modo con p-formaldeide) e prevede l’uso di detergenti
(possibilmente non ionici) che, a seguito di un processo di incubazione, facilita l’ingresso
dell’anticorpo nella cellula. Il processo di permeabilizzazione è necessario se l’antigene si
trova all’interno della cellula; diversamente, se questo si trova esposto sul foglietto es-
terno della membrana plasmatica allora tale processo non è necessario. I detergenti non
ionici più utilizzati sono (di solito) il Triton (X100: 0.02% - 0.2% in PBS), il Tween 20, il
NonidetTM P-40 (NP40) e il Saponin.
Eseguire un lavaggio in PBS.
3. SATURAZIONE DEI SITI ASPECIFICI – esistono delle regioni in cui si addensano determinate
cariche elettriche, regioni che possono essere presenti sulle superfici di ancoraggio delle
cellule. Può essere effettuato un cutting per aumentare l’elettrofilicità del substrato, ma
potrebbero essere presenti ancora dei siti di legame liberi che in qualche modo potrebbe-
ro fare avvenire delle reazioni di legame aspecifici dell’anticorpo. Quello che può essere
fatto per ridurre la presenza di questi siti di legame aspecifici è aggiungere delle proteine
che solitamente sono molto abbondanti nel siero come:
a. BSA (sieroalbumina bovina) al 3% in PBS che satura i siti di legame aspecifici deter-
minati da interazioni di carica elettrica in modo tale che l’anticorpo non si leghi a questi
siti e così facendo venga favorita l’interazione con l’antigene.
b. Siero non immune proveniente dalla stessa specie animale che ha prodotto l'anticorpo
secondario: NGS (normal goat serum) /NRS (normal rabbit serum). Viene saturata una
eventualie aspecificità specie-specifica.
4. INCUBAZIONE CON ANTICORPO PRIMARIO LAVAGGI IN PBS 5. INCUBAZIONE CON ANTICORPO SECONDARIO LAVAGGI IN PBS
128
c. Latte in polvere al 5% in PBS, è molto ricco di proteine che possono svolgere un’azione
saturante nei confronti di questi siti aspecifici.
Eseguire un lavaggio in PBS.
4. INCUBAZIONE CON ANTICORPO PRIMARIO – gli anticorpi primari, solitamente, vengono
diluiti in PBS con la proteina utilizzata per la saturazione dei siti aspecifici, che può essere
BSA 3% oppure latte in polvere al 5%. Tale operazione può avvenire per una o due ore a
temperatura ambiente, oppure per una notte intera a 4°C. La differenza tra le due tempe-
rature di incubazione è dovuta principalmente al tempo; infatti per tempi di incubazione
brevi allora l’anticorpo può essere incubato a temperatura ambiente (o circa 37°C), per
favorire il corretto funzionamento fisiologico dell’anticorpo, mentre per un tempo pro-
lungato la riduzione della temperatura riduce il rischio di avere interazioni aspecifiche
dell’anticorpo che interferirebbero con il legame per l’antigene. In questo step è impor-
tante stabilire quanto anticorpo aggiungere per effettuare la marcatura del campione. Tale
quantità dipende dall’anticorpo stesso, dall’antigene e dal tipo cellulare; ma in ogni caso
va determinata sperimentalmente. Di solito non si lavora mai in eccesso di anticorpo per
due motivi: 1) lavando in eccesso di anticorpo si possono avere reazioni di tipo aspecifico;
e 2) gli anticorpi primari costano veramente tanto (soprattutto se essi sono combinati con
dei fluorocromi).
Figura 40. Struttura di un anticorpo. La regione variabile è quella che riconosce in
maniera specifica l’antigene (diversa da un anticorpo all’altro; la regione costante è
quella che varia a seconda della specie (quella che riconosce l’anticorpo secondario).
Eseguire un lavaggio in PBS.
5. INCUBAZIONE CON ANTICORPO SECONDARIO -
LAVAGGI IN PBS 6. COLORAZIONE DEI NUCLEI LAVAGGI IN PBS
129
Controlli per immunofluorescenza. Quando si effettua un’analisi di immunofluorescenza è molto
importante aggiungere dei controlli per assicurarsi che la fluorescenza osservata sia specifica della
proteina di interesse (o meglio per escludere che ci siano delle interazioni aspecifiche). A tal proposito
viene eseguito un controllo dell’anticorpo secondario (in quanto è quello che può dare maggiore
aspecificità), di solito andando ad omettere l’anticorpo primario dalla reazione di immunofluore-
scenza. Quello che ci sia aspetta è che ne pozzetto di controllo non vi sia alcuna marcatura. Il controllo
di specificità, solitamente, viene effettuato da chi produce l’anticorpo primario. Questo, prima di es-
Gli anticorpi primari possono essere non coniugati oppure direttamente coniugati. Se si
utilizza un anticorpo primario non coniugato allora è necessario utilizzare un anticorpo
secondario coniugato al fluorocromo.
Eseguire un lavaggio in PBS.
5. INCUBAZIONE CON ANTICORPO SECONDARIO - anche l’anticorpo secondario deve essere
aggiunto in buffer che contiene l’agente utilizzato per la saturazione dei siti aspecifici (PBS
con 3% BSA o 5% latte in polvere) per un tempo più corto (1-2 ore perché gli anticorpi
secondari si legano con più facilità rispetto a quelli primari) a temperatura ambiente al
buio (perché nel momento in cui è presente il fluorocromo è necessario impedire che
questo venga eccitato durante l’incubazione – qualora anche l’anticorpo primario fosse
stato coniugato con un fluorocromo, anche in questo caso bisognerebbe effettuare
l’incubazione in assenza di luce). Può essere utilizzato un anticorpo secondario nella sua
integrità legato al fluorocromo, o solamente la parte della molecola che è implicata nel
riconoscimento dell’anticorpo primario.
Eseguire un lavaggio in PBS.
6. COLORAZIONE DEI NUCLEI – molto spesso, terminata l’incubazione con l’anticorpo secon-
dario, viene effettuata la colorazione dei nuclei utilizzando delle molecole fluorescenti che
sono degli intercalanti del DNA. Quelli più utilizzati in gran parte per colorare nuclei e/o
cromosomi sono:
a. DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindolo cloridrato); b. HOECHST (Bis-benzimide); c. PI (ioduro di propidio). I primi due emettono il blu, mentre il PI il rosso. DAPI e PI non sono un grado di permeare le cellule integre, ma necessitano di uno step di permeabilizzazione per essere integrati all’interno della cellula e poi nel nucleo (in questo caso lo step di permeabilizzazione che viene effettuato all’inizio del protocollo di immunofluorescenza – punto 2 – e rimane valido per tutta la sua durata). Eseguire un lavaggio in PBS.
7. MONTAGGIO.
Nota. il PBS è un buffer che abbia un pH più fisiologico possibile. I lavaggi con PBS sono molto importanti perché
consentono di eliminare l’eccesso di qualsiasi reagente introdotto nello step precedente. Molto importanti sono i
lavaggi effettuati dopo l’incubazione con anticorpi, per eliminare l’eventuale presenza di anticorpi non legati. Questo
serve per evitare di ottenere segnali aspecifici.
130
sere messo a contatto con il campione, viene preincubato con l’antigene usato per generarlo con
concentrazione di cento volte maggiore di quella dell’anticorpo. Una volta preincubato, e succes-
sivamente messo a contatto col campione, non deve dare alcuna marcatura. E’ cruciale per capire se
l’anticorpo primario riconosce l’antigene in modo specifico. Spesso si unisce ad un controllo in
Western Blot.
Marcature multiple. Spesso è possibile andare a colorare, all’interno dello stesso campione, più di un
antigene; qualora i fluorocromi utilizzati per la rilevazione (abbinati agli anticorpi) abbiano degli spet-
tri sufficientemente separati (non si devono sovrapporre) per garantire le singole rilevabilità alle
lunghezze d’onda fornite. Le combinazioni più comuni sono quelli che vedono l’utilizzo di coloranti
che si trovano più lontani possibili sullo spettro. Tra questi il DAPI e il PI che, come detto in prece-
denza, emettono rispettivamente il primo nel blu e il secondo nel rosso. Molto spesso è possibile
utilizzare la proteina fluorescente verde con alcune proteine rosse.
40
X
3
2X
B-III tubulin SMI312 DAPI MERGE
Figura 41. Esempio si fluorescenza di motoneuroni ottenuti da cellule IPs differenziate in laboratorio, sul citoscheletro
delle quali sono state colorate due proteine di interesse, la B-III tubulina e la SMI312 (che marca gli assoni).
131
8.6 Applicazioni della fluorescenza
Una delle proteine fluorescenti più utilizzate è la GFP e delle sue varianti. Questa proteina può essere
utilizzata per marcare un’altra proteina e identificarne la localizzazione; il questo il gene che codifica
per la proteina fluorescente verde può essere fuso all’N- o al C-terminale del cDNA che codifica per
la proteina di interesse. E’ possibile utilizzare il GFP per studiare l’attività di un promotore di nostro
interesse, sotto al quale si pone l’espressione della GFP. I livelli di tale proteina fluorescente saranno
indice di quanto il promotore può essere più o meno attivo. Un’altra applicazione può essere quella
di aggiungere alla proteina GFP una sequenza che ne indirizza la localizzazione in un comparti-mento
particolare (nucleo, membrana, mitocondri, ecc.). in questo modo si può colorare in modo selettivo
quel compartimento e, seguendo la fluorescenza, sarà possibile visualizzare la sua localizzazione.
Figura 42. Esempio di espressione condizionale della proteina GFP. A) embrione transgenico, vivo, di drosophila: l’es-
pressione di GFP è stata messa sotto il controllo di un promotore attivo solo in una serie specializzata di neuroni po-
sizionati appena sotto la superficie dell’animale, che consentono di percepire l’ambiente circostante e che fanno contatti
con altri neuroni non fluorescenti e quindi invisibili. B) La fusione di GFP con un promotore che ne induce l’espressione in
modo ubiquitario ha consentito di ottenere una drosophila, transgenica, viva e fluorescente in tutte le sue parti.
Un altro esempio è quello in cui è stata realizzata una proteina di fusione tra la beta-tubulina e la
GFP. Nel momento in cui si fa esprimere questa proteina chimerica all’interno delle cellule si osserva
la fluorescenza a livello dei microtubuli. Quindi è possibile andare a seguire in vivo la dinamica di
assemblaggio dei microtubuli e la successiva suddivisione delle due cellule, semplicemente andando
ad osservare la fluorescenza emessa di colore verse.
Figura 43. La sintesi di beta-tubulina-GFP porta alla formazione di microtubuli fluorescenti che consentono di osservare in diretta e nella cellula vivente la formazione del fuso mitotico.
Inizio dell’osservazione, tempo 00:00. Tempo 3’.40” dall’inizio dell’osservazione Tempo 5’:08” dall’inizio dell’osservazione
132
Esistono una serie di esempi di fluorescenza legati alla biologia cellulare che si sono sviluppati negli
ultimi anni e che sfruttano la presenza di proteine fluorescenti e la possibilità del loro utilizzo per
seguire delle dinamiche in vivo (in cellule non fissate). Una di queste tecniche è il FRET.
FLUORESCENCE (FORSTER) RESONANCE ENERGY TRANSFER (FRET). E’ un processo in cui
viene trasferita dell’energia da una proteina donatrice ad una accettrice. Il FRET avviene solo se vi è
un’interazione fisica tra donatore ed accettore e se la distanza tra le due molecole è inferiore a 10nm
(sufficientemente vicini). Viene utilizzato per studiare l’interazione molecolare proteina – proteina
oppure proteina – substrato. Affinché si possa effettuare un esperimento di FRET all’interno delle
cellule è necessario avere una coppia di fluorocromi in grado di essere eccitati ad una determinata
lunghezza d’onda e capaci di emettere ad un’altra lunghezza d’onda. Uno dei due fluoro-cromi viene
posto sulla molecola di studio, mentre l’altro fluorocromo sulla molecola di cui si vuole capire se
interagisce o meno con la prima. I due fluorocromi, come già detto, devono:
1. essere sufficientemente vicini (b) in maniera tale che avvenga il trasferimento di energia tra
il primo e il secondo.
2. avere delle caratteristiche tali da garantire che l’energia emessa dal primo fluorocromo
corrisponda all’energia necessaria per eccitare il secondo fluorocromo (con una lunghezza
d’onda maggiore del primo). Nella FRET si utilizza un’unica lunghezza d’onda di eccitazione
(quella del primo fluorocromo) e successivamente si va a rilevare solo il segnale emesso dal
secondo fluoro-cromo. La scelta opportuna della coppia accettore-donatore, in modo tale che
lo spettro di emissione della molecola accettore deve essere sovrapposto a quella della
molecola donatore (a). Nel momento in cui viene eccitato il donatore non deve essere
accettato l’accettore (le due lunghezze d’onda devono essere diverse).
3. avere il corretto orientamento (c) che garantisca il passaggio dell’energia da un fluorocromo
all’altro.
C
B
A
Figura 44. Caratteristiche del FRET.
133
Una delle copie accettore-donatore più utilizzate è la coppia FITC (520nm) – TRICH (550 nm), in cui
le due lunghezze d’onda sono molto vicine (spettro in overlap - intersezione).
Applicazioni della FRET. La FRET consente di studiare:
1. Struttura e conformazione delle proteine;
2. Distribuzione spaziale e assemblaggio di proteine;
3. Interazioni recettore / ligando – utilizzado una coppia di fluorocromi posti ciascuno sulle due
molecole che devono interagire, nel momento in cui le due molecole si trovano vicine tra loro
possono frettare.
4. Test immunologici;
5. Struttura e conformazione degli acidi nucleici;
6. Distribuzione e trasporto dei lipidi;
7. Saggi di fusione di membrana;
8. Rilevamento del potenziale di membrana;
9. Saggi fluorogenici della proteasi;
10. Indicatori per AMP ciclico;
11. Attività proteolitica di un determinato enzima – entrambi i fluorocromi vengono posizionati
vicini sulla stessa molecola che deve essere digerita dall’attività proteolitica. All’inizio si ha il
FRET, nel momento in cui agisce la proteasi i fluorocromi verranno separati e si ha una perdita
di FRET.
12. Cambio conformazionale di determinate molecole – i due fluorocromi vengono aggiunti alla
stessa molecola su due domini differenti, che in condizioni (ad esempio) di assenza di sub-
strato, questi si trovano distanti; qualora si abbia un cambiamento conformazionale, i due
fluorocromi vengono a trovarsi vicini e danno origine a FRET.
Tutte queste applicazioni devono essere tali da permettere l’utilizzo di proteine fluorescenti in vivo
(live-cells) attraverso l’utilizzo di un microscopio confocale. Molto spesso per agevolare lo studio di
proteine in vivo, questi microscopi sono equipaggiati con dei sistemi che garantiscono il mantenimen-
to costante della temperatura (37°C) e dei microincubatori che garantiscono la corretta pressione
della CO2 e la corretta umidità del campione (maggiori condizioni fisiologiche possibili).
FLUORESCENCE RECOVERY AFTER PHOTOBLEACHING (FRAP). Per photo-bleaching si intende
la diminuzione della fluorescenza di un campione dovuta alla degradazione del suo fluoroforo
attraverso un processo irreversibile. La FRAP è una tecnica utilizzata per studiare la mobilità proteica
intracellulare:
1. movimento e la diffusione di molecole e proteine (velocità di diffusione)
2. compartimentalizzazione e lo spostamento da un compartimento intracellulare all’altro;
3. velocità di scambio di molecole e proteine tra un compartimento e l’altro;
4. caratteristiche di legame tra due proteine e l’eventuale effetto di mutazioni o molecole sul
legame stesso.
Il fenomeno alla base di questa tecnica è il photobleaching, in cui a seguito di un’intensa illuminazione
di un determinato fluorocromo si assiste ad un danneggiamento irreversibile del fluorocromo (che
non sarà più in grado di ricevere ed emettere energia luminosa – al microscopio tale regione risulta
nera). Viene registrato nel tempo cosa accade in quella specifica regione da un punto di vista di inten-
134
sità di fluorescenza. Proteine dotate di fluorescenza capaci di muoversi all’interno della cellula sono
in grado di veicolare i loro fluorocromi associati anche nelle zone disattivate irreversibilmente a
seguito del photobleachng. Quindi al microscopio, in talune zone che prima si presentavano nere, è
possibile osservare nuovamente fluorescenza dovuta alle proteine di una zona non colpita da photo-
bleaching che sono in grado di muoversi. È possibile determinare la velocità di diffusione attraverso
la quale una proteina è in grado di ricoprire la zona disattivata. Tale velocità è variabile; infatti a
proteina può raggiungere la zona disattivata in poco tempo così come potrebbe raggiungerla in un
tempo molto più lungo, o talvolta può verificarsi che la fluorescenza non venga più ristabilita per via
della sua mobilità che diviene scarsissima o nulla.
Esiste anche una tecnica complementare alla FRAP nota come iFRAP (i, inverted). In questa tecnica si
fa esattamente l’opposto rispetto al FRAP, ovvero viene mantenuta fluorescente la zona di interesse
e, attraverso bleaching, si disattiva tutto il resto. In questo caso quello che si va a fare è misurare la
perdita di fluorescenza in quella regione per diffusione della proteina verso le zone disattivate.
Passaggi per effettuare il FRAP. Sono i seguenti:
1. selezionare la regione in cui deve essere eseguito il bleaching;
2. ottenere delle immagini che misurino l’intensità di fluorescenza prima del bleaching;
3. effettuare una breve illuminazione della zona esposta ad intensità molto elevata, in modo da
distruggere il fluorocromo in quella regione.
4. registrare il recupero di fluorescenza nella regione disattivata.
FLUORESCENCE LOSS IN PHOTOBLEACHING (FLIP). Un’altra tecnica complemen-tare alla FRAP
che viene utilizzata per studiare il movimento di una determinata proteina da un compartimento ad
un altro e le connessioni tra i vari compartimenti. La tecnica FLIP si differenzia da FRAP e iFRAP perché
è caratterizzata da continui photobleaching della stessa regione, prevenendo cosi il recupero di
fluorescenza. Sostanzialmente vengono selezionate due regioni: la prima regione (quella che in fig 46
B viene indicata con il cerchio) è quella sottoposta a bleaching, e la seconda (indicata con il
rettangolo) adiacente alla prima che non è sottoposta a bleaching ma nella quale si registra. La
A B C
Figura 45. Diversa velocità di diffusione della proteina fluorescente. A seguito del fenomeno di bleaching si può avere: A) una proteina
altamente mobile quando l’intensità di fluorescenza va a zero e successivamente in modo rapido l’intensità di fluorescenza recupera e
ritorna ai livelli iniziali; B) proteina mediamente mobile in cui il recupero di fluorescenza è parziale; C) proteina immobile, quindi dopo il
bleaching non si recupera alcuna fluorescenza.
Inte
nsi
tà d
i flu
ore
scen
za
Tempo di recupero
Inte
nsi
tà d
i flu
ore
scen
za
Inte
nsi
tà d
i flu
ore
scen
za
Tempo di recupero Tempo di recupero
135
regione che viene sottoposta a bleaching, viene mantenuta in illuminazione costante ad alta intensità
in modo tale da disattivare eventuali proteine fluorescenti che transitano in quella regione da un’altra
zona fluorescente. Tale operazione riduce drasticamente l’emissione di fluore-scenza nella seconda
regione (rettangolo).
Figura 46. Differenza fra FRAP (A) e FLIP (B).
Passaggi per effettuare il FLIP. Sono i seguenti:
1. selezionare la regione in cui deve essere eseguito il bleaching;
2. ottenere delle immagini che misurino l’intensità di fluorescenza prima del bleaching;
3. effettuare una serie di cicli ripetuti di illuminazione della regione esposta ad intensità molto
elevata, in modo da distruggere il fluorocromo in quella regione.
4. registrare il calo di fluorescenza in una regione diversa da quella disattivata.
FLUORESCENCE LOCALIZATION AFTER PHOTOBLEACHING (FLAP). Questa tecnica, permette la
localizzazione e la tracciatura di sub-popolazioni che si muovono rapidamente ed anche un periodo
di residenza molto breve. Le biomolecole di interesse sono legate a due marcatori fluorescenti, uno
viene localmente “bleachato”, mentre il secondo rimane intatto e viene usato come riferimento.
136
9. SAGGI SULLE COLTURE CELLULARI
Sono diversi i saggi che possono essere applicati alle colture cellulari, in particolar modo, per determi-
narne la vitalità o la mortalità. Questi saggi possono essere molto utili per studiare la tossicità di un
determinato composto. Altri studi possono riguardare le colture tumorali al fine di andare a monito-
rare dei parametri molto importanti (migrazione, invasione, adesione e la proliferazione cellulare)
per la crescita e lo sviluppo di un tumore, e soprattutto per osservare come un determinato composto
riesce a contrastare tali parametri.
9.1 Saggi di vitalità cellulare
Una serie di test molto importanti sono quelli che consentono di andare a valutare la vitalità di una
coltura cellulare. Questi test sfruttano sostanzialmente tre caratteristiche delle cellule:
1. integrità della membrana;
2. potenziale REDOX;
3. funzionalità mitocondriale.
① INTEGRITA’ DELLA MEMBRANA. I saggi più utilizzati per valutare la vitalità cellulare sono
quelli che sfruttano l‘integrità della membrana, poiché questa è una delle prime strutture che va
incontro a modificazioni nel momento in cui la cellula va incontro a morte necrotica o apoptotica.
Infatti, durante il processo apopotico la membrana cambia la sua permeabilità e la sua composizione
(uno dei primi segnali è rappresentato dall’esposizione della fosfatidilserina sul versante esterno –
che normalmente si trova sul foglietto interno della membrana plasmatica). Uno dei coloranti più
utilizzati in questi saggi è il (1) trypan blue, il quale è in grado di colorare selettivamente le cellule
morte per via della sua scarsa permeabilità all’interno di cellule vive con membrana integra; nel
momento in cui le cellule vanno incontro a morte, cambiando la permeabilità cellulare, ciò rende più
facile anche la permeazione di tale colorante all’interno della cellula (osservabili al microscopio
ottico). Se, attraverso questo colorante, si vanno a contare le cellule vive (rifrangenti) quello che si
esegue è il metodo di esclusione (test di vitalità); mentre la conta delle cellule colorate in blu
determinerà un test sulla mortalità. Prima del test però è necessario fare una conta del numero totale
di cellule e, successiva-mente, bisogna fare il rapporto tra le cellule vive (quelle non colorate sul
totale) e quelle morte (quelle colorate sul totale). Un altro saggio atto a determinare la vitalità
cellulare è quello che utilizza la (2) calceina acetossimetile, un derivato della calceina modificato al
fine di andare ad aumenta-re la sua idrofobicità. La calceina normalmente è molto idrofilica e non è
in grado di attraversare la membrana plasmatica; inoltre in presenza di ioni calcio, questa è in grado
di emettere fluorescenza verde. L’aggiunta del gruppo acetossimetile maschera i siti di legame per il
calcio e quindi, a differenza della calceina, questo composto non è fluorescente. L’aggiunta del com-
posto alla coltura cellulare permette di osservare un comportamento in cui, solamente nelle cellule
vive, saranno presenti degli enzimi (esterasi) in grado di rimuovere il gruppo acetossimetile e portare
la calceina ottenuta a fluorescenza per contatto con gli ioni calcio fisiologicamente presenti in am-
biente cellulare. Per la proprietà sopra elencata, la calceina rimarrà contenuta all’interno della cellula
viva con membrana integra (per via della sua idrofilicità). Un altro test effettuabile sulla permeabilità
137
della membrana riguarda l’uso di una sostanza nota come (3) ioduro di propidio (IP). È un agente
fluorescente e intercalante, in grado di permeare la membrana delle cellule morte (che si presenta
lassa). Dopo aver trattato la coltura con un agente tossico come il perossido di idrogeno che ne causa
la morte delle cellule, lo ioduro di propidio permea all’interno e va a legarsi agli acidi nucleici. Attra-
verso un citofluorimetro è possibile andare ad osservare la fluorescenza (di colore rosso) delle cellule
morte (test di mortalità rapido). I saggi (2) e (3) possono essere eseguiti in combinazione così che da
osservare all’interno dello stesso campione le cellule vive e le cellule morte. Esistono altri coloranti
specifici che servono per colorare le cellule morte e che funzionano come l’IP, con la differenza che
questi non risultano tossici (l’IP è tossico e necessita l’utilizzo di guanti e va maneggiato sotto cappa
chimica). Un altro saggio che può essere utilizzato è quello che prevede il rilascio dell’enzima
citosolico (4) glucosio-6-fosfato deidrogenasi. È l’enzima responsabile della conversione del glucosio
6-fosfato in 6-fosfo-gluconalappone con produzione di NADPH nella via dei pentosi fosfati. Il saggio è
un test di mortalità perché normalmente l’enzima si trova all’interno del citosol però, quando la
cellula muore l’enzima viene rilasciato nel terreno di crescita. Il test prevede l’accoppiamento di due
reazioni diverse: una è quella normalmente sfruttata dall’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi, e
la seconda reazione sfrutta il NADPH prodotto dalla prima reazione per convertire un composto noto
come risazzurrina in resorufina, la quale diviene fluorescente a contatto con un enzima specifico (dia-
forasi). Lo svolgimento del test prevede che venga prelevata un’aliquota del terreno di crescita delle
cellule e lo si mette a contatto con i reagenti necessari per fare avvenire la reazione. In particolare il
terreno di crescita verrà messo a contatto con una soluzione contenente glucosio-6-fosfato, NADP+,
resazurina e l’enzima diaforasi. Qualora sia presente la glucosio-6-fosfato deidrogenasi si ottiene la
reazione descritta in precedenza. Alla fine della reazione sarà possibile misurare la fluorescenza del
campione analizzato, direttamente proporzionale alla quantità di resorufina prodotta, a sua volta
direttamente proporzionale alla quantità di NADPH prodotto e dalla presenza di glucosio-6-fosfato
deidrogenasi che era presente nel terreno e che corrisponde alla quantità di cellule morte presenti
nel campione. Un saggio simile a questo è quello che si basa sul rilascio della (5) lattato deidrogenasi,
anch’esso un enzima citosolico. Le cellule danneggiate o morte rilasciano la lattato deidrogenasi nel
medium di coltura; questo utilizza una reazione che prevede l’utilizzo del cofattore NAD+, il quale
viene convertito in NADH in presenza del substrato (lattato). La reazione viene nuovamente accoppia-
ta con quella ottenuta dalla diaforasi utilizzando questa volta un reagente diverso, un sale di tetra-
zolio, si ottiene la formazione di un prodotto noto come formanzano, che a differenza della resorfina
non è fluorescente ma dà una colorazione blu-violetto. In questo caso non verrà misurata la fluore-
scenza, ma bensì l’assorbanza che è direttamente proporzionale alla quantità di NADH liberata, e
quindi alla quantità di lattato deidrogenasi presente nel medium a cui è attribuita la quantità di cellule
morte (test di mortalità).
② POTENZIALE REDOX. Un test che si basa sul potenziale REDOX, ovvero sull’attività
metabolica della cellula è un test che prende il nome di (1) alamaro blu, è un test sulla vitalità cellulare
che utilizza i composti visti in precedenza, ovvero risazzurrina e resorufina utilizzati non in fluorescenza
ma in assorbanza (perché la risazzurrina oltre ad essere poco fluorescente è un composto blu, mentre
la resorufina oltre che ad essere un composto fluorescente è di colore rosa). Questo saggio sfrutta il
fatto che mettendo a contatto la risazzurrina con le cellule vive in coltura, questa verrà veicolata
all’interno delle cellule dove verrà convertita in resorufina. La conversione è tanto maggiore quanto
138
più le cellule saranno metabolicamente attive. Un altro test molto simile e maggiormente utilizzato,
basato sull’attività metabolica delle cellule è un (2) saggio di tipo colorimetrico con MTT che sfrutta
la capacità degli enzimi mitocondriali (deidrogenasi) di rompere l’anello tetrazolico di una molecola
di MTT (sale tetrazolico solubile di colore giallo che è capace di permeare all’interno delle cellule). Le
cellule vengono incubate a 37°C per un tempo pari a 30 min. Nel momento in cui questo sale viene
convertito dalle deidrogenasi forma un sale (formanzano) che precipita in forma non più solubile e
dona un colorito blu-violetto alle cellule (si tratta di osservare l’assorbanza a 490-500 nm). Per poter
calcolare l’assorbanza le cellule devono essere lisate per aggiunta di isopropanolo e il formanzano
deve essere solubilizzato per avere una colorazione uniforme al fine di consentire una corretta let-
tura. La quantità di formanzano prodotta dipende dal numero di cellule vive in coltura. Esistono diver-
si Sali di tetrazolio che possono essere ridotti da deidrogenasi e da reduttasi a diversi a diversi
formanzani che possono adsorbire a diverse lunghezze d’onda (ad esempio MTS ha una colorazione
che vira di più sull’arancio).
③ FUNZIONALITA’ MITOCONDRIALE. Questi test sfruttano la quantità indiretta di ATP
prodotta dai mitocondri. Un saggio che può essere utilizzato è quello che si basa sulla luminescenza
emessa dal campione, sfruttando l’enzima (1) luciferasi. Tale enzima è in grado di ossidare in presenza
di ATP un composto noto come luciferina ad ossiluciferina, attraverso l’emissione di una radiazione
luminosa misurabile. Maggiore sarà il contenuto di ATP, altrettanto maggiore sarà la quantità di luce
emessa.
9.2 Tecniche per lo studio della genesi tumorale.
Le tecniche per lo studio della tumoregnesi si basano sul comprendere parametri importanti come
migrazione, invasione, adesione e proliferazione cellulare.
Con cancro, si definisce la crescita anormale di un tessuto in cui le cellule tendono a dividersi in
maniera incontrollata e autonoma. Queste divisioni incontrollate portano all’aumento della massa
cellulare in quel determinato punto. Alla massa risultante viene attribuita la definizione di tumore. La
tumoregenesi è un processo che può avvenire spontaneamente e di solito è un processo multi-step,
caratterizzato dall’avvenimento di più di una mutazione a livello di geni che solitamente codificano
per proteine regolatorie del ciclo cellulare. Difficilmente una singola mutazione è sufficiente ad indur-
re a tumoregenesi, ma conferisce un vantaggio qualora vengano ad instaurarsi processi che portano
a mutazioni secondarie all’interno delle stesse cellule.
Genesi del tumore. In laboratorio è possibile andare a studiare tutte le fasi di progressione di
un tumore a partire dallo sviluppo iniziale. Le fasi successive sono importanti invece, perché
permettono di capire gli stadi di metastatizzazione che permettono di trasformare un tumore
primario ad uno secondario. Il processo prevede diversi step tra cui l’invasione da parte delle cellule
tumorali dello stroma, e quindi, il contatto con i vasi sanguigni porta inizialmente alla formazione di
neo-vascolarizzazioni nella zona di sviluppo del tumore (perché gli ammassi di cellule sovrapposti
necessitano di nutrienti). Con il passare del tempo, le cellule tumorali sono in grado di infiltrarsi anche
all’interno del vaso e migrare da un sito primario ad uno secondario. Una volta raggiunto il nuovo
sito, a seconda che abbiano o meno capacità di adesione, possono aderire al vaso e nuovamente
attraversarlo per andare a generare un’altra massa tumorale secondaria. Il processo di metastatizza-
139
zione prevede che la cellula tumorale inizi a staccarsi da quelle vicine con perdita delle giunzioni
cellula-cellula. Successivamente la cellula che si è staccata va ad aderire il più possibile alla matrice
extracellulare allo scopo di degradarla per poterla attraversare per raggiungere il vaso. Il processo di
degradazione della matrice avviene grazie al rilascio di enzimi proteolitici che ne degradano le pro-
teine (in particolar le metallo-proteasi). Una volta liberatasi della matrice, la cellula tumorale è libera
di migrare, obbligata però da un cambio morfologico che fa assumere a questa una maggiore motilità
e una maggiore polarità. Successivamente si assiste ad un completo riarrangiamento del suo cito-
scheletro. La migrazione è un processo che necessita della degradazione della matrice, della polariz-
zazione della cellula e della presenza di segnali che guidano l’iniziale polarizzazione e il suo sposta-
mento. In particolar modo la polarizzazione può essere guidata da segnali di “via” e di “stop”. La
migrazione può avvenire di solito seguendo degli stimoli fisici o chimici; nello specifico si possono
avere due tipi di movimento guidati da un gradiente di concentrazione:
1. chemotassi, che è un movimento che si osserva in direzioni di un gradiente di concentrazione
di un mezzo chimico o fisico che può diffondere;
2. aptotassi, che è un movimento che si osserva in direzioni di un gradiente di concentrazione
di un mezzo (proteina della matrice extracellulare, oppure un recettore che viene espresso
sulla superficie di altre cellule) che non è in grado diffondere.
Entrambi questi fenomeni possono essere studiati e riprodotti in laboratorio. In laboratorio può
essere riprodotta la cosiddetta metastasi sperimentale, in modo tale da poter suddividere tale pro-
cesso nelle varie fasi che lo compongono (migrazione, adesione e infiltrazione) in modo tale da poter
studiare tutti i diversi momenti dell’invasione metastatica, modificare anche uno solo di questi
momenti per poter studiare un composto anti-metastatico.
Saggi di metastasi sperimentale. Possono essere adoperati diversi saggi. Ad esempio la
migrazione può essere studiata attraverso un saggio che prende il nome di (1) camera di Boyden, che
a livello sperimentale consente di studiare i passaggi di adesione, il rilascio delle metallo-proteasi e il
processo di invasione. Permette di valutare il potere metastatico di una linea tumorale. L’utilizzo della
camera di Boyden prevede diversi step:
1. partire da una coltura cellulare trattata con la molecola di interesse della quale si vuole studia-
re la capacità di andare ad interferire o meno con il processo di migrazione;
2. incubare per il tempo necessario;
3. raccogliere le cellule (sospensione cellulare) dopo avere effettuato il trattamento;
4. andare a seminare le cellule all’interno della camera di Boyden;
5. dopo il test contare le cellule che sono state in grado di migrare.
La camera di Boyden è una cameretta molto piccola che ha una dimensione di circa 10 cm. E’
composta da una parte superiore in cui sono presenti dei pozzetti che con-sentono di seminare le
cellule; una parte inferiore in cui sono presenti altri pozzetti per aggiungere eventuale terreno di
crescita (anche con l’aggiunta ad esempio di agenti che favoriscono /sfavoriscono la migrazione) per
poter testare composti diversi creando un gradiente chemotattico per la migrazione. L’incubazione
della camera di Boyden a 37°C per un tempo necessario a far avvenire la migrazione cellulare. La
membrana di policarbonato può essere attraversata qualora queste cellule abbiano un potere
migratorio (si ritrovano sulla faccia inferiore della membrana). Terminato il tempo di incubazione si
utilizza una spatola per poter rimuovere tutte le cellule presenti nella parte superiore, suc-
140
cessivamente si andrà a colorare la membrana di policarbonato utilizzando un colorante capace di
permeare all’interno delle cellule e si procede alla conta (attraverso il microscopio) delle cellule
presenti sulla faccia inferiore della membrana. La conta rappresenterà il numero delle cellule che
hanno migrato. Attraverso il composto che si addiziona al terreno di coltura è possibile testare in
parallelo la capacità migratoria cellulare che questo composto ha di indurre o inibire la migrazione
stessa, sarà paragonata con delle condizioni attese. Un altro test che può essere effettuato per
studiare la capacità invasiva è il (2) test della camera invasione in matrigel, che prevede un trat-
tamento della coltura cellulare con la molecola di interesse per vedere se blocca o favorisce la
migrazione; al seguito del quale si raccolgono le cellule per seminarle all’interno del matrigel. Si
procede con la conta delle cellule che sono in grado di degradare tale matrice e che sono in grado di
fuoriuscire. La camera di invasione è molto semplice e, anche in questo caso, la coltura cellulare viene
trattata con il composto di interesse. Nel momento in cui si deve fare l’esperimento le cellule vanno
staccate e seminate all’interno della camera di invasione. Si può distinguere un sistema a doppia
camera in cui nella parte inferiore viene depositato il matrigel, mentre la parte superiore accoglie la
semina delle cellule in apposito terreno (nel quale è possibile addizionare un agente capace di
attrarre le cellule). Si lascia incubare per il tempo necessario e dopo di che si effettua una colorazione.
Quello che si può osservare, attraverso la conta, sono quelle cellule che sono state in grado di
degradare il matrigel e spostarsi nella parte inferiore. Un altro test che è utile per studiare l’invasione
è il (3) test degli aggregati di matrigel. Si prepara una sospensione di matrigel al quale vengono
direttamente addizionate le cellule. Successivamente si seminano delle gocce di cellule su un vetrino.
È necessario incubare per il tempo necessario; al termine del quale, l’osservazione al microscopio
permette di rilevare diverse situazioni. Una di queste è la formazione di un aggregato compatto di
cellule (che sono rimaste tutte all’interno della goccia e quindi questo le caratterizza per una ridotta
capacità migratoria), oppure un insieme di cellule disseminate (che sono uscite dalla goccia e quindi
presuppone un’elevata capacità migratoria). (4) Il test di elisione cellulare consente invece di stabilire
la capacità di una determinata cultura cellulare tumorale di aderire su un determinato substrato. Si
utilizza una piastra non opportunamente trattata per colture cellulari (sulla quale, normalmente, le
cellule hanno poca capacità adesiva). Sui pozzetti è possibile effettuare un pre-trattamento con vari
composti capaci di aumentare o meno la capacità adesiva delle cellule. Dopo aver effettuato la
semina è necessario mantenere il paragone tra le cellule seminate su un pozzetto trattato con siero,
quelle non trattate (senza il composto X), altre cellule seminate su siero (a parità di rivestimento della
piastra). Le cellule trattate con il composto X sono quelle da tenere in considerazione, che però
devono essere paragonate alle altre due semine per avere risultati attendibili. Al termine dell’incu-
bazione si aspirano le cellule che non sono aderite e si colorano con ematossilina ed eosina quelle
adese al pozzetto. Una volta effettuata la colorazione viene letta l’assorbanza che sarà tanto mag-
giore quanto più cellule adese sono presenti sulla superficie del pozzetto. Il paragone darà un’idea
della capacità del composto X di favorire o sfavorire l’adesione cellulare, al fine di comprendere se
tale composto può essere oggetto di studio come antitumorale.
141
10. La Citofluorimetria
La citofluorimetria (CFM) è una tecnica che consente la misurazione e la caratterizzazione di cellule
sospese in un mezzo fluido. Questa tecnica permette l’analisi di proprietà fisiche o biochimiche
multiple di una singola cellula. Le cellule devono essere trasportate in un flusso laminare fino ad un
punto di in-tersezione in cui verranno eccitate da una sorgente luminosa (laser). L’aspetto
interessante di questa tecnica è quello che la citofluorimetria permette di misurare e di analizzare
un’elevata quantità di eventi (cellule) in tempi brevi; più la velocità di analisi è elevata più è possibile
ottenere dati sulla sospensione cellulare in esame. La citometria a flusso è una tecnologia che misura
simultaneamente e quindi analizza più caratteristiche fisiche di singole particelle, di solito le cellule,
poiché scorrono in un flusso fluido attraverso un raggio di luce. Le proprietà misurate includono la
dimensione relativa di una particella, granularità relativa o complessità interna e relativa intensità di
fluorescenza. Queste caratteristiche sono determinate utilizzando un sistema di accoppiamento
ottico-elettronico che registra come il la cellula o la particella disperde la luce laser incidente ed
emette fluorescenza. La comparsa della citofluorimetria a flusso (CFM) avviene intorno agli anni ‘70,
determinando un veloce ed intenso sviluppo delle tecniche istologiche e citochimiche. Inizialmente
era limitata alla misura di 1-2 parametri: uno per le misure fisiche e l’altro per la fluorescenza. La CFM
portò grande impulso allo studio del sistema immunitario, grazie all’utilizzo di anticorpi monoclonali
marcati con fluore-sceina (FITC). La grande complessità del sistema immunitario e la presenza di
diverse sub-popolazioni stimolarono:
• lo sviluppo di anticorpo monoclonali (MoAb) sempre più specifici;
• la ricerca di nuovi coloranti fluorescenti da coniugare agli anticorpi;
• la creazione di citofluorimetri a flusso multiparametrici.
Anche gli strumenti hanno subito un enorme sviluppo nel corso del tempo avvicinandosi sempre di
più alle varie esigenze di laboratorio e dell’operatore, tant’è che oggi questi non vengono utilizzati
solamente nel campo dell’immunologia ma anche per altre metodiche.
10.1 Citofluorimetro
I citofluorimetri sono costituiti da tre componenti principali.
1. la fluidica:
Il sistema della fluidica trasporta le particelle in un flusso fino al punto in cui queste vengono
colpite ed eccitate con il raggio laser;
2. l’ottica:
Il sistema ottico è costituito da laser per illuminare le particelle nel flusso del campione e tutto
il sistema di filtri ottici per dirigere i segnali luminosi di risultato ai rilevatori appropriati (tale
sistema è in grado di selezionare le lunghezze d’onda dei fluorofori utilizzati per marcare le
cellule in analisi per poi successivamente indirizzarle ai detectors);
3. e l’elettronca:
Il sistema elettronico converte la luce rilevata in segnali elettronici che possono essere
elaborati dal computer. Un parametro che non sempre è presente nei citofluorimetri corri-
142
sponde a quello che è l’equipaggiamento di un sistema di selezione (sorting) degli eventi che
si stanno analizzando che permette di collezionare le cellule, alla fine di tutti i passaggi, in
contenitori appositi e successivamente recuperarle per una futura analisi. In questo caso
l’elettronica svolge un grosso ruolo poiché necessaria per deviare il flusso di ogni singola
particella e indirizzarlo verso il sistema di collezionamento.
Il sistema della fluidica è un sistema centrale del citofluorimetro ed è quello che permette di tras-
portare il campione sino al punto di interrogazione in cui verrà colpito dal laser. Questo sistema è
costituito dal liquido, che è tipico per ogni macchina, ma che di fatto costituisce un tampone salino.
All’interno di questo flusso viene inserito il campione di interesse e attraverso l’effetto di Bernoulli
(fig 47) il campione viene centrato. Questo consente il generarsi di un flusso in cui le particelle
vengono a disporsi in “fila indiana”. Il processo prende il nome di focalizzazione idrodinamica. In
condizioni ottimali viene a formarsi un flusso laminare in cui il mescolamento tra il fluido centrale
(campione) e il fluido presente nel citofluorimetro è assente
Figura 47. La focalizzazione idrodinamica produce un unico flusso di particelle.
Per quanto riguarda l’ottica e i sistemi di detection, la sorgente luminosa è quasi sempre un laser; ma
di fatto per la detection viene utilizzata a fluorescenza emessa in seguito all’eccitazione (con il laser
ad una specifica lunghezza d’onda) di fluorofori presenti all’interno delle cellule. Il citofluorimetro è
in grado di misurare la fluorescenza emessa. I parametri che vengono comunemente utilizzati per
definire la popolazione cellulare in analisi sono due:
1. il forward scatter (FSC) channel, rappresentato dalla luce rilevata da un detector presente sul
lato opposto rispetto alla sorgente laser che è in grado di eccitare le cellule; questo parametro
fornisce informazioni in merito alle dimensioni dell’oggetto che si sta osservando.
2. Il side scattering (SSC) channel, è la misura della luce che diffonde e che viene deviata dall’og-
getto che colpito dal laser, rilevata da un detector posto con un angolo di 90° risetto al laser.
Tutte le fluorescenze che si andranno ad esaminare verranno analizzate con un angolo di
incidenza di 90°C. L’SSC indica quanto la cellula è complessa al suo interno; ogni ostacolo
143
(organello) incontrato al suo interno dal laser determina una deviazione della luce rispetto
alla luce incidente e questa verrà poi captata su un angolo di 90°.
Figura 48. Parametri di detection.
La fluorescenza è quello che ci permette di misurare e di analizzare il campione. È possibile utilizzare
degli anticorpi coniugati con molecole fluorescenti che vanno ad attaccarsi a specifiche proteine
all’interno delle cellule in indagine. Già la misura di parametri di fluorescenza a diverse lunghezze
d’onda in un campione senza marcatura con anticorpi fluorescenti permette di definire una certa
popolazione cellulare. Infatti, alcuni recettori di membrana piuttosto che molecole presenti all’in-
terno delle nostre cellule sono di per sé fluorescenti; quindi è possibile osservare le cellule anche in
assenza si anticorpi fluorescenti e vedere come queste si distribuiscono per capacità di eccitarsi.
Dunque, è possibile definire una sottopopolazione del campione cellulare anche senza nessun tipo di
marcatura. La specificità della misura della fluorescenza di eccitazione è controllata da filtri ottici che,
messi in sequenza, determinano quale lunghezza d’onda si sta osservando. La figura 49 descrive lo
schema di un citofluorimetro moderno. Si può osservare la sorgente luminosa di eccitazione, il FSC
(Forwad Scatter Channel), una serie di lenti, un pinhole e un detector. Andando sul percorso ottico
del SCC (Side Scatter Channel) è possibile osservare una serie di lenti che focalizzano la fluorescenza
che viene emessa a 90°, un pinhole che elimina quelle frequenze luminose non di interesse; e dopo
di che, grazie ai filtri e ad un percorso ottico preciso è possibile far giungere le lunghezze d’onda a
differenti detectors (es. la luce blu viene deviata verso un detector come la luce gialla piuttosto che
un altro). L’utilizzo di filtri che permettono il passaggio di alcune lunghezze d’onda, esattamente come
avviene nella microscopia a fluorescenza ci permette di separare la luce emessa e analizzare i singoli
parametri della cellula di interesse.
Incident Light Source
144
Figura 49. Schema di un citofluorimetro moderno. A sinistra in basso è possibile osservare tre sorgenti laser diretti verso un singolo
punto rappresentato dalla zona dove si allineano le cellule all’interno del flusso con focalizzazione idrodinamica, e il gruppo ottico di
filtri che permettono la detection e la conversione nel sistema elettronico dei segnali emessi.
145
Figura 50. Laser a diverse lunghezze d'onda.
I laser utilizzati sono quelli a diverse lunghezze d’onda (come quelli descritti in fig.50). I laser va ad
eccitare tutto ciò che ha un’emissione con una lunghezza d’onda maggiore. Per cui, se si va ad eccita-
re il campione ad esempio con un laser giallo, tutto ciò che viene eccitato dal laser blu e ultravioletto
non può essere di conseguenza eccitato.
Laser (nm) Filtro di collezione Nome parametro Fluorocromi
488
530/30 BL1 FITC, Alexa Fluor 488, GFP, CFSE
585/40 BL2 PE, PI
615/24 BL3 PI, PE-Texas-Red, PE-Alexa Fluor 610
675/30 BL4 PerCP, PerCP-Cy 5.5, PE-Cy 5, 7-ADD
780/60 BL5 PE-Cy 7
640 670/30 RL1 APC, Alexa Fluor 647
680/60 RL2 APC-Cy 7, Alexa Fluor 700
405
445/45 VL1 Pacific blue, Brillant Violet 421, DAPI
530/30 VL2 AmCyan, Brilliant Violet 510
585/40 VL3 Pacific orange, Brilliant Violet 570
615/24 VL4 Qdot 605, Brilliant Violet 605
675/30 VL5 Qdot 655, Brilliant Violet 650
780/60 VL6 Qdot 800, Brilliant Violet 785
146
Ogni cellula, o particella, che arriva al punto di interrogazione viene eccitata con uno dei tre laser in
successione ed emette della fluorescenza. Tale fluorescenza, lungo tutto il percorso ottico, viene col-
lezionata dai fotomoltiplicatori dei detector e determina un evento, caratterizzato dai seguenti
parametri quali l’altezza del segnale, la larghezza del segnale (ovvero la sua presenza nel tempo) e
l’area. L’evento viene successivamente analizzato attraverso software specifici che permettono di
interpretare i dati del citofluorimetro. Nel nostro campione, però, non sono presenti solo cellule ma
bensì anche detriti cellulari, oppure altre particelle molto piccole che possono falsificare il risultato
dell’analisi. Per cui, a tale scopo, il software imposta un threshold, ovvero una soglia variabile stabilita
dall’operatore e che permette di selezionare soltanto gli eventi che superano tale soglia. Per cui alcuni
eventi verranno ignorati ed altri processati.
Quando gli impulsi vengono generati, la loro quantificazione è necessaria per i segnali di fluorescenza
essere visualizzati su grafici, analizzati e interpretati. La corrente analogica dal PMT è prima digita-
lizzata o suddiviso in fette molto piccole dal convertitore analogico-digitale (ADC). Questo processo
è chiamato "campionamento", e permette di capire quali eventi verranno collezionati e quali ignorati.
Durante tutto il processo di campionamento, le cellule (o le particelle) passano al setaccio davanti al
punto di interrogazione, dove vengono generati dei segnali che verranno collezionati o rigettati. Pr
ogni evento che viene collezionati, i dati vengono visualizzati su una serie di istogrammi e quello che
verrà visualizzato saranno i parametri singoli (area, altezza e larghezza) per ogni singolo evento. A
seconda di come si decide di visualizzare le diverse grandezze (fluorescenze) si ottiene una distribu-
zione di tali eventi su un grafico.
Larghezza
altezza
tempo
Foto
corr
ente
Area soglia
IGNORATO
PROCESSATO
Figura 51. Processamento degli eventi citofluorimetrici.
147
Figura 52. Grafici in cui il SSC si trova sull'asse delle y e il FSC sull'asse delle x. I
software sono in grado di presentare i dati in modo molto differente. Il grafico A
è ti tipo lineare e si può notale che gli eventi sono concentrati sull’estremo
margine sinistro in basso del grafico e questo non permette di distinguere bene
le popolazioni. Allo stesso modo è possibile utilizzare l’intensità di fluorescenza
del SSC e del FSC su scala logaritmica, attraverso cui è possibile distinguere ben
quattro popolazioni differenti per dimensione e per complessità (D).
I dati possono essere rappresentati come dot-plot neri oppure attraverso linee in cui gli eventi sono
rappresentati dall’infittimento di tali linee. Altri esempi sono quelli forniti dai density-plot colorati
dove varia il colore dell’evento in funzione di quanti eventi ci sono in quel singolo punto (che hanno
le stesse caratteristiche). Ovviamente più gli eventi si concentrano in quella regione più questi
assumono il colore rosso. Una considerazione importante quando si eseguono studi sulla fluore-
scenza multicolore è la possibilità di sovrapposizione spettrale tra fluorofori. Perché i fluorofori
utilizzati nella citometria a flusso emettono fotoni di più energie e lunghezze d'onda, un metodo
matematico chiamato la compensazione è stata sviluppata per affrontare la misurazione dei fotoni di
uno fluoroforo in più rivelatori. A causa della natura delle misurazioni mediante citometria a flusso,
l'emissione di particelle viene misurata non in un singolo rivelatore, ma in tutti i rivelatori utilizzati
nell'esperimento. Questo è utile perché il segnale del verde, ad esempio (fig.53), non è solamente
collezionato dal filtro 525/50 ma può essere anche raccolto dal filtro 585/40 che è un filtro che
normalmente viene utilizzato nel rosso, per cui quando viene emessa la frequenza sul verde verrà
emessa anche una piccola quota che riflette sul rosso.
A B
C D
148
Figura 53. Studi multicolore.
Altri esempi in fig.54, rappresentano il modo i dati correlati alle popolazioni potrebbero essere mal
interpretati per via di un segnale rosso che non esiste e come questo può essere corretto con delle
compensazioni. È possibile visualizzare una “scodata” del segnale, in cui queste cellule aumentano di
segnale rosso anche in assenza di segnale verde; nella distribuzione compensata viene sottratta la
quota di segnale verde che viene visualizzato come segnale rosso.
Figura 54. Come si può applicare la compensazione a un campione colorato con anticorpi coniugati a FITC.
A B C
D E F
149
Per fare questo, si utilizzano delle tabelle di compensazione (fig. 55).
10.2 Analisi dei dati
L’analisi dei dati viene fatta analizzando delle popolazioni e andando a contare le cellule che pre-
sentano determinate caratteristiche. Questo viene effettuato rappresentando i dati ottenuti in
istogrammi che rappresentano delle conte e dei valori di intensità. Attraverso l’utilizzo di campioni
negativi e degli opportuni controlli è possibile discriminare le cellule positive o negative. Quindi, è
possibile raggruppare tutte le cellule con una comune caratteristica. Nell’isto-gramma (a parametro
singolo) rappresentato in figura 56 è possibile valutare quante sono le cellule positive alla marcatura
con l’anticorpo CD3 attraverso un gate di riconoscimento (A). L’utilizzo di un controllo di cellule che
non sono state marcate con l’anticorpo CD3, rappresenta il controllo negativo (B) in cui viene
impostato un gate dato dall’intervallo di fluorescenza da 0 fino a 102. Si osserva che nella popolazione
di cellule in studio, il 6!% di queste esprime il recettore CD3 (cellule CD3 positive).
Figura 56. Istogrammi a parametro singolo. A. Cellule all'interno del gate linfocitario sono rappresentati in
un istogramma per valutare l'espressione relativa di CD3. B. La sovrapposizione di una popolazione di
controllo sulla popolazione colorata consente una facile identificazione delle cellule positive.
FITC PE PeCP-Cy5-5
FITC 100 22 1
PE 0,5 100 0,6
PeCP-Cy5-5 0 0 100
Figura 55. Tabelle di compensazione.
Quanto gli altri si riversano
nel FITC (verde)
Quanto il FITC (verde) si
riversa sugli altri.
A B
150
Il caso appena descritto rappresenta un parametro singolo in analisi. Come detto in precedenza, la citoflu-
orimetria è in grado di analizzare più parametri, quindi più fluorescenze nello stesso tempo (ci sono
citofluorimetri che arrivano ad analizzare anche 19 fluorescenze contemporaneamente). Nel caso di fluore-
scenze multiple l’analisi può essere davvero complessa, per cui si ricorre a grafici che sono in grado di analiz-
zare non più di due parametri per volta. Nel caso in figura 57, viene selezionata una popolazione di cellule
(A) i cui successivamente si è valutata la presenza del recettore per il CD19 o per il CD3 (B). E’ possibile
impostare un nuovo sistema di assi cartesiani o gate (C) per distinguere tutte quelle cellule che esprimono
solo il CD19, o solo il CD3, quelle cellule che li esprimo entrambi e quelle che non esprimono nessuno dei
due. Attraverso questi grafici è possibile determinare in che percentuale di cellule esprimono contempo-
raneamente questi due marcatori.
Figura 57. Grafico della densità a due parametri (fluorescenza a due colori). Il sangue intero lisato di globuli
rossi è stato colorato con CD3 A647 e CD19 PE. Le popolazioni relative sono state determinate utilizzando diversi
metodi di gating.
Ovviamente l’analisi può essere fatta a step successivi attraverso l’utilizzo di insiemi (ovvero un raggrup-
pamento di eventi) che hanno caratteristiche comuni di dimensioni, complessità o fluorescenza. Quindi è
possibile andare ad effettuare analisi successive su sottocategorie cellulari. Molto spesso questo è quello che
viene fatto nell’analisi delle cellule del sistema immunitario (fig.58), per cui quello che si osserva è la presenza
di diverse popolazioni che si caratterizzano per dimensione e complessità; ma allo stesso modo è possibile
andare a fare un’analisi della stessa popolazione cellulare introducendo un marcatore per il CD45 che serve
a visualizzare le popolazioni di monociti, granulociti e linfociti. Attraverso un gating su una di queste popola-
zioni è possibile andare a vedere ulteriori sottopopolazioni all’interno di queste cellule che, all’apparenza
sono tutte CD45 positive. L’analisi dei dati permette, attraverso gate o regioni, di andare ad identificare
determinate sotto-popolazioni e quindi, ad esempio, identificare cellule CD3 positive e stabilire quali
sono le CD4 o le CD8 positive all’interno della stessa popolazione cellulare. Questa analisi è valida
anche per i marcatori CD46 e CD28. È possibile identificare, successivamente, quali sono le cellule
effettrici della memoria e quelle T-naive (fig. 59). Queste tecniche sono molto importanti per le
cellule del sistema immunitario; anche se, oggi vengono utilizzate anche per altre applicazioni.
A B C
151
Figura 58. Analisi del sangue intero lisato. A. Grafico densità SSC vs FSC. B. Grafico di fluorescenza SSC vs. CD45 PB.
Figura 59. Gating sequenziale per identificare sottoinsiemi T specifici. Il sangue intero
lyzato di globuli rossi è stato colorato con CD3, CD4, CD8, CD45RA e CD28 in presenza
di ioduro di propidio per rimuovere le cellule morte. La strategia è indicata dalle frecce.
152
10.3 Controlli
Una cosa molto importante quando ci si approccia alla citofluorimetria sono i controlli, che rendono
più facile l’analisi. Una delle prime cose che ci devono essere sempre in citofluorimetria è il controllo
di una popolazione di cellule che non viene marcata con anticorpi fluorescenti. Un altro aspetto che
bisogna tener presente è che gli eventi che si stanno analizzando devono essere necessariamente
singoli; perché può capitare che durante la focalizzazione idrodinamica le cellule non si dispongano
in single cells (fila indiana) ma si raggruppano dando luogo ad eventi che non sono il contributo di
una singola cella ma bensì di due cellule. Questo è quello che viene denominato discriminazione dei
doppietti (eventi doppi) (fig.61). La discriminazione dei doppietti è importante quando si va a sele-
zionare una popolazione di cellule (sorting), oppure quando si fanno le analisi sul DNA perché questo
potrebbe compromettere l’analisi stessa.
Figura 60. Controlli senza macchie. I linfociti non colorati (A) vengono utilizzati per deter-
minare l'autofluorescenza e settare la popolazione negativa che consente la visualizzazione
delle cellule colorate (B).
È molto facile escludere gli eventi che non sono singoli perché basta andare a controllare la po-
polazione di cellule in esame e selezionare un parametro e analizzare la sua altezza per la sua area.
L’altezza e l’area devono essere proporzionali per ottenere una relazione lineare; ovvero un segnale
tanto più ha un’area grande, tanto più è grande la sua altezza. Se si verifica il contrario, vuol dire che
questo ha aumentato la sua area, non tanto perché è aumentata l’intensità del suo picco, ma perché
si è dilatato il tempo (lunghezza del picco). Questa situazione appena descritta caratterizza un evento
doppio.
A B
153
Figura 61. Discriminazione dei doppietti. I doppietti (rosso)
possono essere distinti dalle singole cellule (verde) tracciando
l'altezza FSC rispetto all'area FCS. I doppietti hanno area
aumentata mentre altezza simile al singolo cellule.
10.4 Applicazioni
La prima applicazione per cui è stata sviluppata la citofluorimetria è (1) la determinazione del fenotipo
delle cellule del sistema immunitario, le quali non crescono in adesione ma in sospensione e sono
cellule con la tendenza a non complessare con altre cellule (scarsa interazione cellula-cellula). Queste
cellule sono riccamente provviste di marcatori sulla loro superficie cellulare che servono alle cellule
per le loro funzioni, ma soprattutto che possono essere sfruttati in citofluorimetria per marcare le
sottopopolazioni cellulari, in quanto l’espressione di specifici marker determinano la tipologia cellu-
lare. Ecco che la determinazione dell’immuno-fenotipo per le cellule del sangue vengono utilizzate in
diagnostica per la diagnosi, o per valutare lo sviluppo e la progressione delle patologie. Allo stesso
modo la citofluorimetria viene utilizzate per lo studio di quelli che possono essere degli alterati
pattern di produzione del sistema immunitario e che possono portare all’insorgenza di patologie.
Sono stati sviluppati numerosi anticorpi monoclonali, o anche policlonali, che sono in grado di ricono-
scere queste proteine presenti membrane di queste cellule e, attraverso la successiva definizione di
popolazioni cellulari si può andare ad identificare quelle che sono le possibili componenti del sistema
immunitario in un preparato biologico. La figura 62, rappresenta la distribuzione delle cellule per di-
mensione (FSC) e per complessità (SSC) (A); vengono selezionate delle popolazioni (B) sempre più
ristrette, per cui attraverso marcatori CD3 e CD19 si ha la possibilità di marcare quelle che sono le
cellule B e le cellule, oppure con una marcatura CD10 e CD14 possono essere identificati i granulociti
e i monociti (C). Questo è estremamente importante perché ogni popolazione cellulare ha i propri
marker e le proprie proteine espresse, per cui quello che si può fare è evidenziare una sotto-popola-
zione, dove quello che cambia è semplicemente il parametro della proteina di superficie (di tali
cellule) che si va a valutare.
154
Figura 62. Immunofenotipizzazione del sangue intero. Semplice pannello di immunofenotipizzazione a 4 colori utilizzando CD3, CD19,
CD66b e CD14 a identificare rispettivamente T, B, granulociti e monociti.
Una seconda applicazione nello sviluppo della ricerca è (2) il Cell Sorting, ovvero andare a separare
una popolazione cellulare da un’altra all’interno di una popolazione che vedeva diverse sottopopo-
lazioni al suo interno. La particolarità di questa tecnica è che prevede la separazione fisica di queste
cellule e il loro recupero in opportuni contenitori (provette) in modo tale che queste cellule possano
essere poi utilizzate per applicazioni successive (diagnostico, come l’analisi del trascittoma in una
sottopopolazione; oppure l’amplificazione delle stesse a seguito di una re-coltura).
Ovviamente l’applicazione di questa tecnica è notevolmente sensibile perché non è facile da attuare.
Intanto, se può essere facile identificare e isolare una popolazione, il passaggio tra l’analisi di una
A B C
Figura 63. Cell-Sorting.
155
singola cellula (quindi, il fatto che un laser colpisce una singola cellula in un punto di interrogazione)
a questa deve seguire un sistema che segue e controlla la separazione di queste cellule in due o più
contenitori di recupero (poiché tutto quello che normalmente viene osservato dal citofluorimetro
viene poi buttato via). Subito dopo il punto di interrogazione, vi è un piccolo augello che vibrando ad
una frequenza specifica è in grado di formare delle micro-goccioline, all’interno delle quali si verrà a
trovare non più di un evento (ovvero goccioline in cui non ci saranno cellule, ed altre in cui ci sarà una
sola cellula). Questo però non è sempre vero, nel senso che se non abbiamo una sospensione
unicellulare può capitare che in una gocciolina si ritrovino due cellule attaccate, e non è detto che
due cellule attaccate siano due cellule uguali; per tanto vi è un sistema di rielaborazione del segnale
collezionato dal laser che permette di discriminare se l’evento è singolo o doppio. Allo stesso tempo
se la goccia non si è formata o non ha inglobato un solo evento ma più di uno, questo è altresì un
problema perché non è possibile avere delle gocce con più di un evento al loro interno. Per tanto c’è
tutto un controllo visi-vo che permette di selezionare non solo quelle gocce che contengono l’evento
che si vuole recupera-re (separando dagli scarti), ma è possibile identificare se all’interno della goccia
ci sarà uno, due o tre eventi. In questa maniera è possibile escludere tutte le gocce che non con-
tengono eventi e quelle che contengono più di un evento.
+ -
Cavo di ricarica nell’augello
Le piastre di deflessione
generano un campo elettrico
Traiettoria deflessa
Flusso di sarto
① Punto di interrogazione
ottica e collezione della luce
② partizione del flusso
in goccioline
③ Deviazione delle goccioline
attraverso il campo elettrico
④ le goccioline che non hanno deviato la
loro traiettoria vengono eliminate
Figura 64. Meccanismo di recupero.
156
Il passaggio successivo è quello che prevede la separazione delle cellule e l’indirizzamento verso i
contenitori di raccolta. Il fluido in cui gli eventi vengono trasportati e che successivamente viene rotto
in goccioline, può essere caricato elettricamente attraverso un sistema di piastre. Questo, attraverso
l’applicazione di cariche positive e negative, sono in grado di deflettere la traiettoria della gocciolina
che contiene la cellula e di indirizzarla verso i contenitori di recupero (modificandone la carica),
oppure farla procedere dritto in direzione del contenitore di scarto (senza modificazione di carica).
Questo è un processo molto delicato perché deve essere condotto da un software che più è preciso
più il cell-sorting avviene in modo corretto. Secondo quanto detto, un’applicazione del cell-sorting
può essere quella che riguarda l’isolamento di una popolazione omogenea come cellule staminali e
primarie in neuroni. Si può partire da diversi campioni che potrebbero essere cellule in coltura, cellule
staminali umane, tessuti.
Figura 65. Cloni derivati dalla linea cellulare di controllo.
157
Tutti questi campioni che logicamente contengono tipologie cellulari differenti vengono distrutti in
modo tale che le cellule passino in una soluzione unicellulare che può essere trasfettata, marcata con
anticorpi e analizzata al citofluorimetro. A questo punto, si osserva che queste cellule possono essere
positivi all’es-pressione di una proteina fluorescente, oppure l’espressione di un anticorpo di
selezione. È possibile isolare nuovamente questa popolazione e rimetterla in piastra e utilizzare
applicazioni successive. Una cosa che viene spesso fatta è quella di marcare le cellule in analisi al
citofluorimetro con la proteina fluorescente verde per analizzare ad esempio tutte quelle cellule che
esprimono di più tale proteina fluorescente verde piuttosto che quelle che ne esprimono di meno,
oppure semplicemente per discriminare le cellule positive da quelle negative all’espressione della
proteina. In questo modo è possibile identificare una sottopopolazione e poi applicare tutte quelle
che sono le procedure di analisi genomica, coltura, trapianti, immortalizzazione cellulare, e tutte le
metodiche normalmente utilizzate. Una recente applicazione è quella di utilizzare la citofluorimetria
per selezionare delle cellule staminali pluripotenti indotte che erano state trasfettate e
ingegnerizzate attraverso la tecnica CRISPR-CAS 9 con la proteina fluorescente Dendra-2, una
proteina fotoattivabile che viene convertita dal verde al rosso. La proteina Dendra-2 viene spesso
utilizzata per esaminate il turnover delle proteine dal vivo. Vengono inserite cellule di controllo
(negative, che non erano state trasfettate con i costrutti del Dendra-2) nel citofluorimetro, e
successivamente si osservano le linee cellulari otte-nute, che nel caso della linea cellulare W81 (in
figura 65) presenta due picchi distinti. Il primo picco cade esattamente nella condizione negativa, e il
secondo picco invece è dato dalle cellule Dendra-2 positive. Allo stesso modo sono stati analizzati
altri due cloni, uno esclusivamente negativo (A7) e il secondo totalmente positivo (A19). Nel clone
W81, come visto, vi è la presenza in contemporanea di due popolazioni cellulari differenti, per cui
attraverso il cell-sorting, è possibile isolare la popolazione positiva, fino ad ottenere un risultato simile
a quello del clone A19.
La terza importante applicazione della citofluorimetria è (3) l’analisi del ciclo cellulare soprattutto
nell’ambito della ricerca. L’analisi del ciclo cellulare permette di separare le cellule che sono ferme in
G1, quelle che sono in fase S e quelle in G2. Tutto ciò è possibile grazie all’utilizzo di intercalanti (che
sono basi azotate) come lo ioduro di propidio, oppure bromodeossiuridina BrdU. Rispettivamente
questi due intercalanti vanno a marcare la quantità di DNA (per quanto riguarda lo ioduro di propidio)
oppure incorporati durante la fase S (nel caso della BrdU, in quanto nulceotide). Poco prima di effet-
tuare l’analisi in citofluorimetria, che secondo i protocolli può essere circa 30 min – 1 ora prima, le
cellule vengono fatte crescere in terreno di coltura arricchito con BrdU. Al termine dell’incubazione
le cellule vengono staccate dal medium, processate al fine di marcare con anticorpi fluorescenti la
BrdU e successivamente incubate con ioduro di propidio (allo scopo di valutare la quantità di DNA).
L’analisi del ciclo viene fatta andando a valutare eventualmente due aspetti:
1. la quantità di DNA per la positività allo ioduro di propidio
2. l’internalizzazione della BrdU;
chiaramente le cellule che si trovano in G1 hanno una quantità di DNA inferiore a quelle che si trovano
in G2 (il doppio). Le cellule in fase G1 e G2 sono cellule che durante l’incubazione con BrdU non
proliferavano; di conseguenza la BrdU non si è potuta intercalare all’interno del DNA. Quindi è pos-
sibile andare a vedere, in fase di incubazione, fotografando quante e quali sono le cellule che non
158
hanno incorporato la BrdU, ma che hanno il doppio del DNA quindi in fase di esperimento si tro-
vavano in G2, quelle in fase G1 (con metà del DNA), e quelle in fase S che in fase di duplicazione
stanno incorporando la BrdU. Il segnale dello ioduro di propidio è variabile nelle cellule in fase S,
poiché è legato all’aumento della quantità di DNA, e per tale ragione il segnale è maggiore.
Un’altra applicazione è (4) l’apoptosi, in cui la cictofluorimetria sfrutta il cambiamento della struttura
della membrana cellulare legato a due aspetti in particolare:
1. durante l’apoptosi viene esposta sulla membrana la fosfatidilserina;
2. la membrana cellulare, con la progressione dell’apoptosi, diviene permeabile.
A causa della aumentata permeabilità si sfruttano due possibilità: l’utilizzo dello ioduro di propidio
(marcatore del DNA) che è in grado di permeare all’interno della cellula solo quando lo stato apop-
totico è avanzato; l’altra possibilità sfrutta la capacità dell’annesina V di legare la fosfatidilserina.
L’annessina V viene marcata con un gruppo FITC, lo ioduro di propidio è esso stesso riconosciuto nel
rosso. Quello che si osserva sono tre condizioni diverse:
1. cellule normali, che non hanno nessun tipo di interazione (nessun segnale) né con lo ioduro
di propidio, né con l’annesina V;
2. una fase iniziale di apoptosi, in cui si osserva il segnale dell’annesina V ma non il segnale dello
ioduro di propidio;
3. una fase di apoptosi terminale in cui si osserva sia il segnale dello ioduro di propidio che quello
dell’annesina V.
Figura 66. Test per l'apoptosi cellulare.
Nella figura 67, possiamo osservare come si presenta un esperimento di ioduro di propidio e di
annesina V in un preparato di cellule sane, dove la grande maggioranza delle cellule si trova nel
riquadro in basso, negative sia per lo ioduro di propidio e per l’annesina V. Mentre invece nel riquadro
accanto è una condizione di un dotplot dove le cellule sono andate incontro ad apoptosi, una parte
in fase iniziale ed altre in fase terminale. Lo ioduro di propidio però può essere utilizzato in maniera
più semplice per valutare il livello di mortalità delle cellule.
159
Figura 67. Confronto tra cellule normali e apoptotiche.
A tal proposito è stato fatto un esperimento per valutare la quantità di cellule morte in una coltura
cellulare dopo che le cellule sono state staccate meccanicamente dalla piastra con uno scraper e
attraverso l’utilizzo di tripsina e pbs senza o con calcio e magnesio; dopo aver utilizzato accutase per
facilitare il distacco delle cellule. Allo stesso tempo è stata confrontata la confluenza delle cellule al
60% e al 100%. Da questo esperimento è possibile notare come a seconda del metodo utilizzato per
staccare le cellule dal terreno di crescita queste diventano più o meno positive allo ioduro di propidio.
Man mano che queste muoiono la positività aumenta. Allo stesso modo, lo ioduro d propidio potreb-
be essere utilizzato per valutare la percentuale di mortalità di una linea cellulare che esprime
determinate proteine che potrebbero essere responsabili o meno di una patologia.
Figura 68. Reattività allo ioduro di propidio a seguito del distacco dal terreno di coltura.
La figura 69 raffigura una linea cellulare, la 6HSY5Y, che sono state trasfettate in modo stabile con un
plasmide che esprime una sequenza di poliglutammina. Tale sequenza è responsabile di alcune
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Confluenza 60% Confluenza 100%
Scrper
Spipetta
trips - trips
pbs w/o Ca Mg - trips
accutase
160
patologie neurodegenerative come l’Huntington, atassie spino-cerebellari, o l’atrofia muscolare e
spinale-bubare. Quello che si vuole osservare è che se l’over-espressione del polyQ è in grado di
aumentare la tossicità nella linea cellulare. La popolazione cellulare viene mantenuta uguale nei due
esperimenti. Nelle cellule normali (A) si osservano già due picchi, un picco è dato da cellule che sono
negative (in buono stato) e l’altro picco rappresenta le cellule morte in seguito al metodo utilizzato
per il distacco dalla piastra. Durante l’espressione del polyQ (B) cambia in modo significativo il profilo
di incorporazione dello ioduro di propidio, dove appunto la positività delle cellule passa da 37% a
62%. Dunque l’espressione del polyQ induce la mortalità cellulare.
A
B
Figura 69. Tossicità cellulare da poliglutammina. A cellule normali; B espressione del PolyQ.
Altre applicazioni della citofluorimetria possono essere utilizzate per lo studio di:
1. pathway di segnale come le fosforilazioni;
2. piccole particelle, piuttosto che di cellule;
3. espressione genica (esistono dei kit che sono in grado di riconoscere le molecole di RNA e
attraverso le sonde fluorescenti è possibile dosare e quantificare l’espressione di un trascritto
in una singola cellula);
4. quantificazioni assolute;
5. internalizzazione di particelle.