بررسی روش های اندازه آنزیم های محوری گیری

یاکسیدانسیستم آنتی

محمد حسین رومنادانشجوی دکتری اصالح نباتات دانشگاه رازی

تاثیر تنش خشکی بر ویژگی های بیوشیمیایی و فیزیولوژیک

روش هایحالاینبا.دهدافزایشگندمجملهازگیاهانازبسیاریدرراخشکیبهتحملاستتوانستهخوبیبهاخیرقرندرنباتاصالح

مان برزوهزینهپر بسیارمی باشند،محیطیچندآزمون هایبهوابستهومی گیرندبهرهانتخابشاخصعنوانبهعملکردازکهاصالحیسنتی

.اشندبسودمندبسیارآلایدهژنوتیپبهدستیابیدرانتخابشاخصعنوانبهمی توانندفیزیولوژیکوبیوشیمیاییصفات.می باشند

انتخابخشکی،ازاجتنابهمراهبهباالعملکردحفظ.داردزراعیگیاهانمختلفژنوتیپ هايعملکردبامثبتیهمبستگیروزنه ايهدایت

دراختاللموجبروزنه ايهدایتبرتاثیرباآبکمبود.می کندطلبنمایند،تحملروزنه هابستنبدونراآب گیریازاجتنابکهصفاتیبرای

.می شودفتوسنتز

دارندنقشروزنه ایهدایتکنترلدراصلیمکانیسمسه:

اپیدرمازتبخیر-1

آبپتانسیلوهدایتبامرتبطگیاهدربرگآبظاهریوضع-2

تولیدمي گیرند،قرارخشکخاکمعرضدرکهريشه هاييبوسیلهکهاستABA)احتماالا )شیمیاييعالئمبهپاسخدرروزنه هاشدنبسته-3

.می شود

:در سلول های گیاهیROSتولید

باشندمیزیادیتولیدمنابعدارایگیاهیهایسلولدرواکنشگراکسیژنهایگونه.

اساسبر.دارندنقشتنفسفتوسنتزومانندسلولطبیعیمتابولیسمدرآنهاازبرخی

گردی.باشدمیهوازیمتابولیسمارناپذیراجتنابثانویهمحصولیکROSرایج،هایدیدگاه

دآینمیبوجودزیستیغیرهایتنشطیدرکههستندهاییمسیربهمتعلقROSمنابع

glycolateمانندمسیر oxidaseنوریتنفسطیهاپراکسیزومدر.

تولیدمقداررشدطبیعیشرایطتحتROSبرمیکرومول240)باشدمیکمهاسلولدر

.استکلروپالستدرآنپایدارسطحکههیدروژناکسیدپرموالرمیلی0.5یاوثانیه

میسلولدرتنظیمیخودهایمکانیزمشدنشکستهباعثکههاییتنشازبسیاری

پرموالرمیلی15تا5یاوثانیهبرمیکرومول270)میدهندافزایشراROSتولید،شوند

.استکلروپالستدرآنپایدارسطحکههیدروژناکسید

در سلول های گیاهیROSاسکاونجینگ

اسکاونجینگاصلیهایمکانیزمROSدیسموتازاکسیدسوپرشاملگیاهاندر(SOD)،

برایCATیاSOD،APXبین.باشندمی(CAT)کاتاالزو(APX)پراکسیدازآسکوربات

یلم.استبرقرارتعادلهیدروژناکسیدپرواکسیدسوپرهایرادیکالسطحتعیین

،هیدروژنپراکسیدبا(موالرمیلیمقادیربا)CATو(موالرمیکرومقادیربا)APXترکیبی

.دارندقراراسکاونجرآنزیمهایازمتفاوتکالسدودردواینکهاینستدهندهنشان

APXمیزانتعدیلمسئولROSوسیگنالینگبرایCATزیادیکردنبرطرفمسئول

ROSباشدمیتنشطیدر.

در گیاهان ROSمسیر های اصلی اسکاونجینگ شامل

شاخصه های متابولیکی

سیستم آنتی اکسیدانی

آنتی اکسیدان های آنزیمی

SOD

CAT

APX

GR and GPX

etc

آنتی اکسیدان های آنزیمی غیر

AsA

α-Tocopherol

GSH

غیر سیستم آنتی اکسیدانی

تجمعافزایشرادیکال های آزاد

در گیاهان ROSمسیر های اصلی اسکاونجینگ شامل

گیریروش های اندازه فعالیت های آنتی

اکسیدانی

آنزیمیاستخراج عصاره

خردکامالمایعازتدررابرگنمونهگرم0/5ابتداآنزیمی،عصارهاستخراججهت

هاونداخلدروکردهاضافهآنبهرااستخراجبافرلیترمیلی2سپسمی نماییم،

بادقیقه15مدتبهواپیندورفلولهدرراحاصلمخلوط.می کنیمهموژنیزهکامالا چینی

باالییفازآنازپسونمودهسانتریفیوژگرادسانتیدرجه4دمایدرRPM13000دور

بافرلیترمیلي50تهیهبرای.می شودجداآنزیم هافعالیتوپروتئینمیزانقرائتجهت

حلخوبیبهمقطرآبلیترمیلی40درPVPگرم0/05باراتریسگرم0/607استخراج،

بهرامحلولآنازبعدورسانده8بهرامحلولpHکلریدریکاسیدباسپسوکرده

نزیمآوپروتئینگیریعصارهبرایبافراینازورسانیممیلیترمیلی50نهاییحجم

.(شودنگهدارییخچالدربایدمحلولاین)کنیممیاستفادهاکسیدانیآنتیهای

مک کعصاره آنزیمی به تعیین غلظت پروتئین (جهت برآورد فعالیت ویژه)برادفورد روش

کوماکسیرنگاتصالروشاینمبنای.شدانجام(1976)برادفوردروشکمکبهپروتئینغلظتتعیین

گرم01/0مقدارمعرف،تهیهجهت.استپروتئینمولکولبهاسیدیمعرفدرموجودG250بلوبریانت

ومی شودمحلولمغناطیسیهمزنکمکبادرصد96اتانوللیترمیلی5درG250بلوبریانتکوماکسی

همازپسوکردهاضافهفوقمخلوطبهقطرهقطرهرادرصد85فسفریکاسیدلیترمیلی10سپس

غلظتگیریاندازهبرای.می شودرساندهلیترمیلی100بهمقطرآببامحلولنهاییحجمزدن،

لیترمیلی5وکردهرقیقاستخراجبافرلیترمیکرو80درراشدهاستخراجعصارهمیکرولیتر20پروتئین

درآننوریجذبمیزاندقیقه،5گذشتازپسومی کنیمورتکسوافزودهآنبهبلوکوماکسیمعرف

درپروتئینغلظت.شداستفادهبالنکعنوانبهاستخراجبافراز.می شودقرائتنانومتر595موجطول

.آیدمیدستبهاستانداردمنحنیازاستفادهباونمونهجذببهتوجهبانمونه

Bradford

مک کعصاره آنزیمی به تعیین غلظت پروتئین (جهت برآورد فعالیت ویژه)برادفورد روش

آلبومینسرمگرممیلی10ابتدا.گردیداستفادهگاویآلبومینسرمازاستانداردمنحنیرسمجهت

نظردردرصد100محلولعنوانبهمحلولاین).شدحلاستخراجبافرازلیترمیلی10داخلراگاوی

بافرلیترمیلی5بارادرصد100محلولازلیترمیلی5درصد،50محلولساختنبرای.(شودمیگرفته

بافرلیترمیلی5بارادرصد50محلولازلیترمیلی5بعدمرحلهدر.می نماییممخلوطاستخراج

25محلولازلیترمیلی5،درصد12/5محلولساختنبرای.(درصد25محلول)می کنیممخلوطاستخراج

یماستفادهصفرمحلولبرایاستخراجبافرازومی شودمخلوطاستخراجبافرلیترمیلی5بارادرصد

استخراجبافرلیترمیکرو80دروبرداشتهمحلوللیترمیکرو20آزمایشلولههرازبعد،مرحلهدر.نماییم

مخلوطخوبیبهورتکسباومی ریزیمرنگیمعرفلیترمیلی5لوله هاازیکهرداخلدر.شدرقیق

درآننوریجذبمیزانودادهقراراسپکتروفتومتردستگاهداخلدردقیقه5گذشتازبعدومی کنیم

ذخیرهمحلولهایغلظتونوریجذبمقادیربهتوجهباسپس.می شودقرائتنانومتر595موجطول

درصد98زاکمترنبایدمنحنیتبیینضریبکهاستذکرقابل.گرددمیرسماستانداردمنحنیپروتئین

.باشد

اندازه گیري میزان فعالیت كمي آنزيم پراکسیداز

با(1995)ماهليوچانسروشازپراکسیدازآنزيمكميفعالیتمیزانگیرياندازهبراي

اینطتوسگوايكولشدناكسیدمیزاناساسبرگیرياندازه.شداستفادهتغییراتاندكي

(1:4نسبتبه)شدهرقیقآنزیمیعصارهازمیکرولیتر33روشايندر.مي شودانجامآنزيم

موالرمیلی5گوایکول،موالرمیلی13شاملکهپراکسیدازسوبسترایازلیترمیلییکبارا

بهونمودهمخلوطاست(pH=7)پتاسیمفسفاتبافرموالرمیلی50وهیدروژنپراکسید

nmموجطولدرثانیه30فواصلبادقیقهبیستمدت برای.می کنیمقرائتراآنجذب470

50بازیکمونوپتاسیمفسفاتلیترمیلی39پتاسیم،فسفاتبافرلیترمیلی100ساختن

.کنیممیترکیبموالرمیلی50بازیکدیپتاسیمفسفاتلیترمیلی61باراموالرمیلی

اندازه گیري میزان فعالیت كمي آنزيم پراکسیداز

با(1995)ماهليوچانسروشازپراکسیدازآنزيمكميفعالیتمیزانگیرياندازهبراي

اینطتوسگوايكولشدناكسیدمیزاناساسبرگیرياندازه.شداستفادهتغییراتاندكي

(1:4نسبتبه)شدهرقیقآنزیمیعصارهازمیکرولیتر33روشايندر.مي شودانجامآنزيم

موالرمیلی5گوایکول،موالرمیلی13شاملکهپراکسیدازسوبسترایازلیترمیلییکبارا

بهونمودهمخلوطاست(pH=7)پتاسیمفسفاتبافرموالرمیلی50وهیدروژنپراکسید

nmموجطولدرثانیه30فواصلبادقیقهبیستمدت برای.می کنیمقرائتراآنجذب470

50بازیکمونوپتاسیمفسفاتلیترمیلی39پتاسیم،فسفاتبافرلیترمیلی100ساختن

.کنیممیترکیبموالرمیلی50بازیکدیپتاسیمفسفاتلیترمیلی61باراموالرمیلی

اندازه گیري میزان فعالیت كمي آنزيم پراکسیداز

کاملتبدیلزمانعنوانبهنموداردرجذباوجزمانآنزیمیفعالیتمحاسبهبراي

غلظتهبتوجهبا.میشودگرفتهنظردرهیدروژنپراکسیدتجزیهوگوايكولشدناكسید

.نمودمحاسبهراآنزیمیفعالیتمیتوانزمانو

زمانایندرکهاستزمانیجذباوجزمان

.نمیابدافزایشیدیگروشدهحداکثرجذب

𝑈𝑚𝑔 − 1𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 = ℎ𝑦𝑑𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 𝑝𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑑𝑒 𝑚𝑀 ∗ 4 ∗ 4 ∗ 1000

𝑡𝑖𝑚𝑒 max 𝑂𝐷 min 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑝𝑒𝑟 𝑔𝑟 𝑓𝑟𝑒𝑠ℎ 𝑙𝑒𝑎𝑓

سنجش فعالیت آنزیمی سوپراکسید دیسموتاز

اساسبرگیرياندازه.شداستفاده(1971)فريدوويچوبیچامپروشازدیسموتازسوپراکسیدآنزيمكميفعالیتمیزانگیرياندازهبراي

صورتنوردرريبوفالوينحضوردراكسیدسوپرراديكالهايتوسط(NBT)نیتروبلوتترازولیومفتوشیمیاييءاحیاكردنمتوقفدرSODآنزيمتوانايي

رساندهمیکرولیتر200نهاییحجمبهاستخراجمحلولکمکبهاستخراجعصارهازلیترمیکرو50،100،150،200روشایناساسبر.گیردمی

NBT،13میكروموالر75،(pH=7/8)پتاسیمفسفاتبافرمولمیلی50شاملکهدیسموتازسوپراکسیدگیریاندازهمحلوللیترمیلی4بهو

میکرولتر200حاویعصارهبدوننمونهدو.کنیمميمخلوطاست،ريبوفالوينمیكروموالر2وEDTAموالرمیلي0/1متیونین،-الموالرمیلي

نگاهکیتاریدربالنکنمونهولیگرفتهقرارروشناییدرکنترلنمونه.دهیممیقراراستفادهموردبالنکوکنترلعنوانبهرااستخراجبافر

ارهعصکردناضافهازپسونمودنگهداریتیرهظرفدروجداگانهصورتبهبایدرافالوینریبومحلولکهاستذکربهالزم.می شودداشته

اتاقکدردقیقه15مدتبهمخلوطاينواكنشانجامجهت.کنیممیاضافهکیوتبهراآندیسموتازسوپراکسیدگیریاندازهمحلولواستخراج

.کنیممیقرائتnm560موجطولدرآننوريجذبمیزانودادهقراراسپكتروفتومتردستگاهدرراحاصلمحلولسپس.دهیمميقرارنور

Superoxide Dismutase

Beauchamp and Fridovich

سنجش فعالیت آنزیمی سوپراکسید دیسموتاز

𝑈𝑚𝑔 − 1𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 =[𝑂𝐷 𝑎𝑓𝑡𝑒𝑟 𝑙𝑖𝑔ℎ𝑡𝑖𝑛𝑔 − 𝑂𝐷 𝑏𝑒𝑓𝑜𝑟 𝑙𝑖𝑔ℎ𝑡𝑖𝑛𝑔 ] ∗ 4 ∗ 4

[ 𝑂𝐷𝑏𝑙𝑛𝑘 𝑎𝑓𝑡𝑒𝑟 𝑙𝑖𝑔ℎ𝑖𝑛𝑔 − 𝑂𝐷𝑏𝑙𝑛𝑘 𝑏𝑒𝑓𝑜𝑟 𝑙𝑖𝑔ℎ𝑡𝑖𝑛𝑔

2] (𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑝𝑒𝑟 𝑔𝑟 𝑓𝑟𝑒𝑠ℎ 𝑙𝑒𝑎𝑓)

اندازه گیری فعالیت آنزیم کاتاالز

واکنشازروشایندر.گرفتانجامتغییراتکمیبا(1972)سینهاروشکمکبهکاتاالزآنزیمفعالیتاندازه گیری

رنگسبزاسیدپرکرومیکتشکیلوواسطهاستاتکرومیکبهاستیکاسیددرمحلولپتاسیمدی کروماتکاهشی

شدهرقیقآنزیمیعصارهمیکرولیتر500میزانروشاینطبقبر.می شوداستفادهحرارتوپراکسیدهیدروژندرحضور

میکرولیتر500کردناضافهباواکنشوشدهمخلوط(pH=7)موالرمیلی100فسفاتبافرلیترمیلی1با(1:4نسبتبه)

معرفلیترمیلی2ازاستفادهبامعینزمانگذشتازپس.گرددمیآغازموالرمیلی60پراکسیدهیدروژنمحلول

مدتبهجوشآبحمامداخلسرعتبهآزمایشلوله های.می یابدخاتمهواکنش(3:1)استیکاسید:(%5)دیکرومات

باقرائت.می شوندسانتریفیوژدقیقه10مدتبهg1500درنمونه هاسبزرنگتشکیلپسومی شوددادهقراردقیقه15

میزانتعیینجهت.می گیردصورتمحلول هاباالییفازازنانومتر570جذبیموجطولدراسپكتروفتومترازاستفاده

مرسپراکسیدهیدروژنمتفاوتغلظت هایکمکبهاستانداردمنحنیکاتاالز،آنزیمتوسطمصرفیپراکسیدهیدروژن

.شدندتیتردستورالعملطبقوتهیهپراکسیدهیدروژنازموالرمیلی15و2/5،5،7/5،10،12/5محلول های.شد

uMolواحدحسببرآنزیمفعالیتکمیمقدار H2o2 consumed min-1 mg protein-1می شودبیان.

Sinha

(روش دوم)کاتاالز اندازه گیری فعالیت آنزیم

بر . استفاده شد( 1981)براي اندازه گیري میزان غلظت كمي اين آنزيم از روش دهیندزایری میکرو لیتر از عصاره استخراج را با یک میلی لیتر محلول اندازه گ50اساس این روشمیلی مول پراکسید 15و (pH=7)میلی مول بافر فسفات پتاسیم 50کاتاالز که شامل

به مدت یک nm240سپس جذب آن را در طول موج . مخلوط می کنیماست هیدروژن

جزیه یک یک واحد آنزیمی کاتاالز برابر با ت. دقیقه با دستگاه اسپکتوفتومتر می خوانیم.یک دقیقه استدر پراکسید هیدروژن میکرو موالر

کوارتزکووتازحتماقرائتنانومتری240موجطولبهتوجهباباشیدداشتهتوجهیلیخکهروفوقروش(باربیستباالیشاید)بارچندیدنشخصاخودم.شوداستفاده

عدمکهنمیشددیدهجذبسنتتیکبررسیدرروندیولیدادمانجامهستترساده!خودتونباانتخابپس!میدهنشونروفعالیتبرآورددردقت

اندازه گیری فعالیت آنزیم کاتاالز

𝑈𝑚𝑔 − 1𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 = ℎ𝑦𝑑𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 𝑝𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑑𝑒 𝑚𝑀 𝑎𝑡 4 min − ℎ𝑦𝑑𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 𝑝𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑑𝑒 𝑚𝑀 𝑎𝑡 2 𝑚𝑖𝑛 ∗ 4 ∗ 4 ∗ 1000

2 min 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑝𝑒𝑟 𝑔𝑟 𝑓𝑟𝑒𝑠ℎ 𝑙𝑒𝑎𝑓

𝑈𝑚𝑔 − 1𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 = 𝑂𝐷 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 − 𝑂𝐷 𝑏𝑙𝑛𝑘 ∗ 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑜𝑓 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 ∗ 4 ∗ 4 ∗ 1000

𝑡𝑖𝑚𝑒 𝑜𝑓 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 min ∗ ℇ ∗ 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑜𝑓 𝑢𝑠𝑒𝑑 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 𝑎𝑡 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 ∗ 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑝𝑒𝑟 𝑔𝑟 𝑓𝑟𝑒𝑠ℎ 𝑙𝑒𝑎𝑓

ℇ = 26 𝑚𝑀 − 1𝐶𝑀 − 1

:براساس روش سینها

:دهیندزا براساس روش

اندازه گیری میزان فعالیت آنزيم اسکوربیک پراكسیداز

استفاده(100)آساداوناکانوروشازآنزيماينكميغلظتمیزانگیرياندازهبرايمحلوللیترمیلییکبارااستخراجعصارهازلیترمیکرو50روشایناساسبر.شد

پتاسیمفسفاتبافرمولمیلی50شاملکهپراکسیدازاسکوربیکگیریاندازه(7=pH)،0/1مولمیلیEDTA،0/5اسکوربیکاسیدموالرمیلی(ASA)میلی0/15و

موجطولدرراآنجذبسپس.کنیممیمخلوطاست(H2O2)هیدروژنپراکسیدموالرnm290یمیآنزواحدیک.خوانیممیاسپکتوفتومتردستگاهبادقیقهیکمدتازبعد

.استقیقهدیکدراسکوربیکاسیدموالرمیلییکتجزیهبابرابرپراکسیدازاسکوربیک

میباشدیوویموحطولدرکهنانومتری290موجطولبهتوجهباباشیدداشتهتوجهشوداستفادهکوارتزکووتازحتماقرائت

2-Nacano and Asada

اندازه گیری میزان فعالیت آنزيم اسکوربیک پراكسیداز

استفاده(1981)آساداوناکانوروشازآنزيماينكميغلظتمیزانگیرياندازهبراي

محلوللیترمیلییکبارااستخراجعصارهازلیترمیکرو50روشایناساسبر.شد

پتاسیمفسفاتبافرمولمیلی50شاملکهپراکسیدازاسکوربیکگیریاندازه

(7=pH)،0/1مولمیلیEDTA،0/5اسکوربیکاسیدموالرمیلی(ASA)میلی0/15و

موجطولدرراآنجذبسپس.کنیممیمخلوطاست(H2O2)هیدروژنپراکسیدموالر

nm290یمیآنزواحدیک.خوانیممیاسپکتوفتومتردستگاهبادقیقهیکمدتازبعد

.استقیقهدیکدراسکوربیکاسیدموالرمیکرویکتجزیهبابرابرپراکسیدازاسکوربیک

Nacano and Asada

𝑈𝑚𝑔 − 1𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 = 𝑂𝐷 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 − 𝑂𝐷 𝑏𝑙𝑛𝑘 ∗ 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑜𝑓 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 ∗ 4 ∗ 4 ∗ 1000

𝑡𝑖𝑚𝑒 𝑜𝑓 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 min ∗ ℇ ∗ 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑜𝑓 𝑢𝑠𝑒𝑑 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚𝑒 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 𝑎𝑡 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 ∗ 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑝𝑒𝑟 𝑔𝑟 𝑓𝑟𝑒𝑠ℎ 𝑙𝑒𝑎𝑓

ℇ = 2.8 𝑚𝑀 − 1𝐶𝑀 − 1

Alexieva, V., I. Sergiev, S. Mapelli and E. Karanov. 2001. The effect of drought and ultraviolet

radiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant Cell Environ. 24: 1337-1344.

Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantites of protein utilizing the principles of protein dyebinding. Analytical biochemistry,

72: 248-254.

Chance, B. and Maehly, A. C. 1995. Assay of catalase and peroxidase. PP. 764-765 In:

Culowic, S. P., and Kaplan, N. O. (eds). Methods in enzymology Vol. 2. Academic Press. Inc.

New York.

Nakano, Y. and Assada, K. 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific

peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol. 22:867–880.

Sinha, A. K. 1972. Colorimetric assay of catalase. Analytical Biochemistry, 47 (2): 389-394.

Dhindsa, R.S., P. Plumb-Dhindsa and T.A. Thorpe. 1981. Leaf senescence: correlated with

increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation, and decreased levels of

superoxide dismutase and catalase. J. Exp. Bot. 32: 93-101.