ELEKTROFORESISKIMIA ANALISIS LANJUT

PENDIDIKAN KIMIA PPS UNM

PENGERTIAN

PRINSIP PEMISAHAN ELEKTROFORESIS

(Andreas Manz dkk,2010)

Lanjutan.................

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau

molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat

migrasinya dalam sebuah medan listrik. Secara luas teknik

ini diklasifikasikan dalam tiga kelompok yakni

elektroforesis free boundary, elektroforesis wilayah dan

elektroforesis kontinu (Kopkar, 2008).

Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada

interaksi partikel-partikel bermuatan oleh medan listrik.

Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub

positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik

positif akan bergerak kekutub negative (katoda).

Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan

listrik menyebabkan pemisahan pada metode

elktroforesis. (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006)

JENIS-JENIS ELEKTROFORESIS

Tanpa ada pengemban padat atau matriks (Elektroforesis lapisan gerak /

moving boundary)

Misalnya Elektroforesis Tiselius dimana penentuan mobilitas dan titik

isoelektrik suatu protein. Molekul protein yang diselidiki ada diseluruh

larutan dan posisinya sebagai fungsi waktu. Kekurangan dari alat ini

adalah mahal dan pemamfaatan kurang.

Dengan pengemban padat atau matriks seperti:

A. Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah)

B. Elektroforesis Kertas

C. Elektroforesis selulosa asetat

D.Elektroforesis gel

E. Elektroforesis Kapiler

Lanjutan.............A. Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah):

Tujuan dari teknik elektroforesis ini adalah untuk uji kemurnian preparat,

penentuan komponen dalam campuran, penentuan bobot molekul, dan

penentuan perubahan mobilitas atau konformasi.

B. Elektroforesis Kertas :

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas

sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama

ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi

sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung

pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang

digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan

adsorbsivitas zat terlarut.

C. Elektroforesis Tirai (kontinyu):

Elektroforesis kontinu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara

kontinu

lanjutan................

D.Elektroforesis gel

Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar

teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam

hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya

gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran

molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun

dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum

digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning,

sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih

lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang

porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam

nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya

merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida

dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan

poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang

lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari

ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Gambar Elektroforesis Gel

Gel Media

Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam:

Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam

penanda oligonukleotida dan menganalisis

pemanjangan primer.

Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan

rantai DNA yang berukuran besar.

Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk

menyediakan sistem elektroforesis RNA pada Ukuran

Standar (Davis dkk. 1994: 151).

Faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan

analit/DNA

Ukuran molekul DNA.

Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang

tersedia untuk melintasi gel lebih banyak.

Konsentrasi gel.

Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul DNA

sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA berukuran

kecil melewati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah

molekul DNA berukuran besar untuk melintasi gel.

Bentuk Molekul

Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat

melewati gel.

Lanjutan......

Densitas muatan

Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan molekul

dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan per unit

volume molekul.

Pori-pori gel.

Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati gel,

sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul DNA.

Voltase.

Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal

tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.

Larutan buffer.

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga

migrasi DNA akan lebih cepat.

Elektroforesis Kapiler

Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan

untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan

nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler

berisi buffer.Elektroforesis kapiler merupakan pengembangan

konsep elektroforesis konvensional. Konsep dasar elektroforesis

kapiler adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan sebagai

partikel bermuatan (ion), baik bermuatan positif (kation) maupun

bermuatan negatif (anion). Kalau medan listrik diberikan kepada

larutan molekul bermuatan tersebut maka masing-masing ion

bergerak menuju elektroda yang berlawanan muatannya. Kation

menuju katoda sebaliknya anion menuju anoda. Sifat kelistrikan

inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis

(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Diagram Instrumen Elektroforesis Kapiler

APLIKASI GE(produksi amplikasi PCR dari genomic DNA dari jenis starin bakteri Pseudomonas putida)

APLIKASI CE(ANALISIS PEPTIDA)

APLIKASI LAIN ELEKTROFORESIS

Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam

berbagai bidang, misalnya :

Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk

pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik

khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi

dalam mengungkap sebuah kasus.

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis

merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan

keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.

Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada

sebuah DNA.

Lanjutan............. Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk

PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di-

sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan

untuk berbagai macam kegiatan sebagai berikut.

Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens

berbagai genom

DNA Fingerprinting

Mendeteksi kelainan genetik.

Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu

Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan

perlakuan gen

Mempelajari evolusi tingkat molecular

Mengetahui variasi genetik yang ada di alam

Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu.

Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu

Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid

Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN ELEKTROFORESIS KELEBIHAN : Metode pemisahan elektroforesis cukup dengan

peralatan sedrhana, digunakan untuk memisahkan suatu sampel

molekul besar seperti protein, asam nukleat, asam amino dan

karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah dan

sederhana.

KEKURANGAN : Memiliki keterbatasan dalam hal yang efisiensi

yang rendah , waktu pemisahan yang relative lama, dan berlaku

untuk senyawa yang berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya

karena kuat arus searah yang relative rendah, kecepatan

pemisahan tergantung pada penamabahan tegangan listrik yang

searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan

noda hasil pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda

oleh panas yang dihasilkan tegangan listrik searah yang tinggi

sehingga noda-noda hasil pemisahan elektroforesis menjadi tidak

terlalu jelas memisah.