UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPASFacultad de Ciencias Químicas Ocozocoautla

Dra. Ana Olivia Cañas Urbina

Laboratorio de Biología Celular

ALVAREZ OCAÑA JOHNNY A.

DOMÍNGUEZ MUÑOZ DEYANIRA A.

GÓMEZ CASTELLANOS DANIELA GPE.

MALDONADO GALVEZ ALEJANDRA

2 SEMESTRE.

PRÁCTICA 3.- MICROSCOPÍA

Ocozocoautla De Espinosa, Chiapas a 16 de septiembre de 2015

Fig. 1 Poder de resolución de un microscopio.

Fig. 2 Partes que componen un microscopio

ANTECEDENTES.

“El microscopio, este término designa, en sentido amplio, a todo instrumento utilizado para amplificar la imagen de objetos que, por su tamaño, no son observables a simple vista”.El descubrimiento del microscopio compuesto tuvo un precedente atribuido a Galileo (1564-1642).El verdadero impulsor de la Microscopía fue, sin duda, el holandés Anton Van Leeuwenhoek, (1632-1723). Construyó microscopios simples, con lentes muy convexas que él mismo pulía y con los cuales realizó observaciones muy diversas: estudió la composición de la sangre, fue el primero en observar y dibujar los protozoos, descubrió las bacterias, etc. Sus trabajos fueron publicados por la Real Sociedad de Londres (1683). Hoy día, hay unanimidad en considerar a los holandeses Hans y Zacarías Janssen, padre e hijo, como constructores del primer microscopio compuesto en 1590.Desde entonces y hasta nuestros días, el microscopio compuesto no ha cesado de perfeccionarse, incorporándole mejoras, revolver porta objetivos, visión binocular, iluminación halógena de gran rendimiento, filtros polarizadores, equipo de contraste de fase, microscopio de contraste interferencial, microscopio de luz ultravioleta, etc. Pese a todo, el microscopio óptico presenta una serie de limitaciones que le impone la naturaleza de la propia LUZ. Por encima de los 1500-2000 aumentos, las aberraciones que origina la luz impiden hacer observaciones con nitidez. Es por ello que los investigadores tuvieron la idea de utilizar haces de electrones en lugar de rayos luminosos y potentes electroimanes, en lugar de lentes. Con ello nació el microscopio electrónico. (Breve historia del microscopio, 2009).

OBJETIVO.- Identificar las partes y sistemas que componen al microscopio, así como el montaje y enfoque de distintas muestras problema.

MATRIALES.

Azul de metilenoVerde malaquita

5 porta-objetosReactivos de Gram (cristal violeta, lugol, alcohol cetona, safranina).

Microscopio PREMIERE®

KOH Aceite de inmersión

Reactivos de Wright (azul de metileno-eosina y sol. Buffer)

METODOLOGÍA.

MICROSCOPÍA

(PRÁCTICA lll)

RESULTADOS.

Antes de observar el contenido de cada tinción, cada integrante tomó el microscopio (microscopio PREMIERE ®) y enfocó. Esto para familiarizarse con el funcionamiento de las partes del microscopio.

TINCIÓN SIMPLE

OBSERVACIONES

HIDROXIDO DE POTASIO (KOH)

La tinción del KOH es simple ya que solo se usa un colorante.Esta fue la primera tinción que se observó.Después de encontrar el campo observación, se enfocó. Ahí se logró observar ciertas esferas llamadas esporas y algunos objetos alargados llamados hifas

AZUL DE METILENO

El azul de metileno es una tinción simple ya que solo se usa un colorante. En esta tinción se pudo observar la presencia de una bacteria.

TINCIÓN DIFERENCIAL

OBSEVACIONES

1Se acudió al laboratorio de la Faculta de Ciencias Químicas, con el material, el conocimiento de lo que se realizó más el uso adecuado de la bata.

2

Para la realización de la práctica de microscopía, estaban ya preparadas muestras que se encontraban teñidas. (tinciónes simples y diferenciales)

3

Cada una de las muestras se colocaron en la platina del microscopio y con ayuda de los tornillos macro y micrométrico se trató de enfocar un campo, comenzando por el objetivo 10x.

4El procedimiento de enfoque se realizó en cada una de las muestras:a)tinción simple, b)tinción diferencial, c)tinción simple, d)tinción diferencial

5Al concluir éstas muestras, fue opcional el enfoque y análisis de una muestra teñida bajo la técnica de Wright

6Finalmente se apagó el microscopio utilizado y se procedió a limpiar el área de trabajo

VERDE DE MALAQUITA

La tinción de verde de malaquita es una tinción diferencial ya que no se utiliza solo un colorante; con el verde de malaquita se colorean las esporas de verde.

DE GRAMEs una tinción diferencial ya que no solo se utiliza un colorante. Esta tinción es comúnmente utilizada para la identificación gram positivas o negativas, según el tipo de coloración que adopte. La que se observó tenía un color púrpura o violeta (gram positiva)

TINCIÓN EXTRA

OBSERVACIONES

TINCIÓN DE WRIGHT

La tinción de Wright es una tinción diferencial. En ésta tinción se observaron células que parecían segmentadas que no comprendíamos que eran.

Para reafirmar que cada integrante comprendió el uso de las partes del microscopio, se decidió enfocar un cabello. Sí se logró enfocarlo y por lo tanto se afirma que los integrantes comprendieron y aprendieron a manejar el microscopio.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

En la práctica de microscopía, existieron ciertos inconvenientes en el momento de observar las muestras. En la mayoría de las muestras hubo dificultades a la hora de enfocar con los objetivos, probablemente por falta de práctica y/o experiencia.

En una muestra que fue la de azul de KOH, se debía observar hongos. Fue difícil poder observar las hifas de los hongos, porque se dejó secar la muestra, debido a que tardamos demasiado tiempo enfocando. Y seguido de la falta de experiencia.

La otra muestra que dio problemas para la observación fue la de Gram en donde se necesitó de colocar el aceite de inmersión, se buscó el campo con el objetivo de 4X pero en el momento de cambiar el objetivo al 100X se perdía el campo y por lo tanto no se lograba enfocar y poder observar con claridad la muestra.

Además creemos que los problemas también fueron causados por el tipo de microscopio, ya que el microscopio utilizado fue de una marca de menor calidad en comparación con los Nikon: Premiere en este caso. Al ser de menor calidad se refiere a que las lentes de este microscopio son menos “pulidas” que las de la otra marca, por lo tanto con aquellas lentes se obtiene una mejor resolución.

Otro inconveniente que dificultó la observación de las muestras, fue que probablemente el microscopio utilizado, había estado en demasiado uso y sin las medidas necesarias para el mantenimiento, esto deriva que se observó en todas las muestras una “raya” así podría definirse, que se mantenía fija en todos los campos de observación.

CONCLUSIÓN.

En conclusión, a partir de la identificación de partes y del uso de microscopio, con defectos que se tuvieron, si se pudo conocer cada parte del microscopio, las funciones que tiene cada una de sus partes y a pesar de todo se manipuló bien al momento de enfocar, pero eso sí, totalmente de acuerdo a que hace falta practicar más.

CUSTIONARIO.

Defina longitud de onda, espectro visible, resolución y apertura numérica

>la longitud de onda es la distancia existente entre dos crestas o valles consecutivos.

>es el espectro de radiación electromagnética que es visible para el ojo humano.

>indica la cantidad de detalle que puede observase de una imagen.

>medida que indica la capacidad del objetivo de poder captar los rayos refractados por las estructuras finas de las cuales está constituido el objeto que se observa.

¿Cuál es la importancia del uso del condensador?

Componente óptico que tiene como función principal concentrar y regular los rayos luminosos que provienen de la fuente luminosa.

¿Qué diferencia hay entre el ojo humano, microscopio óptico y microscopio electrónico?

El ojo humano solo puede observar hasta 0.1mm (100 µm), la mayoría de las células son mucho menores y necesitan todo el poder de la resolución del microscopio óptico (0.2µm) a diferencia del microscopio electrónico que va de 0.4 a 200nm.(Fig. 3.)

¿Para qué se emplea el microscopio de campo oscuro, el microscopio de contraste de fases y el microscopio de fluorescencia? ¿Qué es microscopia LED?

>El Microscopio de campo oscuro se emplea para aprovechar el conjunto de rayos luminosos oblicuos que inicialmente no entran a la lente frontal del objetivo, observándose el campo microscópico totalmente oscuro. Para que esto ocurra se requiere en primer lugar que la apertura numérica del condensador sea mayor que la apertura numérica del objetivo.

Cuando estos rayos oblicuos encuentran en su recorrido, alguna partícula, son desviados hacia la lente frontal del objetivo y la imagen de la partícula se observa brillante en medio de un fondo oscuro.

>El microscopio de contraste de fases es el microscopio de fotones más utilizado para observar objetos o estructuras transparentes sin teñir, facilita la observación de células vivas para distinguir y analizar sus componentes morfológicos y ciertas funciones que ellas pueden desarrollar (fagocitosis, mitosis, movimientos ciliares o flagelares, etc.)

Fig. 3 Gráfico que muestra las distintas capacidades de resolución.

>El microscopio de fluorescencia se emplea para demostrar una serie de componentes celulares o tisulares pues al unirse de manera específica a los fluorocromos (colorantes artificiales que emiten fluorescencias cuando son excitadas), resplandecen ofreciendo imágenes de colores diferentes, generalmente de las longitudes de ondas azules, verdes, amarillas, naranjas o rojas.

>la microscopia led es aquella que ofrece una iluminación uniforme, de alto contraste, muy difusa, o iluminación casi sin sombra

Explique qué son tinciones simples y qué son tinciones diferenciales y dé 2 ejemplos de cada una de ellas

>las tinciones simples son aquellas que se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. La tinción simple se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas. (Fig. 4.) En las tinciones simples se usa un único reactivo,

que preferentemente es de tipo básico y contiene un cromógeno (compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromógeno. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple mejora la observación de la célula completa. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente (sustancia química utilizada para intensificar la coloración), hay que añadirlo justo antes del colorante.

Se utiliza un solo colorante

(Básicos). - Azul de metileno - Safranina - Cristal violeta

>las tinciones diferenciales son aquellas que se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. Se basan en el uso de dos colorantes. Se realiza una tinción primaria, con la misma técnica de la tinción simple y posteriormente una tinción de

contraste para teñir las células que no se hayan teñido previamente. Procedimiento que se utiliza para diferenciar organismos en base a sus distintas características tinción. Reaccionan de manera diferente entre las distintas clases

de bacterias.

Fig 4. Bacillus megaterium. Tinción

¿Por qué existen objetivos con diferentes aumentos? ¿Le sirvieron en la presente práctica? Explique sus respuestas ¿Qué dificultades se presentarían si se iniciara un enfoque de muestra con la lente de mayor aumento? ¿Por qué debe emplearse aceite de inmersión con el objetivo de 100X?

Porque de esa forma podemos ver el objeto en diferentes aumentos, los objetivos establecen la calidad de la imagen y están constituidos por un juego de lentes. Estos aumentos son en 10x, 40x y 100x, en este último es necesario utilizar aceite de inmersión, esto es porque los objetivos de mayor aumento, tienen una distancia focal muy pequeña y además la primera lente del objetivo es de pequeño diámetro. El aceite de inmersión no incrementa el aumento de los lentes, pero mejora la resolución y la nitidez de la imagen producida por dicho objetivo. Cuando la luz pasa a través de un material a otro, por ejemplo del vidrio al aire, la luz se refracta o distorsiona.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.Breve historia del microscopio. (2009). Recuperado el 03 de septiembre de 2015, de claicarubio-quil.jimdo.com/app/download/.../Microscopio_Manual.pdf?t...

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Fig 5. Tinción de Ziehl Neelsen Fig. 6 Tinción de Gram

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