Εργαστήριο Προστασίας και Αξιοποίησης Αυτοφυών και Ανθοκομικών Ειδών

Δρ. Γεώργιος Τσοκτουρίδης Βιοτεχνολόγος

ΕΛΓΟ - Δήμητρα

ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ

& ΦΥΤΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ

Δημιουργία Γενετικού Μητρώου

Ενδημικών Φυτών με Μοριακούς

Δείκτες

Πέντε Είδη Κυπριακής Μέντας

στην Παγκόσμια Τράπεζα Γενετικών

Δεδομένων NCBI

Τι είναι το Γενετικό Μητρώο;

Είναι η εγγραφή όλων των στοιχείων/πληροφοριών ενός φυτού, μαζί

με τη γενετική ανάλυση του DNA, στην παγκόσμια τράπεζα

γενετικών δεδομένων NCBI. Ταυτόχρονα για το φυτό αυτό

παρέχονται οι αντίστοιχοι μοναδικοί κωδικοί του (π.χ. KM009028,

KM009029 κλπ) και γίνεται παγκοσμίως γνωστό και προσβάσιμο

από όλους.

Οι επίσημες τράπεζες αλληλουχιών, με νομοθετικά κατοχυρωμένη

την ελεύθερη και δημόσια πρόσβαση, είναι τρεις:

GenBank (NIH/NCBI, ΗΠΑ)

EMBL (Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο)

DDBJ (Ιαπωνία)

Τι περιέχει το Γενετικό Μητρώο;

Α. Στοιχεία εγγραφής

Τίτλος

Κωδικός πρόσβασης

Ημερομηνία καταχώρησης

Προέλευση του DNA

Τι περιέχει το Γενετικό Μητρώο;

Β. Την Ταξινόμιση του φυτού

Την παραδοσιακή αναγνώριση και ταξινόμιση

του φυτού από τους συστηματικούς βοτανικούς.

Γενεολογικό δέντρο του φυτού

Με τις αναλύσεις των ακολλουθιών DNA μπορεί

να ταξινομιθεί το φυτό συγκρίνοντάς το με τις

ήδη υπάρχουσες στην τράπεζα γενετικών

δεδομένων

Τι περιέχει το Γενετικό Μητρώο;

Γ. Στοιχεία της ερευνητικής ομάδας

Ονόματα των επιστημόνων που συμμετέχουν

Τίτλος δημοσίευσης

Διεύθυνση ερευνητικού φορέα

Τι περιέχει το Γενετικό Μητρώο;

Δ. Στοιχεία προέλευσης του φυτικού δείγματος

Μοριακός τύπος του DNA

Τοποθέτηση μοριακού δείκτη στο γονιδίωμα

Τοποθεσία συλλογής φυτού (περιοχή, γεωγραφικές συντεταγμένες)

Ημερομηνία συλλογής

Υπεύθυνος συλλογής

Κωδικός φυτού στο φυτώριο του ερευνητικού φορέα

Οποιαδήποτε αποκλειστική πληροφορία, δεσμευτική για το φυτό

Τι περιέχει το Γενετικό Μητρώο;

Ε. Τη Γενετική ενότητα

Ακολλουθία νουκλεοτιδίων DNA για το συγκεκριμένο μοριακό δείκτη

Ακολλουθία αμινοξέων του συγκεκριμένου μοριακού δείκτη (όχι πάντοτε)

Γενετική θέση της ακολλουθίας του DNA μέσα στο γονιδίωμα του φυτού, αποκρυπτογράφηση και περιγραφή των γονιδίων με τις προσβάσεις αναφοράς τους.

Mentha aquatica photosystem II protein D1 (psbA) gene, partial cds; psbA-trnH intergenic spacer, complete sequence; and tRNA-His (trnH) gene, partial sequence; chloroplast GenBank: KM009034.1 FASTA Graphics PopSet Go to: LOCUS KM009034 395 bp DNA linear PLN 22-SEP-2014 DEFINITION Mentha aquatica photosystem II protein D1 (psbA) gene, partial cds; psbA-trnH intergenic spacer, complete sequence; and tRNA-His (trnH) gene, partial sequence; chloroplast. ACCESSION KM009034 VERSION KM009034.1 GI:685431926 KEYWORDS . SOURCE chloroplast Mentha aquatica ORGANISM Mentha aquatica Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae; asterids; lamiids; Lamiales; Lamiaceae; Nepetoideae; Mentheae; Mentha. REFERENCE 1 (bases 1 to 395) AUTHORS Tsoktouridis,G., Stavridou,C., Papachristoforou,T., Kourtelarides,D., Krigas,N., Cook,C.M. and Maloupa,E. TITLE Phylogenetic analysis of 5 Cypriot mints JOURNAL Unpublished

REFERENCE 2 (bases 1 to 395) AUTHORS Tsoktouridis,G. and Stavridou,C. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (13-JUN-2014) Aromatic/Medicinal Plants, Agricultural Research Institute, P.O. Box 22016, NICOSIA, NICOSIA 1516, Cyprus FEATURES Location/Qualifiers source 1..395 /organism="Mentha aquatica" /organelle="plastid:chloroplast" /mol_type="genomic DNA" /isolation_source="Livadi, Akrotiri, (36494550-3831832, 0 a.s.l.)" /specimen_voucher="ARI CYPRUS Akrotiri" /db_xref="taxon:190902" /country="Cyprus" /collection_date="2013" /collected_by="Papachristoforou T., Kourtelarides D. & Stavridou C." gene <1..33 /gene="psbA" CDS <1..33 /gene="psbA" /codon_start=1 /transl_table=11

/product="photosystem II protein D1" /protein_id="AIO08544.1" /db_xref="GI:685431927" /db_xref="CDD:187747" /translation="LAAIEAPTNG" misc_feature 34..344 /note="psbA-trnH intergenic spacer" gene 345..>395 /gene="trnH" tRNA 345..>395 /gene="trnH" /product="tRNA-His" ORIGIN 1 ctagctgcta tcgaagctcc aacaaatggc taagacttgt tcttaatgtg taggagtttt 61 tgaaaataga ctagataaat ataaggagca agaaaccctt tttgataaaa caagaaaggg 121 tttcttgctc ctttattttc ttttcaatta ggagcctttt tctatatttt ctagtagtat 181 tggacttacc tagaattttt ctttccatta cagaataaaa aaagaagata aaaaaacgat 241 ggaaattcca tcttttgttt tacaatttct aaaaaagttg aaattgaaaa ttgctaaagt 301 aaaaaaatat tttaactata attttattta tagtagaggg gcggatgtag ccaagtggat 361 caaggcagtg gattgtgaat ccaccatgcg cgaaa //

Πόσους κωδικούς παρέχονται από την NCBI για κάθε φυτό;

Οι κωδικοί που παρέχονται από την τράπεζα γενετικών

δεδομένων NCBI είναι τόσοι, όσοι είναι οι μοριακοί δείκτες

DNA που έχουν αναλυθεί και κατατεθεί σε αυτήν.

Όσοι περισσότεροι μοριακοί δείκτες εξετάζονται, τόσο πιο

ακριβέστερη η γενετική ανάλυση του φυτού.

Συνήθως γίνεται αλληλούχιση 5-10 μοριακών δεικτών.

Τι είναι ο μοριακός δείκτης DNA;

Οι μοριακοί δείκτες είναι αλληλουχίες DNA που

χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό γειτονικών

αλληλουχιών (γονιδίων) με τις οποίες συγκληρονομούνται.

Επομένως οι μοριακοί δείκτες είναι τα εργαλεία για τον

εντοπισμό της παραλλακτικότητας σε επίπεδο γενετικού

υλικού (DNA) που διαφορετικά δεν θα φαινόταν.

Οι μοριακοί δείκτες που ευρέως χρησιμοποιούνται είναι:

RAPDs, RFLPs, AFLPs, SNPs, VNTR, SSRs, STS, EST,

SSCP, SNP, ASOH, DASH Στοχευμένης γονιδιακής θέσης (περιοχής) DNA, με ανάλυση SNPs

Γιατί πρέπει να δημιουργήσουμε

Γενετικό Μητρώο για κάθε φυτό;

Α. Τα ενδημικά είδη φυτών μιας χώρας έχουν

ανεκτίμητη επιστημονική και οικονομική αξία. Τα

σπουδαιότερα ενδημικά φυτά τείνουν να τα

εκμεταλεύονται εμπορικές εταιρίες ξένων χωρών,

όπου παράνομα τα έχουν μεταφέρει στο

εξωτερικό και τα οικειοποιούνται ως δικά τους.

Γιατί πρέπει να δημιουργήσουμε

Γενετικό Μητρώο για κάθε φυτό;

Β. Πολλά σημαντικά ενδημικά είδη φυτών είναι

σπάνια και τείνουν να εξαφανιστούν από τη

φύση, με αποτέλεσμα να είναι ευκολότερη η

εμπορευματοποίηση και εκμετάλευσή τους από

τρίτους.

Γιατί πρέπει να δημιουργήσουμε

Γενετικό Μητρώο για κάθε φυτό;

Γ. Συμμετοχή στη δημιουργία ενός παγκόσμιου

Γενετικού Μητρώου για όλα ή τα σπουδαιότερα

ενδημικά είδη φυτών όλου του κόσμου, δίνοντας

τη δυνατότητα της άμεσης και ελεύθερης

πρόσβασης πληροφοριών σε όλους. Επίσης

γίνεται γνωστή η καταγωγή και γενετική

ταυτότητα των επικείμενων σημαντικών

ενδημικών φυτών.

Γιατί πρέπει να δημιουργήσουμε

Γενετικό Μητρώο για κάθε φυτό;

Δ. Στην περίπτωση εξαγωγών, οι παραλήπτες θα

γνωρίζουν στο 100% τι φυτά ή τα υποπροϊόντα

τους που θα τους αποσταλούν, παραθέτοντάς

τους, τους αντίστοιχους γενετικούς κωδικούς

του φυτικού είδους.

Ε. Δυνατότητα μοριακής ανίχνευσης νοθευμένων

φυτικών προϊόντων.

Πέντε Είδη Κυπριακής Μέντας

στην Παγκόσμια Τράπεζα

Γενετικών Δεδομένων NCBI

҉ Εξετάστηκαν πέντε κυπριακά είδη μέντας:

Mentha x piperita ,

Mentha pulegium,

Mentha viridis ,

Mentha aquatica

Mentha longifolia

҉ Έντεκα μοριακοί δείκτες DNA επιλέχθηκαν

҉ Έξι μοριακοί δείκτες DNA εξετάστηκαν στο

χλωροπλαστικό DNA και ειδικότερα οι περιοχές των

γονιδίων atpF-atpH, psbK-psbI, rpl16, rpoB, rpoC1,

psbA-trnH

҉ Πέντε μοριακοί δείκτες DNA εξετάστηκαν στο πυρηνικό

DNA και ειδικότερα οι περιοχές των γονιδίων 18S-26S,

PAE, ING2, ITS (ITS1, ITS2, 5.8S) και psbs1

Αποτελέσματα

҉ Οι έξι νουκλεοτιδικές περιοχές του χλωροπλαστικού

DNA εξετάστηκαν επιτυχώς, ενώ από τις πέντε

νουκλεοτιδικές περιοχές του πυρηνικού DNA

εξετάστηκε επιτυχώς μόνο η περιοχή 18S-26S

҉ Από όλους τους μοριακούς δείκτες μόνο

οι psbA-trnH, rpl16 και 18S-26S είναι οι

καταλληλότεροι, γιατί παρουσίασαν διαφορές σε

45, 31 και 57 νουκλεοτιδικές θέσεις αντίστοιχα

҉ Οι κωδικοί πρόσβασης στην παγκόσμια τράπεζα

γενετικών δεδομένων NCBI είναι:

҉ Για τη Mentha x piperita: ΚΜ009028, ΚΜ009033, ΚΜ009038, ΚΜ009043, ΚΜ009047

Για τη M. pulegium: ΚΜ009026, ΚΜ009031, ΚΜ009036, ΚΜ009041, ΚΜ009045

Για τη M. viridis: ΚΜ009027, ΚΜ009032, ΚΜ009037, ΚΜ009042, ΚΜ009046

Για τη M. aquatica: ΚΜ009029, ΚΜ009034, ΚΜ009039, ΚΜ009043, ΚΜ009048

Για τη M. longifolia: ΚΜ009030, ΚΜ009035, ΚΜ009040, ΚΜ009049

Συμπεράσματα

҉ Τέσσερεις μοριακοί δείκτες που εξετάστηκαν δεν

μπόρεσαν να εφαρμοστούν και να δώσουν επιτυχή

αποτελέσματα, ενώ άλλοι τέσσερεις βρέθηκαν να είναι

πολύ συντηρημένοι δίνοντας πολύ μικρές διαφορές για

τα πέντε κυπριακά είδη μέντας που εξετάστηκαν

҉ Οι τρεις μοριακοί δείκτες psbA-trnH, rpl16 και 18S-

26S (από τους 11 που εξετάστηκαν) βρέθηκαν να είναι

αρκετοί για την γενετική ταυτοποίηση/πιστοποίηση των

πέντε κυπριακών ειδών μέντας Mentha x piperita, M.

pulegium, M. viridis, M. aquatica και M. longifolia.

҉ Οι ακολουθίες DNA των παραπάνω κυπριακών ειδών

μέντας είναι καταχωρημένοι πλέον στην παγκόσμια

τράπεζα γενετικών δεδομένων NCBI με κωδικούς

πρόσβασης από KM009026 έως KM009049.

҉ Ο αριθμός των νουκλεοτιδικών διαφορών (μέσα σε

παρένθεση) για κάθε μοριακό δείκτη ξεχωριστά είναι:

atpF-atpH (1), psbK- psbI (6), rpoC1 (1), psbA-trnH

(45), rpoB (5), rpl16 (31) και 18S-26S (57)

҉ Οι γενετικές αυτές ακολουθίες DNA είναι πλέον

γνωστές παγκοσμίως και τα κυπριακά είδη μέντας είναι

πλέον γενετικά συγκρίσιμα με είδη μέντας άλλων

χωρών, έχοντας το πλεονέκτημα την αξιόπιστη

ταυτοποίηση/πιστοποίησή τους.

Εφαρμογή και σπουδαιότητα στον αγρό

Α. Το ΙΓΕ ή εταιρίες διαθέτουν κλωνικά φυτά δυόσμου (αγενώς πολλαπλασιασμένα) στους αγρότες.

Β. Τα παραπάνω κλωνικά φυτά δυόσμου έχουν γενετικό μητρώο με κωδικούς ΚΜ009028, ΚΜ009033, ΚΜ009038, ΚΜ009043, ΚΜ009047

Γ. Σε βάθος ετών ο παραγωγός πολλαπλασιάζει τα φυτά του μόνο με παραφυάδες αγενώς ή αγοράζει νέα φυτά από την εταιρία.

Δ. Μετά από μερικά χρόνια υπάρχει η πιθανότητα υποβάθμισης και εκφύλισης των φυτών της καλλιέργειάς του

Ε. Γίνονται μοριακές αναλύσεις για να βρεθεί η γενετική διάβρωση (εκφυλισμός) των φυτών

ΣΤ. Αν υπάρχουν γενετικές διαφορές με τ ις αλληλουχίες DNA ΚΜ009028, ΚΜ009033, ΚΜ009038, ΚΜ009043, ΚΜ009047 τότε τα φυτά της καλλιέργειας αντικαθιστούνται με νέα από το ΙΓΕ ή από την εταιρία

Z. Ο παραγωγός διαθέτει το δυόσμο στο εξωτερικό, αναφέροντας τη γενετική ταυτότητα του προϊόντος του (ε ίναι κλωνικά φυτά με γενετικό μητρώο στην NCBI ΚΜ009028, ΚΜ009033, ΚΜ009038, ΚΜ009043, ΚΜ009047)

H. Ανίχνευση του δυόσμου από προσμίξεις άλλων ειδών μέντας

Έρευνα στο μέλλον

1. Διατήρηση των σημαντικών κυπριακών ενδημικών φυτών στο ΙΓΕ και δημιουργία Γενετικού Μητρώου

2. Επίσης το ίδιο σε κυπριακές παραδοσιακές ποικιλίες σε οπωροφόρα, κηπευτικά, αμπέλι κλπ.

3. Διατήρηση των παραπάνω ειδών στην ιστοκαλλιέργεια και πολλαπλασιασμό τους, για τη μαζική παραγωγή κλωνικών φυτών.

Έλεγχος από ιούς και άλλα παθογόνα καραντίνας

4. Για πολύ σημαντικά είδη φυτών είναι επιθυμητό να γίνει η αλληλούχιση όλου του γονιδιώματος του χλωροπλαστικού DNA με τη νέα τεχνολογία next generation sequencing.

ΟΜΑΔΑ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ

Δρ. Ελένη Μαλούπα

Δρ. Γεώργιος Τσοκτουρίδης

Δρ. Κατερίνα –Μαργαρίτα Κούκ

Κωνσταντίνα Σταυρίδου, M.Sc.

Δημήτρης Κουρτελαρίδης, M.Sc.

Τάκης Παπαχριστοφόρου

Το Έργο χρηματοδοτήθηκε από το Ινστιτούτο Γεωργικών

Ερευνών, Λευκωσία, Κύπρος