Methodes experimentales en_immunologie

Méthodes expérimentales en immunologie

1‐ Techniques de phénotypage2‐ Analyse fonctionnelle in vitro3‐Modèles de souris

Marie‐Alix PoulInstitut de recherche en cancérologie, Montpelliermarie‐alix.poul‐pearson@univ‐montp2.frFMBS215

Informations données par la cytométrie en flux sur une cellule

Informations données par la cytométrie en flux sur une cellulecellulecellule

taille relative (Forward Scatter ‐ FSC)

granularité relative ou complexité interne (SideS tt SSC)Scatter ‐ SSC)

intensité relative de fluorescence intensité relative de fluorescence (FL1, FL2, FL3 et FL4 voire FL5, FL6, .et plus encore): marquage anticorps (ou sonde biochimique)q )

Exemple d’analyse: sang humain hémolysé: Diagramme en 2 dimensions ou dotblot: 1 cellule = 1 point

té) 1000

Neutrophiles

nu

lari

t

800

r(g

ran

600

Monocytes

Sca

tter

0040

0

LymphocytesSid

eS

02 0

F d Li ht S tt

0 200 400 600 800 1000Right Angle Light Detector

--> fonction de la complexité cellulaire

Forward Light Scatter(taille)

Forward Light Detector --> fonction de la taille de la cellule

LumièreIncidente

Analyse cytométrie en fluxAnalyse cytométrie en fluxAnalyse cytométrie en fluxAnalyse cytométrie en flux

• DotBlot (graphe en 2 dimensions)

• Histogramme (1 seul marquage représenté, MFI: intensité moyenne de fluorescence)intensité moyenne de fluorescence)

• Multimarquages

• Marquage intracellulaire (perméabilisation/fixation des cellules)(perméabilisation/fixation des cellules)

• Technique des « tétramères »Technique des tétramères

Détection de T spécifiques:d é è d

Détection de T spécifiques:d é è d

p qPrincipe des tétramères‐MHC peptide

p qPrincipe des tétramères‐MHC peptide

•Production de molécule MHC classe I ou 2 biotinylée chez E. coliy•Dénaturation•Renaturation en présence de peptide•Tétramérisation par ajout de streptavidineTétramérisation par ajout de streptavidine (couplée à un fluorochrome) => forte affinité « fonctionnelle »

E Mi é id d’ é T CD8Ex: Mise en évidence d’une réponse T CD8 spécifique du cytomégalovirus chez un patient HLA‐A2Préparation des PBMC (peripheral bloodmononuclear cells) par gradient de FicollCo‐marquage anticorps anti‐CD8/tétramère q g pde molécule HLA‐A2‐peptide CMV)

Détection/purification des iNKT/

Détection/purification des iNKT/

tétramère de CD1d / α‐Galactosyl‐Ceramide

/ptétramère de CD1d / α‐GalCer

/ptétramère de CD1d / α‐GalCer

iNKT

T i lT conventionnelsautres

souris

stratégies de tristratégies de tri

• Cytomètre associé à un système de tri

L i i di bl d é i d l i l èLong mais indispensable pour des séparations sur de multiples paramètres, possibilité de tri sur un marqueur biochimique. Possibilité d’analyse couplée au tri de 70 000 cellules/s.

• Séparation par phase solide(fond en plastique des boîtes de Pétri ou de culture cellulaire, billes de taille et de nature diverse )

– Les cellules sont retenues soit par adhérence spontanée, soit par affinité par l’intermédiaire d’anticorps monoclonaux ou de lectines.

– « sélection positive » : population d’intérêt retenue par la phase solide– « sélection négative » : population non retenue ( séparation plus « neutre »

fonctionnellement)

Plus simple, moins couteux, pureté inférieure au tri par cytométrie, pas toujours applicable

Technique MACS (« Magnetic activated cell sorting ») Technique MACS (« Magnetic activated cell sorting »)

Billes d’oxyde de fer et de polysaccharide, diamètre de 50 nm y p ycouplées à des anticorps

Colonne de séparation magnétique placée dans un aimant de très forte puissance.

Le tri est simple, rapide, pureté 50> > 95%, rendement > 90%, tri rapide de 109 cellules (1 étape; 10 min.). Présence des billes compatible avec un tri ultérieur en cytométrie de flux.

Ex: Tri négatif: élimination des cellules T dans le cadre des ll ff d ll ( l lé à tiallogreffes de moelle (sur colonne couplée à un anticorps monoclonal pan T.

Combinaison tri magnétique/Cytométrie pour lesCombinaison tri magnétique/Cytométrie pour lesCombinaison tri magnétique/Cytométrie pour les populations rares

Combinaison tri magnétique/Cytométrie pour les populations rares

Trier à partir de109 cellules totales, une sous‐population qui représente 0,5 % d l ll l ( 6 ll l à b )de la suspension cellulaire (soit 5,106 cellules à obtenir) :

Enrichissement; moins de 10 minutes de tri avec l’Automacs pour avoir 107

cellules, pures à 50 %, puis 30 minutes pour amener cette pureté à 98 % par cytométrie en flux sur un trieur à haute vitesse (70 000 cellules).

=> Obtention en 40 min. de 5,106 cellules de la population cible pure à 98 % à partir d’une population où elle est peu représentée (0,5 %).

Un cytomètre très rapide (70.000 cellules/seconde) demanderait tout de même environ ........ h de travail...

Stratégies de tri des Tregs pour amplification ex vivoStratégies de tri des Tregs pour amplification ex vivoStratégies de tri des Tregs pour amplification ex vivoStratégies de tri des Tregs pour amplification ex vivoTri magnétique des CD4 puis Tri par cytométrie

CD4+, CD127‐, CD25high7 , ,

CD12

CD127CD4

CD4+, CD45RA+, CD25high

Histochimie: Tissue micro‐array‐TAMHistochimie: Tissue micro‐array‐TAMHistochimie: Tissue micro‐array‐TAMHistochimie: Tissue micro‐array‐TAM

• Tissue micro array TMA: immunohistochimie à haut débit; fragments (carottage) de tissus d’environ 0,6 mm de diamètre obtenus de tissus inclus en paraffine, disposition dans un bloc de paraffine en espacement réguliersréguliers

• Coupes/microtome, montage sur lame pour analyse

Détection de T mémoires CD45R0 dans des biopsies

Biopsies de patients diagnostiqués avec un cancer colorectal de stade I et II (HEGP)Biopsies de patients diagnostiqués avec un cancer colorectal de stade I et II (HEGP)

Analyse des répertoires BcR ou TcRAnalyse des répertoires BcR ou TcRy py pAmplification PCR- amorce V spécifique/amorce C spécifique

Electrophorèse capillaireExtraction ARN

- précurseurs nucléotidiques fluorescents

Profil gaussien; répertoire poyclonalp y

Amplification d’un pclone

Répertoire anti‐Flu1 Répertoire anti‐Flu1 pp

... we expand CD4+ T cells from the influenza‐specific memory pool of two HLA‐DR1+ donors (known responders to peptide HA305−320). Ten‐day cultures of 106 peripheralblood mononuclear cells (PBMCs) with the peptides Flu1 gave ≥5×104 CD4+ HLA‐DR1/HA305−320 tetramer‐positive cells. We investigated TCR usage by the amplifiedpopulations (FLu1) to establish the repertoire deployed against Flu1 peptide....p p ( ) p p y g p p

N b i di h % f T ll i h TRBVNumbers indicate the % of T cells with TRBV usage

Fl t C ll B diFl t C ll B diFluorescent Cell Bar codingFluorescent Cell Bar coding

Code barre fluorescent

‐Multi marquage et analyse dans un seul tube de plusieurs populations:tube de plusieurs populations:‐Comparaison normalisée des intensités de signauxSi li ité idité

Nature Methods 3, 361 ‐ 368 (2006)

‐Simplicité, rapidité

Fl t C ll B diFl t C ll B diFluorescent Cell Bar coding Fluorescent Cell Bar coding

Analyse dans un même tube de plusieurs populations (marquées avec un code barre d’intensité variable selon le traitement)C i d i t ité d i d i d h h STAT1 t h h STAT6

Nature Methods 3, 361 ‐ 368 (2006)

Comparaison des intensités de signaux de signaux de phospho‐STAT1 et phospho‐STAT6

Production de cytokinesProduction de cytokines

D d ki d d l• Dosage de cytokines dans un surnageant de culture:– ELISA

– Cytometric Beads Array (dosage de plusieurs cytokines possible: analyse multiple)p y p )

• Mesure du nombre de cellules produisant un type de• Mesure du nombre de cellules produisant un type de cytokines– ELISPOT

– Marquage intracellulaire de cytokines/FACS (possibilité de détecter plusieurs cytokines à la fois)

Cytometric Beads Array ImmunoassayCytometric Beads Array Immunoassay

Lecture possible de 100 analytes à la fois

Technique ELISPOT:« Enzyme‐linked immunospot »Technique ELISPOT:« Enzyme‐linked immunospot »

1983, à l’origine, utilisée pour l’activation des cellules B (mesure de la sécrétion des Ig), en 1996, adaptée pour l’analyse de l’activation des lymphocytes T.

Détecter et dénombrer les cellules T activés chez un patient, en détectant la sécrétion de cytokines (l’INFγ notamment).

Caractérisation fonctionnelle d’épitopes T: ELISPOTCaractérisation fonctionnelle d’épitopes T: ELISPOTRecherche d’une réponse T anti-Ep-CAM:

nombre fixe de PBL d'un patient HLA*0201 atteint d’un colo-carcinome incubés avec des

Ep-184(ILYENNVIT)

+ peptides issus d’Ep-CAM

(ILYENNVIT)

4

Ep-184b (ILYENNVITI)( )

80

Milieu

00

PHA

P lif ti /di i i ll l i / t ll l iP lif ti /di i i ll l i / t ll l iProliferation/division cellulaire/mort cellulaire (apoptose)

Proliferation/division cellulaire/mort cellulaire (apoptose)

• Cytometrie de flux: iodure de propidium (cellules mortes répartition dans les phases du cycle) 7‐AADiodure de propidium (cellules mortes, répartition dans les phases du cycle), 7‐AADBrdU, EdU: cellules en phase SCFSE; carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester: colorant fluorescent permettant de suivre

la division des cellules (diminution des intensités de fluorescence selon les divisions), in vitro t i i (i j ti i élè t)et in vivo (injection puis prélèvement).

Annexin‐V: affinité pour la phosphatidyl serine , externalisée pendant l’apoptose

• Microscopie: DAPI Hoechsht• Microscopie: DAPI, Hoechsht

• Thymidine tritiée ou BrdU: quantification de l’incorporation dans l’ADN au cours de la phase Sla phase S

Fonctions effectricesFonctions effectrices

• Cytotoxicité (NK, CTL, NKT): mesure de la di ti ité é t d l t dradioactivité présente dans le surnageant de

cellules cibles préalablement chargées en 51Crp g

• Méthodes cytométriques équivalentes

• Réponse anticorps: ELISARéponse anticorps: ELISA

Modèles de souris humaniséesModèles de souris humaniséesModèles de souris humaniséesModèles de souris humanisées

Souris immunodéficientesSouris immunodéficientespour la reconstitution d’un SI humainpour la reconstitution d’un SI humain

• Souris nude; sans thymus: pas de LT thymodépendants

• Souris SCID (severe combined immunodeficiency, prkdc‐/‐): pas de B et de T ( y, p / ) pmatures, mais des NK

• Souris NOD: diabète, anomalie IFN, anomalie activité NK

• Souris NOD‐SCID: absence de B, T et anomalie activité de NK.

• Souris beige (bg): anomalie des macrophages et neutrophiles, anomalie NK et CTLCTL

• Souris RAG‐/‐: (recombinaisons activating genes) absence de T et B matures

So ris NSG NOD/SCID IL2R / (2004) absen e de B T et NK• Souris NSG: NOD/SCID‐IL2R‐/‐(2004) absence de B, T et NK.• Souris BRG: BALB/C, RAGR2‐/‐,IL2R‐/‐ (2005): absence de B, T et NK.

Protocole pour l’étude de pathologies infectieuses Protocole pour l’étude de pathologies infectieuses chez la souris humaniséechez la souris humanisée

Différences SI homme/sourisDifférences SI homme/sourisDifférences SI homme/sourisDifférences SI homme/souris

Mestas J. et al. 2005


Mestas J. et al. 2005


• La souris est un modèle pour étudier les réponses immunitaires et l’immunopathologie de tester desimmunitaires et l immunopathologie, de tester des médicaments mais pas forcément transposable à l’hl’homme

• Les souris à lignée hématopoïétique g p qhumaine permettent d’étudier le SI humain et ses interactionsinteractions– avec des virus infectant les cellules immunitaires à tropimestrictement humainstrictement humain

– vis à vis de tumeurs humaines

Démarche expérimentale et analyse d’articleDémarche expérimentale et analyse d’article

Marie‐Alix PoulInstitut de recherche en cancérologie, Montpelliermarie‐alix.poul‐pearson@univ‐montp2.frFMBS215

Démarche expérimentale canoniqueDémarche expérimentale canoniqueDémarche expérimentale canoniqueDémarche expérimentale canonique

Question dans un contexte:Est‐ce que l’interaction de la protéine A avec B est impliquée dans le processus P?

Synthèse des conclusions

Questions ciblées:Est‐ce que A interagit avec B?

y

q gEst‐ce que A est impliquée dans le processus P?Est‐ce que B est impliquée dans le processus P?Est‐ce que le processus P est affecté si on abolit l’interaction

t A t B?Conclusions pour chaque question ciblée

entre A et B?

P h ti ibléPour chaque question ciblée:Choix d’une stratégie expérimentale permettant de répondre:Ex: Est‐ce que A interagit avec B?Interaction de 2 protéines recombinantes in vitro?

Pour chaque expérience:1) réalisation, 2) description)

Interaction de 2 protéines recombinantes in vitro?Interaction in vivo (co‐immunoprécipitation, double hybride...)?Est‐ce que des mutations dans le gène A peuvent compenser des mutations dans le gène B?

3) interprétation

Le choix de l’articleLe choix de l’articleLe choix de l articleLe choix de l article

Site PubMEd: http://www ncbi nlm nih gov/pubmed

Titre

Site PubMEd: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

Titre

Auteurs et nom du(des) laboratoire(s)

lé (k d )Mots clés (keywords)

Résumé (abstract)

Introduction

Résultats Tableaux (tables) et figures

Discussion

Matériel et Méthodes

Autres items variables

Données supplémentaires disponibles en ligne (supplementary information ou supplemental data)Données supplémentaires disponibles en ligne (supplementary information ou supplemental data)

Le facteur d’impact d’un articleLe facteur d’impact d’un articleLe facteur d impact d un articleLe facteur d impact d un article

Il d t d l’i t d l té i tifi d’ ( tIl rend compte de l’impact dans la communauté scientifique d’un revue (etattention, en aucun cas d’un article).

Calcul :Soit IFn(R) le coefficient d’impact d’une revue « R » (ou « impact factor ») de l’année n.( ) p ( p )

Nombre de citations année n‐2+ année n‐1

IF année n d’une revue:

Nombre d’articles publiés année n‐2 + année n‐1

IF année n d’une revue:

d d b d l él é l lcorrespond donc un nombre moyen de citations court terme. Plus est élevé, plus les articles publiés par la revue considérée sont cités (à court terme).

50%d jdes journaux d’immunologie ont un facteur d’impact supérieur à 3supérieur à 3

Etape de l’analyse d’articleEtape de l’analyse d’articleEtape de l analyse d articleEtape de l analyse d article

1) Compréhension

nécessité d’informations complémentaires

2) Analyse critique

3) Restitution

1‐Phase de compréhension de l’article1‐Phase de compréhension de l’article1‐Phase de compréhension de l article1‐Phase de compréhension de l article

C d l dé h l i d dComprendre la démarche et le point de vue des auteurs

Comprendre la problématiquep p q

Comprendre la démarche expérimentale

Comprendre les résultats de chaque expérience

C d l i t ét ti d tComprendre les interprétations des auteurs

Faire une synthèse


1‐1‐ Comprendre la problématique :

Les objectifs :‐ identifier la (les) question(s) posée(s)‐ connaître le contexte : qu’est‐ce qui est connu sur le sujet au moment deconnaître le contexte : qu est ce qui est connu sur le sujet au moment de la publication ?‐ identifier les principales conclusions

Les sources d’information :dans l’article : Titre, résumé, introduction, parfois le début de la discussionh h l dChercher un article de revue

Chercher un autre article de recherche

Choisir un autre article si la question qposée ne vous paraît pas intéressante ou pertinente


1‐2‐ Comprendre la démarche expérimentale :

Les objectifsLes objectifs :pour chaque méthode employée,connaître le principe (c.a.d. les grandes étapes du protocole),comprendre sa finalité, si possible, s’interroger sur ses limites

Les sources d’information :dans l’article : Matériel et méthodes, résultatsvos courscertains ouvragescertains ouvragesarticles de recherche citésarticles de la série des Methods in…


1‐3‐ Comprendre les résultats de chaque expérience :

Les objectifs : pour chaque figure ou tableau de résultat présenté‐ identifier les « témoins » et analyser les résultats leurcorrespondantcorrespondant,‐ identifier les « essais » et analyser les résultats leur correspondant,‐ comprendre les conclusions tirées de l’expérience par les auteurs.

Les sources d’information :dans l’article uniquement : Matériel Méthodes, Résultats

‐ Distinguer témoins positif et négatif‐Distinguer témoin positif (négatif) biologique ou témoin positif g p ( g ) g q p(négatif) d’analyse.‐Repérer la significativité des résultats

1‐Phase de compréhension de l’article1‐Phase de compréhension de l’article

1‐4‐ Comprendre les interprétations formulées par les auteurs :

1‐Phase de compréhension de l article1‐Phase de compréhension de l article

L’objectif: expérience par expérience, comprendre les interprétations proposées par les auteurs.auteurs.

Les sources d’information :Dans l’article uniquement : partie RésultatsDans l article uniquement : partie Résultats.

1 5 Eff hè1‐5‐ Effectuer une synthèse :

L’objectif :Recenser les différentes conclusions, et s’efforcer de les rassemblerHiérarchiser les conclusions.

Les sources d’information :dans l’article uniquement : Résultats, Discussion, Titre, Résumé

2‐Phase d’analyse critique2‐Phase d’analyse critique

« procéder à une analyse critique » signifie « s’interroger »

2‐Phase d analyse critique2‐Phase d analyse critique

procéder à une analyse critique signifie s interroger

1 Questionnement méthodologique

Pour chaque expérience décrite dans l’article :‐La stratégie expérimentale utilisée permet‐elle de bien répondre àl ti é ?la question posée ?‐ Les témoins sont‐ils selon vous suffisants ?‐Les témoins donnent‐ils bien les résultats attendus ?

2‐ Questionnement sur l’analyse des résultats par les auteurs

Pour chaque expérience décrite dans l’article :‐Les résultats obtenus vous paraissent‐ils convaincants ?‐Êtes‐vous convaincu par les interprétations proposées ?Êtes vous convaincu par les interprétations proposées ?

2‐Phase d’analyse critique2‐Phase d’analyse critique

3‐ Questionnement sur les conclusions formulées par les auteurs

2‐Phase d analyse critique2‐Phase d analyse critique

3 Questionnement sur les conclusions formulées par les auteurs

‐Les différentes expériences vous paraissent‐elles cohérentes ouvoyez vous des contradictionsvoyez‐vous des contradictions

‐ Les conclusions tirées sont‐elles cohérentes avec les données de lalitté t d t i ?littérature dont vous avez connaissance ?

4‐Questionnement sur les perspectives ouvertes par l’article

‐ Quelle stratégie expérimentale pourriez‐vous proposer pourconfirmer ou infirmer les conclusions importantes de l’article ?p

‐ Quelle « nouvelle » question suscitent les conclusions de l’article ?

3‐ Restitution (présentation orale)3‐ Restitution (présentation orale)3‐ Restitution (présentation orale)3‐ Restitution (présentation orale)

1‐ Situer la problématique (5 min max)‐ Donner les connaissances (contemporaines de la publication) essentielles la ( p p )compréhension (il faut être concis) ;‐ Formuler de manière explicite la(les) question(s) posée(s) par l’article.

2‐ Présenter et interpréter des résultats choisis

Faut il présenter tous les résultats? Ce n’est pas obligatoire et c’est rarementFaut‐il présenter tous les résultats? Ce n est pas obligatoire, et c est rarement possible dans le temps qui vous est imparti. Cela implique :‐ de choisir judicieusement les expériences que vous allez présenter ;d’ê é i bl d é d à d i‐ d’être néanmoins capable de répondre à des questions concernant

les expériences que vous n’avez pas présentées.

Faut‐il présenter les résultats dans l’ordre de l’article ? Ce n’est pasobligatoire, il est parfois plus facile de présenter les données dans unordre différent de celui de la publication.p

Comment présenter une expérience (et donc d’uneComment présenter une expérience (et donc d’uneComment présenter une expérience (et donc d une figure)

Comment présenter une expérience (et donc d une figure)

1‐ Indiquer précisément la question posée.

2‐ Présenter la méthode expérimentale utilisée pour répondre à la question. Si nécessaire, élaborer un schéma présentant son principe.

3‐ Projeter le résultat de l’expérience (tableau ou figure) ; il doit être accompagné :

‐ d’un titre (qui ne doit pas donner la conclusion de l’expérience) mais faire référence à la t té i é i t l tili éstratégie expérimentale utilisée ;

‐ d’une légende. Si la légende de l’article est trop sommaire ou difficile à comprendre sur la publication ne pas hésiter à refaire une légende didactiquela publication, ne pas hésiter à refaire une légende didactique.

4‐ Décrire les résultats obtenus sans les interpréter.

5 C l é l b l é i5‐ Commenter les résultats obtenus pour les témoins.

6‐ Présenter les interprétations des auteurs.

7‐ Effectuer une analyse critique des résultats et de leurs interprétations.

Exemple 1:Exemple 1:Exemple 1:Exemple 1:

Exemple 2:Exemple 2:Exemple 2: Exemple 2:

Impression des 4 premières pages

2015FMBS215 Immunopathologie 2014-15 première série d'articles

date présentation

intervenant superviseur Etudiants

article 1 A germinal center–independentpathway generates unswitched Justin J J Exp Med Vol 209pathway generates unswitchedmemory B cells early in the primaryresponse

Justin J. Taylor, et al.

J. Exp. Med. Vol. 209 No. 3 597-606, 2012 12-févr LG/MAP

article 2 Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like Lahl K et al. J exp MedVol. 204, No.

1 January 22 2007 19-févr LG/MAPg y ydisease 1, January 22, 2007

article 3 Sodium Chloride Drives Autoimmune Disease by the Inductionof Pathogenic Th17 Cells

Markus Kleinewietfeld

Nature. 2013 April 25; 496(7446): 518–522. 19-févr TV

article 4 Down-Regulation of Interferon Signature in Systemic Lupus Erythematosus Patients by Active Immunization With Interferon –Kinoid

Bernard R. Lauwerys,

ARTHRITIS & RHEUMATISM, Vol. 65, No. 2, February 2013, pp 447–456

26-févr TV

Immunization With Interferon Kinoid pp 447 456

article 5 Expression Profiles of MYC Proteinand MYC Gene Rearrangement in Lymphomas

Karen M. Chisholm,

Am J Surg PatholVolume 00, Number 00, ’’ 2015

05-mars CR

article 6 Exhaustion of bacteria-specific CD4 Ta c e 6 Exhaustion of bacteria specific CD4 T cells and microbial translocation in common variable immunodeficiencydisorders

Perreau, M J. Exp. Med. 2014 Vol. 211 No. 10 2033-2045 19-mars PC

article 7 T helper 17 cells play a critical Seon Hee 5664–5669 | PNAS | A il 15 2014 | l 111 | 19 MAPT helper 17 cells play a critical

pathogenic role in lung cancerSeon Hee Chang April 15, 2014 | vol. 111 |

no. 1519-mars MAP

article 8 Gut Microbiota Elicits a ProtectiveImmune Responseagainst Malaria Transmission

Bahtiyar Yilmaz,

Cell 159, 1277–1289, December 4, 2014 26-mars PC

against Malaria Transmission , ,

article 9Functional expression cloningidentifies COX-2 as a suppressor of antigen specific cancer immunity Göbel C

Cell Death and Disease( 2014) 5, e1568; doi:10.1038/cddis.2014.531

02-avr MAP

antigen-specific cancer immunity Göbel-C 531article 10

Changes in antigen-specific T-cell number and function during oral desensitization in cow ’ s milk allergy

MucosalImmunology | VOLUME 5 NUMBER 3

09-avr FC

Science

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