Windows/Mac環境で始める  NGSデータ解析入門  

無料のツールで解析環境を作ろう！

2015/07/03  株式会社ジナリスオミックス  

バイオIT事業部  竹田　綾

NGS現場の会第４回研究会　モーニング教育セッション

NGSの「データ解析」とは

ライブラリー作製

シーケンシング

データ解析

＜２次解析＞  ・アセンブリー  ・マッピング

＜高次解析＞  ・遺伝子アノテーション　・SNP解析  ・発現量解析　　　　　　　・コピー数  ・菌叢推定  　　　　　　　　　　　　　　　などなど

＜1.5次？解析＞  ・生データQC  

NGSの「データ解析」とは

ライブラリー作製

シーケンシング

データ解析

＜２次解析＞  ・アセンブリー  ・マッピング

＜高次解析＞  ・遺伝子アノテーション　・SNP解析  ・発現量解析　　　　　　　・コピー数  ・菌叢推定  　　　　　　　　　　　　　　　などなど

＜1.5次？解析＞  ・生データQC  

このセッションでは・・・

論文に載っているNGSデータの詳細を確認したい！

自分のサンプルのNGSデータが届いたので、とにかく早く

結果が見たい！

・Linuxは使えないけどNGSデータを自分で解析してみたい人 ・『NGS超！入門』のレベルはクリアした人（slideshare.netで資料公開中）

このセッションでは・・・

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自分のサンプルのNGSデータが届いたので、とにかく早く

結果が見たい！

・Linuxは使えないけどNGSデータを自分で解析してみたい人 ・『NGS超！入門』のレベルはクリアした人（slideshare.netで資料公開中）

データ解析の「解析環境」

安定して使いやすい大衆車：　  Windows／Mac

乗りこなせると速いスポーツカー：　  Linux

hDp://www.iu.a.u-­‐tokyo.ac.jp/~kadota/JSLAB_1_kadota.pdf

GUI CUI

Virtual  Machine  (VM)とは

仮想機械（かそうきかい、仮想マシン、バーチャルマシン、

英語:  virtual  machine、VM）とは、コンピュータの動作を

エミュレートするソフトウェアやフレームワークである。ま

た、エミュレートされた仮想のコンピュータそのものも仮

想機械という。仮想機械によって、1つのコンピュータ上

で複数のコンピュータやOSを動作させたり、別のアーキ

テクチャ用のソフトウェアを動作させることができる。

hDps://ja.wikipedia.org/wiki/仮想機械

汎用解析環境 NGS解析

核酸配列  解析

タンパク  配列解析

マイクロ  アレイ  

ワーク  フロー

実験  支援

配布形態

Bio  Linux ◯ ◯  

◯   ー ー △   VM  /  ISO  file  for  install  media

Galaxy ◯ ◯ ◯ ー ◯ △   ソースコード  /  Cloud  instance

GenePaDern △ ー ー ◯ ー ー パッケージ  (Mac,  Linuxのみ）

Chipster ◯

◯

◯

◯

◯

ー VM  (サーバ）  Java（クライアント）  

UGENE ◯ ◯ ◯ ◯ ◯ ◯ パッケージソフト（Win  /  Mac  /  Linux）

hDp://environmentalomics.org/bio-­‐linux/

BioLinux hDps://galaxyproject.org

Galaxy

hDp://www.broadins]tute.org/cancer/so^ware/genepaDern

GenePaDern

hDp://chipster.csc.fi

Chipster hDp://ugene.unipro.ru

Unipro  UGENE

ワークフロー

解析コマンドどうしを繋げて、やりたい解析を実現

一度作ったものを保存しておけば、同じ解析を異なるサンプルのデータに適用できる  他の人が作ったワークフローをそのまま再現することも可能

Virtual  Box・BioLinux  をインストールしてみました

hDps://www.virtualbox.org/

hDp://environmentalomics.org/bio-­‐linux/

OS：　Windows7  Professional　64bit  プロセッサ：　Intel  Core  i3-­‐3240  CPU@3.40GHz  実装メモリ(RAM)：　8.00GB    

BioLinuxを起動するまでの作業

•  Virtual  Boxをダウンロードしインストール（7分）  •  BioLinuxのダウンロード（3.3GB＝約25分）  

•  BioLinuxのインストール（約20分）～その後の設定もろもろ（5分）  

「（Rで）塩基配列解析」でお

馴染みの東京大学大学院農学生命

科学研究科　門田幸二さんらの、日

本乳酸菌学会誌連載の資料を、ガッ

ツリ参考にさせていただきました！

hDp://www.iu.a.u-­‐tokyo.ac.jp/~kadota/book/JSLAB2_VirtualBox_win.pdf  hDp://www.iu.a.u-­‐tokyo.ac.jp/~kadota/book/JSLAB2_BioLinux8_iso_win.pdf  

ハードドライブ（ファイルサイズ）の設定

仮想ハードドライブは、実際に使えるサイズ以上を指定しても、特にエラーが出たりはしない。今回は、344GBの空きがあったので、300GBと設定した。

メモリーサイズ・CPU数の設定

それぞれ、マシンスペックに応じてリーズナブルな範囲が緑で示されているので、それを参考に。  

共有フォルダーの設定

ホストOS（この場合Windows）とBiolinuxとの間でデータのやりとりをするために、共有フォルダーを設定。  

hDp://pc-­‐karuma.net/virtualbox-­‐folder-­‐share/

Galaxyがすぐ使えます

Galaxyチュートリアルはたくさんあります！

•  本家  –  hDps://usegalaxy.org/  

•  GalaxyによるNGS解析（DBCLS大田さん）  –  hDps://github.com/inutano/training/tree/master/ajacs-­‐advanced-­‐01  –  hDps://www.youtube.com/watch?v=CHCJVN-­‐d9qo  

•  DBCLSのGalaxy（統合TVリンク多数）  –  hDp://galaxy.dbcls.jp/  

•  Galaxy  Workshop  Tokyo  2015（Community  Galaxyパッケージ)  –  hDp://wiki.pitagora-­‐galaxy.org/wiki/index.php/

Galaxy_Workshop_Tokyo_2015  

などなど、他にも目的別チュートリアルも多数

Galaxyチュートリアルはたくさんあります！

•  本家  –  hDps://usegalaxy.org/  

•  GalaxyによるNGS解析（DBCLS大田さん）  –  hDps://github.com/inutano/training/tree/master/ajacs-­‐advanced-­‐01  –  hDps://www.youtube.com/watch?v=CHCJVN-­‐d9qo  

•  DBCLSのGalaxy（統合TVリンク多数）  –  hDp://galaxy.dbcls.jp/  

•  Galaxy  Workshop  Tokyo  2015（Community  Galaxyパッケージ)  –  hDp://wiki.pitagora-­‐galaxy.org/wiki/index.php/

Galaxy_Workshop_Tokyo_2015  

などなど、他にも目的別チュートリアルも多数

使い方は自習しましょう！

hDp://qiita.com/dritoshi/items/707d3dd1fe9ed4f3b5b6

Virtual  Machineとして入手可能な  各種アプリケーション別解析パイプライン

解析パイプライン 生物種 解析内容 UI

MyPro  hDp://sb.nhri.org.tw/MyPro/index.html

微生物 バクテリア全ゲノムシーケンスデータの  De  novo  アセンブリーからアノテーション解析

CUI

CloVR-­‐Microbe  hDp://clovr.org/methods/clovr-­‐microbe/

微生物 バクテリア全ゲノムシーケンスデータの  De  novo  アセンブリーからアノテーション解析

GUI  CUI

CloVR-­‐16S  hDp://clovr.org

微生物 （メタ16S）

メタ16Sアンプリコンシーケンスデータの菌叢解析   GUI  CUI

TREVA  hDp://bioinforma]cs.petermac.org/treva/

ヒト、マウス

エクソーム、ターゲットシーケンスデータのマッピング解析、SNV,  Indel,  CNV解析（生殖細胞、体細胞変異）

CUI

MAP-­‐Rseq  hDp://bioinforma]cstools.mayo.edu/research/maprseq/

ヒト RNA-­‐seqデータのマッピング解析、SNV解析、発現量解析、融合遺伝子解析

CUI

CAP-­‐miRSeq  hDp://bioinforma]cstools.mayo.edu/research/cap-­‐mirseq/

ヒト、マウス miRNA-­‐seqデータのマッピング解析、既知microRNA、新規microRNAアノテーション解析、SNV解析、発現量解析、発現変動遺伝子解析  

CUI

HiChIP  hDp://bioinforma]cstools.mayo.edu/research/hichipseq-­‐pipeline/

ヒト、マウス ChIP-­‐seqデータのマッピング解析、ピーク検出、モチーフ検出、GO解析

CUI

SV-­‐AUTOPILOT  hDps://bioimg.org/sv-­‐autopilot

任意 ゲノムシーケンスデータのマッピング解析、構造変異解析   CUI

CloVR-­‐16S

HiChIP

Virtual  Machineとして入手可能な  各種アプリケーション別解析パイプライン

•  目的に応じて、必要な工程が決められていて、インプット／アウトプットがわかりやすい  

•  説明資料が豊富なことが多い（必要なコマンドの解説など）

•  既存のパイプライン以外のことをしようとすると、設定がむずかしい  

•  含まれる個別のツールのライセンス形態が統一されていない  

 アカデミックフリー（企業には有償）のものもあるので、    特に企業の利用はライセンス要確認!

汎用解析環境 NGS解析

核酸配列  解析

タンパク  配列解析

マイクロ  アレイ  

ワーク  フロー

実験  支援

配布形態

Bio  Linux ◯ ◯  

◯   ー ー △   VM  /  ISO  file  for  install  media

Galaxy ◯ ◯ ◯ ー ◯ △   ソースコード  /  Cloud  instance

GenePaDern △ ー ー ◯ ー ー パッケージ  (Mac,  Linuxのみ）

Chipster ◯

◯

◯

◯

◯

ー VM  (サーバ）  Java（クライアント）  

UGENE ◯ ◯ ◯ ◯ ◯ ◯ パッケージソフト（Win  /  Mac  /  Linux）

hDp://ugene.unipro.ru/

hDp://ugene.unipro.ru/

UGENE： “It  works  perfectly  on  Windows  ,  MacOS,  and  Linux”

•  Windows  64bit  full  installer  packageダウンロード（5分）  •  ダブルクリックでインストール（約3分）

UGENEを動かしてみました

hDp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/ERR047092/

hDps://ja.wikipedia.org/wiki/レンサ球菌

豚レンサ球菌  Streptococcus  suis

hDp://trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/

hDp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/

hDp://www.ebi.ac.uk/ena

hDp://trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/

hDp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/

1.7GHz  Intel  Core  i7  8  GB  RAM  

1.7GHz  Intel  Core  i7  8  GB  RAM  

計算時間の例（論文から）

•  Variant  calling　→15min  – Reference:  hg19  ch11  (UCSC)  – BAM:  ch11  alignment  of  NA20887  (1000  genome  project)  

•  Tuxedo  pipeline(RNA-­‐seq)  →8.5hr  – RNA-­‐seq  sample  from  Human  cell  line  

 

2.9  GHz  Intel  processor  4コア  16  GB  RAM  

Golosova  et  al,  (2014)  PeerJ,  DOI  10.7717/peerj.644

hDp://ugene.unipro.ru/podcast.html

感想とまとめ

•  UGENEのインストール（WindowsもMacも）はとても簡単だった  

– 手元にあった端末で、手軽にNGSデータを扱えるようになった！  

– コマンドラインやLinux、サーバーなどの知識は必要なし  

•  ワークフローと、そこに出てくる個々のツールについての知識は必要  

– 自分が必要としている解析については、ツールの特徴やオプション・アルゴリズムなどを（少なくとも生物学的な観点で）理解する必要がある  

参考資料

Win/Mac用NGS解析ソフト(有償)

De  novo RNA-­‐seq

Variant Small  RNA

ChIP-­‐seq

Methyl-­‐seq

Meta-­‐genome Win Mac

CLC  Genomic  Workbench  (Qiagen)

◯ ◯ ◯ ◯ ◯ ◯ ◯ ◯

GenomeJack  (三菱スペース)

◯ ◯ ◯ ◯ ◯

Strand  NGS  (Agilent  Technologies)

◯ ◯ ◯ ◯ ◯ ◯ ◯

Partek  Genomics  Suite  (Partek)

◯ ◯ ◯ ◯ ◯ ◯ ◯

詳しくは、それぞれのメーカー・販売代理店へ  

機能リストは当社調べのため、過不足等の可能性がありますので、あくまでも参考程度としてください。

By  清水さん  （岩手医科大）  @atsushi_ngs

多サンプルNGS研究の  新しいプラットフォーム

NGSデータの蓄積・管理・分析をこの1台で。  

GGMとは ジナリスの開発した次世代シーケンシングデータ蓄積管理システムGenaGenomeManager（GGM）は、増え続けるNGSデータの効率的な蓄積、管理を可能にし、今後重要となるゲノムビッグデータの効率的な活用を支援します。  

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配列データとメタデータの一元管理

•  配列データ  – 異なるシーケンサーによる配列データ  – 多様なアプリケーション：  DNA-­‐seq,  RNA-­‐seq,  …  

•  メタデータ  – 実験情報  – 解析パラメータ  – サンプル情報  – 臨床情報  

GGMを使ってできること

1.  NGSデータおよび関連情報の登録・管理  

2.  データ解析・マイニング  (a)  変異解析  (b)  発現解析  (c)  多サンプル比較  (d)  変異解析、発現解析の統合解析  

NGSDNA-seq, RNA-seq, ChIP-seq etc…

NGS $(BAM,$VCF,$BED,$etc.)

$NGS etc.

Management  Mode

Study  Mode

アルコール感受性遺伝子検査

エタノール アセトアルデヒド 酢酸

ADH2 ALDH2

His47Arg:  低活性 Glu487Lys:  低活性

0/16 5/16

お酒に強いか？強くないか？

任意のメタデータの項目を追加できる

１０００人ゲノムから日本人Exomeデータ１６人分を取得し、お酒に強い/弱いのどちらかのPhenotypeに特徴的な変異（Variant)箇所を探す

１６人分のデータのVariant数（Variant  locus）は、のべ約３１０万箇所

任意に登録したメタデータ「お酒に強い／弱い」の項目で二群比較を行う  （Genotypeで、Group  AまたはGroup  Bに特徴的なVariantを探す）      ３１０万箇所　→　４７箇所　に絞り込むことができた　（約４秒）

変異箇所の詳細ページを表示すると、各サンプルのリードカウントや、アミノ酸情報なども確認できる

そもそもそんなに多サンプルのデータをお持ちでない方へ

ゲノム解析クラウドサービス

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