GK-Kiss nkb

  • View
    41

  • Download
    3

Embed Size (px)

Text of GK-Kiss nkb

PowerPoint Presentation

Neurokinin B (NKB), Kisspeptin ve Reseptrlerinin ( NK3R, KISS1R ) Dii Genital Sisteminde Ekspresyon Analizi Ar.Gr.Gktan KUPINAR (Yksek Lisans rencisi)ULUDA NVERSTES TIP FAKLTES HSTOLOJ EMBRYOLOJ AbD.

AmaGenel Bilgiler Gere ve YntemBulgular Tartma

AmaNeurokinin B (NKB)/NK3 Neurokinin B reseptr (NK3R) Kisspeptin/KISS1 Kisspeptin reseptr (KISS1R)

Ovaryum, tuba uterina ve uterusda,messenger RNA (mRNA) dzeylerinin ve peptit lokalizasyonlarnn gsterilmesi ,olas birlikte ekspresyonlarn tespit edilmesiGenel Bilgiler

Neurokinin B (NKB)Tachykinin neuropeptit ailesi :

Substance P (SP) Neurokinin A (NKA) Neurokinin B (NKB)EndokininsHemokininsPage NM. Ve ark. - 200510-11 aminoasitPhe-X-Gly-Leu-Met-NH2

Pennefather JN ve ark. - 2004

TAC3 geniNKB ( Almeida TA. ve ark. 2004 ) Neurokinin B Reseptr ( NK3R )SP

NKA

NKBNK1R

NK2R

NK3R

Tacr1 geni

Tacr2 geni

Tacr3 geniMussap CJ ve ark. .- 1993

Seabrook GR. ve ark. - 1995Kisspeptin Kiss 1 geni ( 1q32 )

KP-145145 Aminoasitlik ncl protein

Kisspetin 54, 14, 13, 10Kisspeptin Reseptr/ KISS1R (GPR54) KISS1R geni Genel Bilgiler

KISS1R G- Proteini baml reseptrler

Galanin reseptrleri ile %45lik benzerlik gsterir.(Lee DK. Ve ark. 1999 )( Kispeptin 54 - Lee DK. ve ark. 1999)( Gottsch ML. ve ark. 2004 - 2009 )Genel Bilgiler

de Roux N ve ark. (2003 ) Seminara SB ve ark. (2003)Navarro VM ve ark. ( 2004 ) KISS1 ve KISS1R reme fonksiyonlarnn dzenlenmesinde rol stlenmesi

KISS1R (GPR54 ) reseptrunn fonksiyon kaybna yol aan mutasyonlarn,

Pubertal gelime eksikliireme aktivitelerinde kaypHipogonadotropik hipogonadizm 7NKB ve NK3R proteinlerini kodlayan TAC3 ve TACR3 genlerinde grlen mutasyon;Genel Bilgiler

Normosmic hypogonadotropic hypogonadism ( Seksuel geliim bozukluu,hatal gametogenez,infertilite )NKB ve NK3R ligand reseptr ilikisinin reme fonksiyonlarnn dzenlenmesinde anahtar rol stlenmesi Topaloglu AK, Semple RK ve ark. ( 2009 , 2010 )Young J ve ark. (2010)Gianetti E ve ark. (2010)

NKB nin , hipotalamus da bulunan GnRH salnmnn dzenlendii ayr nornal populasyonlardan sentezlendii gsterilmitir. (Goodman RL ve ark. 2007 ), (Rance NE. ve ark. 2009 )

NKB eksprese eden bu nronlarda; postmenapozal dnemde ve ovariektomi sonras NKB ekpsresyon art, strojenin down-regule edici etkisi saptanmtr.(Rance N ve ark. 1991 ve 2009 )

NKB / kisspeptin / dynorphin birlikte eksprese edildii,hipotalamusta arcuate ekirdeklerin ierisinde yer alan, KNDy ad verilen nronlar tespit edilmi,(Lehman MN ve ark. 2010 ) ve bu 3 peptitlerin birlikte GnRH salglanmas ve gonadotropin salnmnda anahtar modlator olduklar sunulmutur. (Navarro VM ve ark. 2011)

Genel Bilgiler

Genel Bilgiler

Merkezi dzeyde NKB ve NK3R ilevlerinini yan sra, reme organlarnda fonskiyonlarnda nemli rolleri hakknda bir ok bilgi aratrmaclar tarafndan sunulmutur.

NKB ve NK3R eitli memeli trlerinde plesanta , ovaryum, testis ve prostat da saptanmtr. (Page NM ve ark. 2000 ) Dier bir eit reme hcreleri olan oosit ve olgun spermatozoa da da eksprese edildii gsterlimitir.(Cintado CG ve ark. 2007)

Tm bu verilere ramen NKB, NK3R, kisspeptin ve KISS1R ekspresyonu yapan reme organlarnda yer alan hcre tipleri hakknda bilinenler azdr.

Gere ve YntemRT-PCROvaryum

5 - Postmenapoz dnemi hasta * ( non-ovarian olgusu ile ooferektomi )Tuba Uterina

Uterus 6 - Orta reme dnemi hasta*5 - Postmenapoz dnemi hasta*( benign uterus olgusu ile histerektomi )* Ya aral 36 77 arasnda olan gebe olmayan hastalar 30 mg doku rneklerinden - Total RNA izolasyonu TriReagent ( Sigma ) cDNA sentezi Quantitect Revers Trasncription Kit ( Qiagen ) RT-PCR

PCR hedef geni Primerler TAC3 266 bp.F 5-CCAGTGTGTGAGGGGAGCA-3R 5-TCCAGAGATGAGTGGCTTTTGA-3TAC3R 178 bp.F 5-TTGCGGTGGACAGGTATATGG-3R 5-GGCCATTGCACAAAGCAGAG-3KISS1 295 bp. F 5-CCACTTTGGGGAGCCATTAG-3R 5-CCAGTTGTAGTTCGGCAGGTC-3KSS1R 166 bp.F 5-GGACGTGACCTTCCTCCTGT-3R 5-GTACCAGCGGTCCACACTCA-3b-actin 362 bp.F 5-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3R 5-ATCTGCTGGAAGGTGGACAG-3*** Pozitif kontrol amal 20 farkl doku rnei ieren cDNA havuzu kullanlmtr. Material ve Metod

mmnohistokimyaMyometrium6 - reme Dnemi Hasta( 3 sekretuar faz- 2 proliferatif faz- 1 menstruel faz ) 1 - Postmenapoz Dnemi Hasta( uterin leiomyoma olgusu ile histerektomi )Ovaryum3- reme Dnemi Hasta ( farkl mensturel dnemlerde ) 4 - Postmenapoz Dnemi Hasta( non- ovarian olgusu ile ooferektomi )% 10 tamponlanm Formaldehit Fiksasyon Parafin bloklama3 mM kesitlerin alnmasDeparafinizasyon - TBS tamponu ile ve rehidratasyonmmnohistokimyaPrimer poliklonal antikorlar ile oda scaklnda gece boyu inkbasyon

NKB (sc-14109 ; Santa Cruz Biotechnology - Kei anti insan )NK3R ( Sigma )KISS (sc-15400 ; Santa Cruz Biotechnology Tavan anti insan )KISS1R (sc-48220 ; Santa Cruz Biotechnology Kei anti insan )

1:30 dilusyon % 0,2 Tritron X-100 ieren TBS tamponunda Biotin isaretli sekonder antikor ile 1:1000 dilusyonda 60 dakika inkbasyonStreptavidin peroxsidase ile 1:1000 dilusyonda 60 dakika inkbasyon Peroxsidase aktivitesinin tespiti iin 4-chloro-1-napthol ( Sigma ) ve %0,01 hidrojen peroksit*** Mast hcrelerinin tayini amal Toluidine Blue boyamas yaplmtr.14mmnohistokimyaEndometriyum6 Hasta * ( bening uterus olgusu ile histerektomi )Tuba Uterina6 Hasta * ( malign uterus olgusu )* Hasta ya aral : 36-77Kesitler primer antikorla ile 30 dakika oda scaklnda 1:100 diluyonda inkbasyonUltra View Universal DAB detection kit ( Ventana medical Systems ) - BenchMark XT*** Negatif kontrol rnekleri primer antikor ile inkbasyon edilmemitir.Bulgular

Gen Ekspresyon analizleri Tac3, Tacr3, Kiss1 ve Kiss1r

Bulgular

mmnohistokimya

Myometrium NK3BMyometrium NKBBulgular

mmnohistokimya

Myometrium da NK3R ekspresyonu, zellikle dz kas hcrelerinde, hormanal dzeye baml olarak belirgin deiiklikler gstermitir.

Bu gzlemlerde aratrmaclarn daha nceki almalarnda insan,fare,san uteruslarnda gzlemledikleri strojen basksnn olduu koullarda TACR3 gen ekspresyonunun yksek oranda dt verisini dorulamtr.

NBK/NK3R ekspresyonunun vaskler ve epitel hcreler de grld gibi mast hcrelerinde grlmesi, bu sistemin uterus ile immn sistem arasnda haberlemede rol ald idda edilebilir.

Proliferatif Faz NK3BSekretuar Faz NK3B

Proliferatif Faz NKB

Sekretuar Faz NKB

mmnohistokimyaBulgular

Endometrium lmen epitel hcreleri ve bez epitel hcreleri - NBK/NK3R ve Kisspeptin / KISS1RBulgular

mmnohistokimya

lk defa Kisspeptin / KISS1R ekspreyonlar insan endometrium ve tuba uterina da gsterilmitir.

Kisspeptin / KISS1R ligand reseptr ilikisinin GnRH nronal kontrolu aral ile merkezi reme fonksiyon dzenlenmesindeki rolne ek olarak periferik dzenlemelerde grev ald gsterilmiir.Tuba Uterina - NBK/NK3R ve kisspeptin/KISS1RBulgular

mmnohistokimya

Uterus lmen epitelinde ve tuba uterina da ; Kisspetin ve NBK peptit sistemlerinin birlikte ekspresyonlar gsterilerek ; sperm transportu, oosit fertilizasyonu, blastosist implantasyonu gibi epitel fonksiyonlarnn dzenlenmesinde rol alabilcekleri ne srlmtr.

Bulgular

mmnohistokimya

NK3BNKBBulgular

mmnohistokimyaOvaryumda NBK/NK3R immnoreaktivitesinin corpus luteum da yksek,gelimekte olan folikllerde dk seviyede olmasn ; folikl geliimin balang aamasnda strojen miktarnn ykseklii ve buna bal olarak NK3R ekspresyonunu basklanmas ile aklanabilir.

Corpus luteum da NBK/NK3R ve Kisspeptin / KISS1R immnoreaktivite gstermesi peptit sisteminin lokal ovulasyon kontrolnde yada postovulatuar ovaryan sreclerde, ovaryan steroidogenesis in kontrolnde potansiyel rol oynadn dndrmektedirBulgular

NBK

NK3RKISS

KISS1RUTERUSMyometriumBa Doku Vaskler Dz KasMyometrial Dz kasBa Doku Vaskler Dz KasMyometrial Dz kas

Mast hcreleriEndometriumLmen ve Bez Epitel HcreleriTuba UterinaEpitel Hcreleri

OvaryumCorpus Luteum Antral FoliklGranloza HcreleriTeka HcreleriTartma

alma da NBK/NK3R ve kisspeptin/KISS1R sitemlerinin uterus (myometrium endometrium ),ovaryum ve tuba uterina da mRNA ekspresyonlar ve proteinlerin lokalizasyonlar gsterilmitir.

NBK/NK3R ligand - reseptr ilikisinin hem merkezi hemde periferal anlamda reme fonksiyonlarnda nemli rol olduu gsterilmitir.

lk kez NBK/NK3R ligand ve reseptr dzeyinde ekspresyonu endometrium ve tuba uterina epitelinde, myometriumdaki vaskler dz kas ve ba doku hcrelerinde, mast hcrelerinde gsterilmiitir.

Tartma

NBK/NK3R ve Kisspeptin / KISS1R peptit sistemlerinin immnoreaktivitesi gz nnde bulundurulduunda reme hastalklar ile ilgili bir biomarker zellik tamad ve pregenitr olarak kullanlamayaca tespit edilmitir.

Genel olarak almada NBK/NK3R ve Kisspeptin / KISS1R peptit sistemlerinin non-nronal reme hcrelerinde birlikte eksprese olduklar gsterilmi ve bu bulgularn periferal remedeki rollerinin gelecekte aratrlmas iin nclk edecei dnlmektedir.

TEEKKR EDERM