TÉCNICA DE BIOLOGÍA MOLECULAR.

SOUTHERN BLOT

Universidad De Santander

INTEGRANTESSilvia Pérez

Marcela J. chaustreLeydi RincónCielo Ramirez

Presentado a:Henrry Bautista Amorocho

Docente – Biologia Molecular

Edwin Southern

Sir Edwin Mellor Southern.

Nació el 07 de junio 1938 en Burnley , Lancashire y fue educado en Burnley Grammar School.

Premiado por la invención de la transferencia de Southern.

Fue conocido durante muchos años.Esta técnica se implemento por primera ves en los años 1950 y 1960 en diversos tipos de estudios de hibridación de ácidos nucleídos.

En la década de 1970 se empezaron a implementar los métodos de electroforesis en gel Permiten la separación de los fragmentos de ADN según su tamaño.

Metodología Original Del Southern Blot

Un gel de electroforesis de agarosa, se coloca en un papel de filtro, se forma una conexión entre el gel y un depósito de tampón de alta salinidad. La membrana de nitrocelulosa se coloca en la parte superior del gel y se cubre con una torre de toallas de papel que se mantienen en su lugar con un peso. la memoria intermedia pasa a través del gel y los fragmentos de ADN se obtienen en la membrana.

Southern Blot

Principio de la técnica

Pasos de la técnica

ADN digerido con enzima de restricción.Fragmentos son separados por tamaños Electroforesis en gel.

Mecanismo de acción de la enzima

Rompe el ADN en la secuencia GGCC.

Corte entre 2 y 3 nucleótido. (G y C).

El ADNt conocido como fragmentos de restricción.

HaeIII corta las cadenas de ADN en la misma localización .

La desnaturalización caliente ocurre a los 80 °C después de 20 minutos.

Electroforesis

Hibridación

 La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra

Los nucleótidos de la sonda está marcados P 32 (radiactivos)

Los nucleótidos de la sonda está marcados P 32 (radiactivos)

Si al revelar hay marcador radiactivo presente, está en la muestra analizada la secuencia complementaria

a la sonda Southern Blot

Si al revelar hay marcador radiactivo presente, está en la muestra analizada la secuencia complementaria

a la sonda Southern Blot

Tipos De Sondas De Hibridación

Sonda Scorpion Sonda Molecular Beacon Sonda TaqMan Sonda LNA (Locked Nucleic Acid) Cycling Probe Technology (CPT)

Sondas Scorpion

Moléculas mixtas Contienen un cebador específico para el amplicón unido a una horquilla similar a la sonda del tipo beacon

Posee un elemento complementario al amplicón (Clon molecular).

Conjunto de moléculas de ADN idénticas Resultado de PCR.

Los fluoróforos se encuentran en la horquillaCuando se cierra no se produce emisión de fluorescencia.Cuando se separan se produce fluorescencia Amplicón en la horquilla.

Sonda Molecular Beacon

Son oligonucleótidos de cadena simple Poseen una zona de apareamiento de bases internas, formando una horquilla.

En presencia del amplicón la sonda se abre y se unen Formando una emisión de fluorescencia.

 Según su estructura poseen:La zona complementaria al amplicón en el giro de la

horquilla.Complementariedad interna en el cuello. Fluoróforos en extremos: Donador en el 5' y aceptor en

el 3'.

Factores que afectan la hibridación

Que son los RFLPs ?

Descubiertos por Sir Alec Jefrreys en 1985.

RFLP Re s tric tio n Fra g m e nt Le ng th Po lym o rp his m o polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción.

Son secuencias de nucleótidos en DNA reconocidas y cortadas Por enzimas de restricción.

En humanos esta puede producir gran numero de cortes en secuencias especificas.

http://www.youtube.com/watch?v=VmCTsmhx2_w http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF16Jm8

Aplicaciones de la técnica

Utilizado para clonación basada en homología en base a secuencia de aminoácidos de proteína producto del gen diana.

Se diseñan oligonucleótidos similares a la secuencia diana, se sintetizan químicamente.

Usados para cribar biblioteca de ADN.

Identificación de sitios metilados en genes particulares.  

Diferencias entre los 3 tipos de Blot

ARTICULO CIENTIFICO

Resumen

• Mutación en el gen FMR1 ubicado en el sitio 27.3 del brazo largo del cromosoma X.

• Codifica para la proteína FMRP Desarrollo cerebral.

Fragile Mental Retardation Protein

Casi todas las personas tienen 29 repeticiones, y los diferentes alelos se clasifican en cuatro categorías.

• Alelos normales 5 - 44• Alelos intermedios 45 – 54 • Alelos con pre-mutación 55 - 200• Alelos con la mutación completa

201

Introducción

Características

Metilación anormal de los islotes CpG.

Bloquea la expresión de los genes.Las alteraciones moleculares fundamentales consisten Aumento en el número de

repeticiones CGG en la región 5’ del locus FMR1.

PREVENCION FUNDAMENTAL: Asesoramiento genético oportuno a los miembros de la familia afectada.

PREVENCION PRIMARIA: Opciones reproductivas, que se realizan mediante diagnóstico precoz, embrionario o fetal.

PREVENCION TERCIARIA: Estudio de los pacientes con éste síndrome ha permitido plantear estrategias específicas para mejorar su funcionamiento intelectual y su adaptación social.

Se estudiaron 8 familias SFX - 39 miembros, se realizaron 4 diagnósticos pre-

natales.

Se estudiaron 8 familias SFX - 39 miembros, se realizaron 4 diagnósticos pre-

natales.

Se aislaron muestras de ADN a partir de sangre o liquido amniótico Empleando precipitación salina.

Se aislaron muestras de ADN a partir de sangre o liquido amniótico Empleando precipitación salina.

Muestras analizadas mediante Southern blot.

Muestras analizadas mediante Southern blot.

Se tomaron 7 µg de DNA genómico Digeridos por 16 horas con 50 U de enzimas Hind III Eag I.

Se tomaron 7 µg de DNA genómico Digeridos por 16 horas con 50 U de enzimas Hind III Eag I.

Metodología

Se realizo electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % a 40 volt por 22 horas Fraccionar los fragmentos de ADN.

Se realizo electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % a 40 volt por 22 horas Fraccionar los fragmentos de ADN.

ADN se fija a membrana de nylon Hibridado con sonda Pp2, marcada con isotopo p32.

ADN se fija a membrana de nylon Hibridado con sonda Pp2, marcada con isotopo p32.

Incubado a 16 horas en baño termóstatado a 65 °C.Incubado a 16 horas en baño termóstatado a 65 °C.

Se realizaron 2 placas radiográficas en casette, expuestas a la membrana en refrigeración por 3 días hasta su revelación.

Se realizaron 2 placas radiográficas en casette, expuestas a la membrana en refrigeración por 3 días hasta su revelación.

Se confirmo diagnostico de alelo causante de SFX.

Resultados

61% de los individuos tenían las expansiones CGG aumentadas.

Inestabilidad meiotica en madres portadoras Tienen hijas e hijos con aumento en el numero de expansiones.

En 4 casos la expansión fue por línea materna.

En 1 caso el abuelo paterno era el transmisor del alelo.

Conocer las causas moleculares de la enfermedad ayudan a garantizar el asesoramiento genético a pacientes y familiares en riesgo.

La transmisión dada por el alelo del abuelo paterno fue la responsable del retraso mental en dicha familia.

Al resto de las familias no se les realizo este análisis ya que algunos miembros estaban fallecidos.

Discusión

Se reporto pre-mutación en hombres como estable en la espermatogénesis, aunque se segrega a sus hijas – Estas son fenotípicamente normales.

En ellas es inestable en la ovogénesis Pueden tener hijos afectados.

La pre-mutación se expande a mutación completa en mujeres portadoras Riesgo de 30% de padecer el síndrome.

Esta técnica es una de las mas precisas y exactas, de gran utilidad para verificar los casos positivos de SFX y diagnostico pre-natal.

Estudia el tamaño de la expansión (CGG)n y el estado de metilación de los islotes CpG adyacente al gen FMR1 No se logra mediante PCR.

Aplicaciones

Aplicaciones de la técnica Southern blot en medicina.

1. En el diagnóstico y caracterización de diversas inmunodeficiencias.2. En la distrofia muscular de Duchenne.3. En la hipoplasia adrenal congénita la deficiencia de glicerol-quinasa.