Enzyme và ứng dụng enzyme trong chế biến thực phẩm

Enzyme- chất xúc tác sinh học

• - Laøm giaûm naêng löôïng hoaït hoaù cuûa phaûn öùng, nhöng so vôùi caùc chaát xuùc taùc voâ cô thì enzym coù taùc duïng lôùn hôn nhieàu. Ví duï: neáu duøng acid xuùc taùc cho phaûn öùng thuyû phaân Saccharose thì naêng löôïng hoaït hoaù (Ea) laø 25,6 Kcal/mol, coøn neáu duøng enzyme invectase thì Ea laø 8 Kcal/mol.

• - Enzyme khoâng tham gia vaøo phaûn öùng, khoâng thay ñoåi chieàu phaûn öùng vaø coù taùc duïng laøm taêng toác ñoä cuûa phaûn öùng. Toác ñoä phaûn öùng invectase xuùc taùc nhanh gaáp 2 x 1012 so vôùi xuùc taùc acid.

• - Vôùi moät löôïng nhoû nhöng coù taùc duïng chuyeån hoaù moät löôïng lôùn cô chaát. Ôû enzyme hieäu quaû xuùc taùc cao hôn nhieàu so vôùi chaát xuùc taùc voâ cô. Ví duï: 1g amylase trong 1 giôø coù theå chuyeån hoaù 100 kg tinh boät.

Ứng dụng của enzyme

• Chế biến thực phẩm

• Trong công nghiệp

• Trong y dược học

• Trong mỹ phẩm

• Trong nông nghiệp & Môi trường

Vai trò của chất xúc tác

B Möùc

A Ea naêng

löôïng

∆F C

Chieàu phaûn öùng

Đặc điểm của enzyme

• - Enzyme hoaït ñoäng trong cô theå soáng neân xuùc taùc trong ñieàu kieän sinh lyù cuûa cô theå, nhö nhieät ñoä, aùp suaát, pH moâi tröôøng nheï nhaøng.

• - Do coù baûn chaát laø protein neân enzyme deã bieán tính döôùi caùc taùc nhaân hoaù lyù nhö nhieät ñoä, hoaù chaát, tia böùc xaï.

• - Enzyme coù tính ñaëc hieäu cao, enzyme chæ xuùc taùc cho nhöõng cô chaát nhaát ñònh, nhöõng kieåu phaûn öùng nhaát ñònh.

Cấu tạo của enzyme• - Bản chất enzyme là protein

• - Enzyme moät thaønh phaàn: laø enzyme maø trong thaønh phaàn caáu taïo chæ laø protein ñôn giaûn. Ñaây laø caùc enzyme thuoäc nhoùm enzyme thuyû phaân (hydrolase). Tuy nhieân caùc enzyme trong nhoùm naøy thöôøng coù caùc ion kim loaïi nhö Cu2+, Fe2+, Zn2+, … laøm chaát ñoàng yeáu toá (cofacter)

• - Enzyme hai thaønh phaàn: laø protein phöùc taïp, phaàn protein ñöôïc goïi laø apoenzyme, thaønh phaàn thöù hai khoâng phaûi laø protein goïi laø nhoùm ngoaïi (prosthetic) hay coenzyme. Coenzyme laø caùc phöùc höõu cô, thoâng thöôøng laø daãn suaát cuûa caùc vitamin. Khi hai thaønh phaàn keát hôïp vôùi nhau thì ñöôïc goïi laø enzyme hoaøn chænh (holoenzyme).

• -Thaønh phaàn apoenzyme coù vai troø quyeát ñònh tính ñaëc hieäu cuûa enzyme, laøm taêng hoaït tính xuùc taùc. Coenzyme tröïc tieáp tham gia xuùc taùc vaø taêng ñoä beàn cuûa apoenzyme vôùi caùc taùc nhaân gaây bieán tính.

Vitamin vaø chöùc naêng cuûa vitamin

Vitamin Chöùc naêngThiamine (B1) Tieàn chaát cuûa thiamine pyrophosphate (TPP) laø

coenzyme cuûa phaûn öùng decarboxyl hoaù, thieáu B1 gaây ra beänh teâ phuø.

Riboflavine (B2) Taïo coenzyme FMN (flavin mononucleotide), FAD (flavin dinucleotide), laø caùc coenzyme vaän chuyeån e- cuûa enzyme oxy hoaù khöû dehydrogenase.

Panthothenic acid (B3)

Tieàn chaát cuûa coenzyme A cuûa caùc enzyme trong trao ñoåi lipid, carbohydrate.

Nicotinic acid (B5) Taïo coenzyme NAD (nicotinamide adenin dinucleotide), NADP laø coenzyme cuûa caùc enzyme oxy hoaù dehydrogenase.

Piridoxine (B6) Laø tieàn chaát pyridoxal phosphate, laø coenzyme coù vai troø trong caùc phaûn öùng vaän chuyeån amine vaø dehydrate hoaù trong trao ñoåi axit amin.

Biotin Laø tieàn chaát cuûa coenzyme biocyneFolic acid Vaän chuyeån carbon trong trao ñoåi axit amin vaø axit

amin

Trung tâm hoạt động của enzyme• - Trung taâm hoaït ñoäng laø phaàn cuûa

phaân töû enzyme tröïc tieáp keát hôïp vôùi cô chaát, taïo thaønh vaø chuyeån hoaù phöùc chaát trung gian giöõa enzyme vaø cô chaát.

• - Trung taâm hoaït ñoäng bao goàm nhieàu nhoùm chöùc naêng cuûa axit amin, coenzyme, ion kim loaïi, phaân töû nöôùc lieân keát. Caùc nhoùm chöùc naêng cuûa axit amin (functional groups) thöôøng gaëp trong trung taâm hoaït ñoäng laø –SH cuûa Cysteine, -NH2 cuûa lysine, -COOH cuûa aspartic acid, glutamic acid, nhoùm –OH cuûa Serine, treonine, voøng imidazol cuûa histidine, …

• - Trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme thöôøng coù töø 3-7 nhoùm chöùc naêng. Trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme hai thaønh phaàn bao goàm moät soá nhoùm chöùc naêng cuûa axit amin, nhoùm chöùc naêng cuûa coenzyme vaø moät soá tröôøng hôïp coøn coù caû ion kim loaïi.

• - Nhoùm xuùc taùc: laø nhoùm tröïc tieáp tham gia phaûn öùng keát hôïp vôùi cô chaát bò chuyeån hoaù vaø coenzyme.

• - Nhoùm tieáp xuùc: Keát hôïp vôùi phaàn cô chaát khoâng bò chuyeån hoaù, coù taùc duïng coá ñònh cô chaát.

• - Nhoùm boå trôï: laø nhoùm töông taùc vôùi nhoùm tieáp xuùc vaø xuùc taùc, coá dònh caùc nhoùm naøy ôû vò trí nhaát ñònh ñeå thöïc hieän chöùc naêng xuùc taùc.

Cơ chế xúc tác

• S + E 1 ES 2 ES* 3 EP 4 E + P

S (subtrate): cơ chất

E: Enzyme; ES: Phức chất enzyme-cơ chấtP (product): sản phẩm; EP: Phức chất enzyme- sản phẩm.S*: Cơ chất hoạt hóa

Cơ chế hoạt động của enzyme

• - Giai ñoaïn 1: Cô chaát seõ keát hôïp vaøo trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme, taïo thaønh phöùc chaát enzyme - cô chaát.

• - Giai ñoaïn 2: Khi gaén vaøo trung taâm hoaït ñoäng, cô chaát seõ hình thaønh caùc lieân keát vôùi caùc nhoùm chöùc naêng vaø coenzyme (enzyme hai thaønh phaàn), caùc lieân keát naøy seõ keùo caêng lieân keát caàn chuyeån hoaù cuûa cô chaát, khi ñoù cô chaát trôû thaønh daïng hoaït hoaù (S*).

• - Giai ñoaïn 3: Khi trôû thaønh daïng hoaït hoaù, cuøng vôùi söï bieán ñoåi caáu truùc khoâng gian cuûa phaàn apoenzyme laøm ñöùt lieân keát caàn chuyeån hoaù cuûa cô chaát ñeå taïo thaønh saûn phaåm P. Vôùi enzyme hai thaønh phaàn thì thaønh phaàn coenzyme coù vai troø chuû ñaïo trong chuyeån hoaù S* thaønh saûn phaåm P.

• - Giai ñoaïn 4: Saûn phaåm P seõ giaûi phoùng khoûi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme. Enzyme trôû thaønh traïng thaùi töï do vaø tieáp tuïc gaén vôùi moät cô chaát môùi ñeå chuyeån hoaù.

Cơ chê hoạt động của enzyme

• CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

V = k. [E]

- V: vận tốc của phản ứng

- k: hệ số phụ thuộc

- [E]: nồng độ enzyme

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Vmax . [S]

V = --------------

Km + [S]

- V: vận tốc phản ứng

- Vmax: vận tốc cực đại

- Km: hằng số

- [S]: nồng độ cơ chấtKm [S]

Vmax

Ảnh hưởng của pH

Ảnh hưởng của nhiẹt độ

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa

• Những chất có tác dụng làm tăng vận tốc của phản ứng gọi là chất hoạt hóa. Thông thường là các ion kim loại nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme.

- Cl-: enzyme Amylase

- Zn2+: Peptidase

- Mg2+: ADN polymease

Ảnh hưởng của chất kìm hãm

• Kìm hãm không đặc hiệu

• Kìm hãm đặc hiệu

- Kìm hãm cạnh tranh

- Kìm hãm không cạnh tranh

+ Ức chế cạnh tranh HOOC – CH2 – CH2 – COOH HOOC – CH2 – COOH

Succinic acid Malonic acid.E + I EI I (inhibitors): chất

ức chế

+ Ức chế không cạnh tranh

Hình 3.11. Ảnh hưởng của chất kìm hãm

E + I EI EI + S EIS ( không hoạt động)

Phân loại enzyme

1. Oxidoreductase (enzyme oxy hoá khử)

2. Transferase (enzyme vận chuyển)

3. Hydrolase (enzyme thủy phân)

4. Lyase (enzyme phân cắt)

5. Isomease (enzyme đồng phân hóa)

6. Synthease (enzyme tổng hợp)

Phân loại enzyme

OxidoreductaseAH2 + B Oxidoreductase BH2 + ACaùc Oxidoreducrase chia laøm hai nhoùm: Dehydrogenase hieáu khí (coù oxy) vaø Dehydrogenase yeám khí (khöû hydro).

+ Dehydrogenase hieáu khí (Oxidase)• CH3 – CHO + H2O + O2 Aldehyde Oxidase CH3 – COOH + H2O2• Aldehyde axit acetic

+ Dehydrogenase yeám khí• Ñaây laø caùc enzyme hai thaønh phaàn, coenzyme thöôøng laø

NAD, FAD, NADP, caùc coenzyme naøy laø chaát nhaän hydro.

HOOC-CH2- CH2 -COOH Succinate dehydrogenase HOOC-CH=CH-COOHAxit succinic FAD FADH2 Axit Fumaric

Transferase

AX + B BX + A • + Phospho transferase

• Glucose + ATP Hexose- kinase Glucose-6-phosphate +

ADP • + Amino transferase• Glutamate + Pyruvate Amino transferase Ketoglutaric + Alanin

• + Glycosyl-transferase∀ β-fructose + Glucose-1-phosphate Saccharose + H3PO4

Hydrolase• RR’ + H2O Hydrolase ROH + R’H

• + Peptidehydrolase: laø enzyme xuùc taùc cho phaûn öùng thuyû phaân lieân keát peptide.

• R – CO – NH – R’ + H2O RCOOH + R’NH2.• + Glycoside hydrolase (Glucosidase): laø caùc enzyme thuyû phaân

lieân keát glycoside. Trong haït naûy maàm, trong heä tieâu hoùa hoaëc vi sinh vaät coù heä enzyme amylase ñeå thuûy phaân tinh boät.

• Tinh boät + H2O Amylases Glucose + Dextrin• + Ester hydrolase (esterase): laø caùc enzyme thuyû phaân lieân

keát ester, nhö lipase laø enzyme thuyû phaân lieân keát ester cuûa lipid.

• Triglyceride Lipase Glycerol + axit beùo.• + Phosphatase: laø enzyme thuyû phaân lieân keát ester cuûa

goác phosphate vôùi ñöôøng.Fructose 1,6-diphosphate Phosphatase Fructose -6-phosphate

+ H3PO4

Lyase

• Laø caùc enzyme xuùc taùc cho phaûn öùng phaân caét lieân keát C – C, C – N, C – S, C – O. Khaùc vôùi nhoùm hydrolase laø caùc enzyme naøy phaân caét lieân keát nhöng khoâng caàn coù söï tham gia cuûa nöôùc.

• +Decarboxylase:• laø enzyme xuùc taùc cho phaûn öùng loaïi CO2 ra

khoûi cô chaát.• CH3 – CO – COOH Pyruvatedecarboxylase CH3 – CHO +

CO2 • Pyruvic acid Aldehyde acetic• + Aldolase:• laø caùc enzyme xuùc taùc cho phaûn öùng phaân caét

ñöôøng thaønh 2 phaân töû ñöôøng ngaén hôn.Frutose 1,6 –diphosphate Aldolase Aldehyde 3-P-Glyceric + Dihydroxyaceton-phosphate

Isomerase+ Triosephosphate isomerase:

CHO CH2OHCHOH C = OCH2-O-P CH2-O-P

Aldehyde-3-phospho glyceric Dihydroxyaetone phosphate

+ Mutase: laø caùc enzyme chuyeån nhoùm noäi phaân töû, ví duï: Phosphoglycerate-phosphomutase xuùc taùc cho phaûn öùng:

COOH CH2OH• CHOH Mutase C – O - P• CH2-O-P CH2OH

3-phosphoglyceric acid 2-phosphoglyceric acid

Nguồn thu nhận enzyme

• - Thöïc vaät: urease töø haït ñaäu töông, amylase töø haït nguõ coác naûy maàm, lipase töø haït thaàu daàu, bromelain töø traùi thôm, papain töø nhöïa ñu ñuû, ficin töø nhöïa sung, …

• - Ñoäng vaät: taùch ra töø moâ, taïng cuûa ñoäng vaät nhö pepsin töø daï daøy, enzyme trypsin, chymotrypsin töø tuïy taïng, …

• - Vi sinh vaät: töø caùc chuûng vi khuaån nhö Bacillus, Clostridium, naám Aspergillus, Penicillum, Trichoderma, xaï khuaån Streptomyces. Trong cô theå vi sinh vaät 80 - 90% protein cuûa teá baøo laø enzyme.

Moâi tröôøng nuoâi caáy VSV

Moâi tröôøng nuoâi caáy chìm

(loûng)

Moâi tröôøng nuoâi caáy beà maêt

(raén)

Loïc chaân khoâng hoaëc ly taâm

Chieát ruùt

Saáy phun

Saûn phaåm kyõ thuaät

Keát tuûa Coàn, aceton hoaëc sulphat amon baõo hoøa

Saéc kyù coät

Keát tuûa

Loaïi muoái

Saáy khoâ chaân khoâng Saûn phaåm tinh khieát

ÖÙng duïng cuûa enzyme

• - Trong coâng nghieäp: coâng nghieäp hoùa chaát, coâng nghieäp taåy röûa (Lipase, cellulase), coâng nghieäp thuoäc da, coâng nghieäp deät, xöû lyù moâi tröôøng.

• - Trong cheá bieán thöïc phaåm: cheá bieán rau quaû, cheá bieán thòt, söõa, cheá bieán tinh boät, baùnh keïo, nöôùc giaûi khaùt, bia röôïu.

• - Y döôïc hoïc: chöõa beänh, trôï tieâu hoaù (Pepsin, Trypsin, amylase), saûn xuaát döôïc phaåm (Urease taêng mieãn dòch, choáng vieâm loeùt daï daøy), phaân tích laâm saøng (Urease phaân tích urea trong maùu, nöôùc tieåu, glucooxidase phaân tich glucose trong maùu), chaån ñoaùn beänh, …

• - Noâng nghieäp: -phoøng tröø saâu beänh (chitinase tröø saâu vaø beänh), boå sung thöùc aên chaên nuoâi ñeå taêng hieäu suaát haáp thu, naêng suaát vaät nuoâi.

Đơn vị hoạt tính của enzyme thực phẩm• - Ñôn vò MWU (Modified Wohlgemuth Unit): ñöôïc xaùc

ñònh laø löôïng enzyme caàn thieát ñeå chuyeån hoùa 1 mg tinh boät tan thaønh dextrin trong thôøi gian 30 phuùt trong ñieàu kieän thí nghieäm.

• - Ñôn vò SKB: laø ñôn vò hoaït tính ñöôïc xaùc ñònh theo phöông phaùp cuûa Sandstedt, Kneen vaø Blish ñöôïc xaùc ñònh laø löôïng enzyme caàn thieát ñeå dextrin hoùa hoaøn toaøn 1g β-dextrin thaønh kích thöôùc xaùc ñònh trong thôøi gian 1 giôø döôùi ñieàu kieän thí nghieäm.

• - Ñôn vò GAU (Glucoamylase Unit): laø löôïng enzyme caàn thieát ñeå giaûi phoùng 1 g ñöôøng khöû (reducing sugar) trong 1 giôø döôùi ñieàu kieän thí nghieäm.

• - Ñôn vò DU (Dextrinogene Unit): Laø löôïng enzyme caàn thieát ñeå chuyeån hoùa 1 pound tinh boät thaønh dextrose trong ñieàu kieän thí nghieäm.

• - Ñôn vò NU (Northrop Unit): laø löôïng enzyme caàn thieát ñeå thuûy phaân 40% cô chaát casein trong ñieàu kieän thí nghieäm.

Ưu điểm của enzyme vi sinh vật

- Chuû ñoäng veà nguoàn nguyeân lieäu, VSV là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme để đáp ứng sản xuất công nghiệp.

• - Chu kyø sinh tröôûng ngaén, sinh khoái teá baøo lôùn trong moät thôøi gian ngaén. Tỷ lệ enzyme cao (80-90% protein của tế bào).

• - Coù theå ñieàu khieån toång hôïp thöøa enzyme deã daøng.

• - Nguyeân lieäu reû, giaù thaønh enzyme thaáp.- Hoạt tính enzyme VSV rất mạnh, vượt xa các

enzyme từ nguồn thực vật và động vật.

•

Sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật

+ Quaù trình toång hôïp protein cuõng chia laøm ba giai ñoaïn: - Giai ñoaïn khôûi ñaàu- Giai ñoaïn keùo daøi - Giai ñoaïn keát thuùc.

+ Tröôùc khi böôùc vaøo giai ñoaïn khôûi ñaàu caùc axit amin seõ ñöôïc gaén vaøo caùc tRNA ñeå vaän chuyeån quaù trình naøy ñöôïc xuùc taùc bôûi enzyme aminoacyl-tRNA-synthetase.

Axit amin + tRNA + ATP Aminoacyl-tRNA + AMP + PP.

Giai đoạn khởi đầu

Điều hòa sinh tổng hợp enzyme

• Cơ chế điều hòa bằng cảm ứng cơ chất

• Cơ chế điều hòa kìm hãm ngược (feed back)

• Một số ENZYME Ứng dụng trong CNTP

Amylase• Amylase laø caùc enzyme xuùc taùc cho phaûn öùng thuûy phaân

tinh boät. Amylase raát phoå bieán trong töï nhieân vaø ñöôïc söû duïng roäng raõi trong coâng nghieäp thöïc phaåm.

• Tinh boät α-amylase Dextrin• Dextrin β- amylase Maltose• Dextrin Amyloglucosidase Glucose• Caùc enzyme amylase chia thaønh 2 nhoùm: • - Endoamylases: α- amylase (EC. 3.2.1.1) vaø α-1,4-glucano

hydrolase laø caùc enzyme thuoäc nhoùm endonuclease, chuùng laø caùc enzyme amylase dòch hoùa (liquefying) vaø dextrin hoaù (dextrinogenic) tinh boät.

• - Exoamylases laø caùc enzyme ñöôøng hoùa (saccharifying). β- amylase (E.C. 3.2.1.2) taán coâng tinh boät hoà hoùa (gelatinized starch) vaø dextrin ñeå giaûi phoùng maltose. Enzyme glucoamylase (E.C.3.2.1.3) thuûy phaân lieân keát glycoside, giaûi phoùng glucose töø ñaàu khoâng khöû cuûa tinh boät hoaëc dextrin.

Hoạt động của Amylase

Endoamylase

Exoamylase

α- Amylase• - α- Amylase, β- amylase coù maët trong Malt. Trong coâng nghieäp thöôøng

söû duïng enzyme saûn xuaát töø tuyeán tuïy hoaëc töø moâi tröôøng nuoâi caáy (culture) vi sinh vaät. Caùc amylase coù xuaát xöù khaùc nhau coù pH toái thích, nhieät ñoä toái thích, söï oån ñònh hoaït tính vôùi nhieät khaùc nhau.

• - α- Amylase cuûa vi khuaån thöôøng ñöôïc söû duïng ôû daïng loûng hoaëc daïng boät. Caùc saûn phaåm naøy thöôøng chöùa caû caùc enzyme khaùc nhö proteinase vaø glucanase. α- Amylase cuûa vi khuaån Bacillus amyloliquefaciens coù hoaït tính rieâng (specific activity) raát cao, 500.000 SKB/g protein. α- Amylase cuûa vi khuaån chia laøm hai loaïi laø loaïi thöôøng (standard) vaø loaïi chòu nhieät. Loaïi α- Amylase thöôøng laø saûn phaåm cuûa Bacillus subtilis vaø Bacillus amyloliquefecians. Nhieät ñoä toái thích cuûa 2 loaïi α- Amylase naøy laø 70-850C. Loaïi α- Amylase chòu nhieät coù nguoàn goác töø Bacillus licheniformis, nhieät ñoä toái thích laø 95-105 oC.

• - α- Amylase cuûa naám ñöôïc thu nhaän töø Aspergillus niger vaø Aspergillus oryzae. α- Amylase cuûa naám coù khaû naêng chòu nhieät keùm hôn α- Amylase cuûa vi khuaån, chuùng bò baát hoaït ôû nhieät ñoä tröôùc khi tinh boät bò hoà hoùa. Vì vaäy, α- Amylase cuûa naám thöôøng chæ ñöôïc söû duïng trong coâng nghieäp cheá bieán baùnh mì, baùnh biscut.

Baûng : Caùc loaïi Endoamylases

EnzymeNguoàn Khoaûng pH

(pH optimum)Nhieät ñoä toái thích (Nhieät

ñoä baát hoaït)

Amylase tuyeán tuïy

Tuyeán tuïy heo 5.5 – 8.5(6.0 – 7.0)

40 – 450C(750C)

α- Amylase vi khuaån

Bacillus subtilisB. amyloliquefecian

4.5 – 9.0(6.5 – 7.5)

70 – 85(95)

α- Amylase vi khuaån chòu nhieät

B. lichenniformis

5.8 – 8.0(7.0)

90 – 105(120)

α- Amylase cuûa naám

Aspergillus oryzaeAspergillus niger

4.0 – 7.0(5.0 – 6.0)

55 – 60(80)

α- Amylase Malt Malt luùa maïchMalt luùa mì

3.5 – 7.5(4.5 – 7.0)

60 – 70(85)

β- Amylase

∀ β- Amylase (E.C. 3.2.1.2) coù maët trong haït nguõ coác, ñaäu naønh, khoai lang (sweet potato) thuûy phaân tinh boät amylose giaûi phoùng ñöôøng maltose töø ñaàu khoâng khöû. Ñoái vôùi tinh boät amylopectin quaù trình thuûy phaân naøy seõ döøng laïi caùch vò trí phaân nhaùnh 2-3 goác glucose. β- Amylase coù nhieät ñoä toái thích khoaûng 550C, pH: 5.1 – 5.5. β- amylase thöôøng ñöôïc söû duïng trong saûn xuaát coàn, bia thay theá cho vieäc söû duïng Malt.

Glucoamylase

• -Glucoamylase (E.C. 3.2.1.3) coøn goïi laø amyloglucosidase, thuoäc nhoùm exoamylase. Glucoamylase taán coâng chuoãi tinh boät giaûi phoùng glucose töø ñaàu khoâng khöû. Nhieät ñoä toái thích vaø pH toái thích cuûa glucoamylase phuï thuoäc vaøo nguoàn thu nhaän enzyme naøy. Veà maët lyù thuyeát enzyme naøy coù hieäu suaát thuûy phaân tinh boät 100%. Haàu heát glucoamylase coâng nghieäp ôû daïng loûng vaø ñöôïc oån ñònh vôùi NaCl hoaëc glycerol.

Baûng: Caùc loaïi Glucoamylase

Nguoàn thu nhaän Khoaûng pH(pH toái thích)

Nhieät ñoä toái thích(Nhieät ñoä baát

hoaït)Aspergillus niger 3.0 – 6.0

(4.5 – 5.0)55 – 60

(90)

Aspergillus awamori 2.0 – 7.0(3.0 – 7.0)

55 – 65(85)

Rhizopus niveus 3.0 – 6.0(3.0 – 5.5)

55 – 60(70 – 80)

Cellulase

• + Cellulase laø moät phöùc hôïp enzyme tham gia vaøo phaân huûy cellulose töï nhieân hoaëc daãn suaát cellulose thaønh glucose. Coù 3 loaïi enzyme cellulase laø:

• - Exocellulase hoaëc exobiohydrolase (E.C. 3.2.1. 91): xuùc taùc cho phaûn öùng thuyû phaân cellulose thaønh caùc cellobiose töø ñaàu khoâng khöû. Nguoàn thu nhaän exobiohydrolase chuû yeáu töø naám Trichoderma vaø Aspergillus.

• - Endocellulase hoaëc endoglucanase (E. C. 3.2.1.4): laø enzyme ñöôïc toång hôïp trong nhieàu loaïi naám nhö Aspergillus, Trichoderma, Penicillium vaø vi khuaån. Khoái löôïng phaân töû cuûa chuùng töø 12 000 – 50 000.

• - β- glucosidase hoaëc cellobiase (E.C. 3.2.1.21): thuûy phaân cellobiose vaø cellodextrin thaønh glucose. Enzyme naøy khoâng coù khaû naêng taán coâng cellulose vaø cellodextrin coù khoái löôïng lôùn.

• Böôùc 1 cuûa quaù trình phaân huûy cellulose laø söï thuûy phaân nhöõng vuøng voâ ñònh hình (amorphous regions) treân vi sôïi cellulose bôûi enzyme endoglucanase. Sau khi caùc ñaàu cuoái töï do cuûa sôïi cellulose loä ra seõ laø cô chaát cuûa enzyme exobiohydrolase. Enzyme naøy seõ giaûi phoùng cellobiose töø ñaàu khoâng khöû cuûa chuoãi polysaccharide. Cuoái cuøng enzyme cellobiase seõ thuyû phaân cellobiose thaønh glucose.

• Caùc enzyme cellulase cuûa naám Trichoderma reseei hoaït ñoäng trong khoaûng pH 3-7, nhieät ñoä toái thích laø 400C. Cellulase cuûa naám Aspergillus niger hoaït ñoäng trong khoaûng pH= 4-6 vaø cuûa Penicilium laø pH= 5-8.

Pectinase

• Pectin laø polymer cuûa axit galacturonic vaø methyl ester cuûa chuùng, coù nhieàu trong rau, quaû. Thoâng thöôøng trong nöôùc quaû 60 – 80% nhoùm –COOH cuûa pectin bò ester hoùa. Daïng Pectin tan (soluble pectin) coù khaû naêng lieân keát vôùi nöôùc vaø laáp ñaày khoaûng gian baøo cuûa quaû. Pectin khoâng tan (insoluble pectin) coøn goïi laø protopectin lieân keát vôùi cellulose cuûa thaønh teá baøo.

•

• Coù 2 nhoùm enzyme tham gia vaøo quaù trình phaân huûy pectin:• - Pectin Methylesterase (E.C. 3.1.1.11) thuûy phaân pectin

thaønh axit pectic vaø methanol töø ñaàu khoâng khöû cuûa pectin. Hieäu suaát thuûy phaân cuûa enzyme naøy coù theå ñaït tôùi 98%. Axit pectic coù theå bò taïo gel (gelatinize) khi coù maët cuûa ion Ca2+. Quaù trình naøy ñöôïc söû duïng trong coâng ngheä leân men nöôùc taùo ñeå saûn xuaát röôïu taùo (cider) taïi Phaùp. Pectin Methylesterase ñöôïc thu nhaän töø naám moác (Mold) hoaëc vi khuaån.

• Pectin Methylesterase töø naám moác hoaït ñoäng trong khoaûng pH töø 3-5, cuûa vi khuaån töø 7 – 8. Enzyme Pectin Methylesterase bò baát hoaït ôû nhieät ñoä 800C.

• - Pectin Depolymerase: coù trong thöïc vaät, nhöng trong coâng nghieäp thu nhaän töø moâi tröôøng nuoâi caáy naám moác vaø vi khuaån. Pectin depolymerase laø moät endopectinase thuyû phaân lieân keát α-1,4-glycoside cuûa pectin vaø laøm giaûm nhanh choùng ñoä nhôùt cuûa dung dòch pectin.

• Cheá phaåm pectinase coâng nghieäp thöôøng ôû daïng dung dòch, ñöôïc oån ñònh vôùi NaCl, ñöôøng hoaëc glycerol. Pectinase ôû daïng boät coù caùc chaát phuï gia laø lactose, maltodextrin ñeå oån ñònh hoaït tính.

•

Proteinase

• Nguồn gốc thực vật:

- papain từ nhựa đu đủ

- Bromelain từ nước dứa.

• Nguồn gốc động vật:

- proteinase tuyến tuỵ

- pepsin

- Renin

• Proteinase vi sinh vật

Proteinase tuyeán tuïy

• Hoãn hôïp enzyme thöông maïi quan troïng laø trypsin vaø chymotrypsin ñöôïc thu nhaän töø tuyeán tuïy (Pancreas). Chuùng cuõng chöùa enzyme peptidase, amylase vaø lipase. Enzyme proteinase tuyeán tuïy (Pancreatin) coù pH toái öu trong khoaûng 8.5-9.0, nhieät ñoä toái öu 30 – 400C. Enzyme bò maát hoaøn toaøn hoaït tính ôû nhieät ñoä 900C, pH=6-8. Ion canxi (CaCl2 1 – 2g/lit) vaø noàng ñoä cô chaát cao laø chaát oån ñònh hoaït tính cuûa enzyme proteinase tuyeán tuïy.

•

• 3.4.2. Pepsin• Pepsin (E.C. 3.4.4.1) thu nhaän töø maøng nhaày

cuûa daï daøy heo vaø boø. Pepsin ñöôïc söû duïng toå hôïp vôùi rennet (renin) trong saûn xuaát phomat. pH toái thích laø 2 – 4, nhieät ñoä toái thích 500C.

• 3.4.3. Rennin• Rennin (E.C. 3.4.4.3) ñöôïc thu nhaän töø daï daøy

beâ, laø loaïi enzyme raát ñaëc bieät, coù hoaït tính gaây ñoâng tuï casein cuûa söõa, öùng duïng trong saûn xuaát phomat. Saûn phaåm enzyme thöông maïi ñöôïc oån ñònh trong NaCl. Khi söû duïng vôùi pepsin theo tyû leä 50:50.

•

• 3.4.4. Papain• Papain ñöôïc taùch chieát töø nhöïa muû khoâ cuûa

ñu ñuû (Carica papaya). Caùc daïng papain thoâ hoaëc papain tinh saïch ñöôïc söû duïng ñeå thuûy phaân protein trong coâng nghieäp saûn xuaát baùnh, bia hoaëc ñeå laøm meàm thòt. pH toái thích cuûa papain laø 7 – 8, bò baát hoaït ôû pH < 3.

• 3.4.5. Bromelain• Bromelain (E.C. 3.4.22.5) thu nhaän töø quaû vaø

choài döùa. Saûn phaåm treâ thò tröôøng coù hoaït tính 5000 – 10.000 U/g. Hoaït tính cuûa bromelain khoâng oån ñònh baèng papain.

•

Proteinase vi sinh vaät

• Laø caùc enzyme proteinase thu nhaän töø vi khuaån vaø naám moác. Chuùng khaùc nhau veà hoaït tính, pH, nhieät ñoä toái thích, chaát oån ñònh vaø chaát kìm haõm.

• Proteinase vi khuaån coù hai daïng laø proteinase kieàm (alkaline proteinase) vaø proteinase trung tính (Neutral proteinase).

• - Proteinase kieàm (E.C.3.4.21.14) nhö Subtilisin hoaït ñoäng maïnh trong khoaûng pH töø 7- 11. Trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme naøy coù serin.

• - Proteinase trung tính (E.C.3.4.24.4) laø caùc enzyme chöùa kim loaïi (Metalloenzyme). Caùc enzyme naøy ñöôïc thu nhaän töø B. subtilis, B. thermoproteolyticus vaø Streptomyces griseus. Caùc enzyme naøy thöôøng duøng trong coâng nghieäp bia, nöôùc giaûi khaùt hoaëc coâng nghieäp da.

•

• Proteinase naám moác cuõng coù 3 daïng laø proteinase acid, kieàm vaø trung tính döïa treân pH toái thích cuûa enzyme.

• - Proteinase acid vaø trung tính cuûa naám moác töø Aspergillus ñöôïc söû duïng trong coâng nghieäp saûn xuaát bia, baùnh nöôùng.

• - Proteinase kieàm cuûa naám moác thöôøng ñöôïc söû duïng trong coâng nghieäp thuoäc da.

Lipase

• Lipase (E.C.3.1.1.3) laø nhöõng enzyme thuûy phaân lieân keát ester cuûa triglyceride ôû dung dich huyeàn phuø. Enzyme lipase thuûy phaân lieân keát ester chæ ôû beà maët tieáp xuùc giöõa lipid vaø nöôùc trong heä thoáng khaùc pha. Enzyme lipase coù theå taùch chieát töø nhieàu nguoàn khaùc nhau nhö tuyeán tuïy heo vaø vi sinh vaät.

So saùnh tính chaát cuûa moät soá lipase

Nguoàn thu nhaän

Khoaûng pH hoaït ñoäng

(pH toái thích)

Nhieät ñoä toái thích

pH oån ñònh hoaït tinh

Tuyeán tuïy heo 6.5 – 9.5(7.5 – 8.5)

40 – 50 5.5 – 7.5

Rhizopus species 6.0 – 7.5(7.0)

35 – 40 4.0 – 8.0

Mucor javanicus 5.5 – 8.0(7.0)

40 – 45 4.5 – 6.5

Aspergillus niger 7.5 – 9.0 40 – 50 5.0 – 7.0

Pseudomonas 4.0 -5.0 50 – 60 4.5 – 10

• 3.5.1. Lipase tuyeán tuïy• Lipase tuyeán tuî heo chöùa caû caùc enzyme

khaùc nhö esterase, amylase, proteinase. Vì enzyme lipase chæ hoaït ñoäng ôû beà maët tieáp xuùc giöõa hai pha daàu, môõ vaø pha nöôùc, neân toác ñoä phaûn öùng thuûy phaân cuûa lipase phuï thuoäc vaøo möùc ñoä huyeàn phuø (emulsification) cuûa dung dòch. Ion canxi laø chaát oån ñònh vaø chaát hoaït hoùa cuûa enzyme lipase. Noàng ñoä toái thích laø 0.5g/lit.

• 3.5.2. Lipase thöôïng vò (pregastric)• Lipase coù nguoàn goác ñoäng vaät, töø tuyeán

thöôïng vò cuûa deâ, cöøu vaø beâ. Enzyme naøy xuùc taùc cho phaûn öùng thuyû phaân caùc chuoãi axit beùo ngaén trong söõa vaø ñöôïc öùng duïng trong saûn xuaát phomat coù höông vò ñaëc bieät.

• 3.5.3. Lipase vi sinh vaät• Lipase thöông maïi ñöôïc saûn xuaát baèng caùch

leân men naám (fungi) vaø vi khuaån (bacteria).• - Lipase cuûa naám Aspergillus niger vaø A. oryzae

coù tính ñaëc hieäu vôùi caùc axit beùo maïch daøi vaø maïch ngaén. Khoái löôïng phaân töû töø 20.000 – 25.000, pH toái thích trong khoaûng 4.5 – 6.0.

• - Lipase cuûa Rhizopus coù theå taùch chieát töø nhieàu loaøi thuoäc chi Rhizopus . Khoái löôïng phaân töû laø 43.000, ñieåm ñaúng ñieän (isoelectric point) laø 6.3. pH toái thích laø 5.0 – 7.0, nhieät ñoä toái thích laø 30 – 450C.

• 3.6. Glucose isomerase• Glucose isomease (E.C.5.3.1.18) ñöôïc saûn xuaát

töø nhieàu loaïi vi sinh vaät nhö Bacillus actinoplanes, Arthrobacter vaø Streptomyces. Glucose isomerase xuùc taùc cho phaûn öùng ñoàng phaân hoùa ñöôøng glucose thaønh fructose. ÔÛ pH =6 – 7 hoaït tính enzyme vaãn coù theå duy trì ôû nhieät ñoä 60 – 750C. Magie vaø Coban laø hai ion hoaït hoaù enzyme glucose isomerase. Glucoisomerase töø Actinoplanes coù pHop = 7.0, nhieät ñoä toái thích khoaûng 600C trong söï coù maët cuûa Mg (0.8g MgSO4/lit). Ion Canxi öùc cheá hoaït tính cuûa glucoisomerase.

• Khi söû duïng glucoisomerase coá ñònh (Immobilization enzyme, insoluble enzyme, matrix-bound enzyme), thôøi gian baùn raõ (half life) laø 1200 h, chuyeån hoùa ñöôïc 800 kg glucose/1kg enzyme coá ñònh. Gaàn ñaây, 1 kg glucoisomease coá ñònh coù theå chuyeån hoùa tôùi 22000 kg glucose.

Enzyme cố định (immobilised enzyme)

• Enzyme cố định là gì ?

• Ưu điểm của enzyme cố định

• Các phương pháp cố định enzyme

• Ứng dụng enzyme cố định

Enzyme cố định là gì ?

• Thuaät ngöõ enzym coá ñònh (immobilized enzyme, insoluble enzyme) ñöôïc hieåu laø ñöa nhöõng phaân töû enzym vaøo nhöõng pha rieâng reõ, pha naøy ñöôïc taùch rieâng vôùi pha dung dòch töï do. Pha enzym thöôøng khoâng tan trong nöôùc vaø ñöôïc gaén vôùi nhöõng polyme öa nöôùc coù khoái löôïng phaân töû lôùn.

Pha enzym

• Mosbach vaø Chibata cho raèng caùc chaát xuùc taùc sinh hoïc (biocatalysts) coá ñònh laø caùc enzym, teá baøo hoaëc toå hôïp giöõa chuùng ôû moät traïng thaùi maø cho pheùp söû duïng laïi vaø lieân tuïc.

Ưu điểm của enzyme cố định

• Kỹ thuật cố định enzyme, tế bào là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, trong y dược học bởi kỹ thuật cố định enzyme và tế bào có nhiều ưu điểm nổi bật:

• Enzyme là chế phẩm sinh học đắt tiền, nếu sử dụng ở dạng tự do thì chỉ sử dụng được một lần, khó thu hồi. Ngược lại enzyme và tế bào cố định có thể sử dụng nhiều lần, liên tục trong nhiều ngày, vì vậy rất kinh tế.

- Enzyme và tế bào được cố định ở những pha riêng rẽ, do đó dễ dàng tách khỏi sản phẩm, sản phẩm dễ tinh sạch. Điều này đặc biệt có ý nghĩa khi ứng dụng enzyme cố định trong sản xuất dược phẩm, trong công nghiệp sản xuất hóa chất tinh khiết và trong phân tích.

- Có thể dừng quá trình chuyển hóa ở bất kỳ giai đoạn nào khi cần thiết, chỉ cần tách enzyme cố định ra khỏi cơ chất.

• Khi được cố định trên giá thể, enzyme thường bền vững hơn, hoạt tính ổn định hơn khi có những thay đổi của môi trường như nhiệt độ, pH so với enzyme tự do. Nhờ những liên kết của enzyme với giá thể như liên kết cộng hóa trị, liên kết ion, liên kết hydro và các liên kết yếu khác mà enzyme cố định ít bị biến tính khi môi trường thay đổi. Tế bào cố định thường có tốc độ sinh trưởng mạnh và có mật độ cao hơn so với nuôi cấy tự do.

• Sử dụng chế phẩm enzyme cố định đặc biệt thích hợp với các qui trình công nghệ liên tục, tự động hóa. Enzyme hoặc tế bào cố định được nạp vào các thiết bị phản ứng như cột, tháp với dòng cơ chất đi vào liên tục và đầu ra sẽ là sản phẩm.

Yêu cầu vật liệu cố định enzyme

• Một vật liệu cố định lý tưởng trước hết giá thành phải cạnh tranh được. Yêu cầu này liên quan đến hiệu quả kinh tế của qui trình công nghệ, nhất là khi qui trình đó ứng dụng ở qui mô công nghiệp.

• Vật liệu phải có tính chất cơ lý ổn định, nhờ đó mà vật liệu bền vững trong các điều kiện của qui trình sản xuất công nghiệp như khuấy trộn, áp suất của chiều cao cột, tháp phản ứng.

• Về mặt hóa học vật liệu phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng. Vật liệu phải không độc, không làm mất hoạt tính enzyme và vật liệu không gây ra những phản ứng hấp phụ không đặc hiệu.

• Về mặt sinh học, vật liệu cố định enzyme phải có tính kháng khuẩn cao, ít bị ảnh hưởng bởi sự phân hủy của vi sinh vật. Tính chất này không chỉ liên quan đến mức độ bền vững của vật liệu mà nó còn liên quan đến hoạt tính enzyme và các chất xúc tác sinh học cố định khác.

• Vật liệu phải có độ trương tốt, diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Điều này liên quan đến khả năng cố định enzyme, khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme cố định, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme và số lần tái sử dụng.

• Một vật liệu cố định enzyme lý tưởng có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể dễ dàng tạo hạt, tạo màng, .. .

Các phương pháp cố định enzyme

• Phương pháp cộng hóa trị

• Phương pháp hấp phụ vật lý

• Phương pháp nhốt

• Phương pháp liên kết ion

Phương pháp cộng hóa trị

• Enzyme cố định bằng phương pháp cộng hóa trị có những ưu điểm sau:

• Do liên kết chặt chẽ với vật liệu cố định bằng liên kết cộng hóa trị, nên enzyme không bị ly giải trong suốt quá trình sử dụng.

• Enzyme có thể dễ dàng tiếp xúc với cơ chất vì enzyme thường được gắn trên bề mặt vật liệu cố định.

• Do liên kết chặt chẽ với vật liệu cố định nên enzyme tăng khả năng ổn định với sự thay đổi của nhiệt độ.

Nhược điểm của pp cộng hóa trị

• Cấu trúc hoạt động của enzyme có thể bị thay đổi bởi quá trình liên kết, do đó enzyme có thể bị mất hoạt tính.

• Do liên kết chặt chẽ giữa enzyme và vật liệu cố định đã cản trở hoạt động của phân tử enzyme, làm giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, kết quả là làm giảm hoạt tính enzyme cố định.

• Những điều kiện tối thích cho enzyme cố định thường bị thay đổi so với enzyme tự do và khó xác định.

• Vật liệu cố định không tái sử dụng lại được, vì vậy phương pháp này chỉ thích hợp với những enzyme đắt tiền và ổn định hoạt tính khi cố định. Vì những nhược điểm trên mà phương pháp này thường được ứng dụng cho cố định những enzyme với mục đích phân tích.