Embed Size (px)
Citation preview
GIẢI TRÌNH TỰ DNA DNA SEQUENCING
TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy
1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA
Giải trình tự DNA là một thí nghiệm cho kết quả thứ tự sắp xếp các nucleotide trong đoạn DNA đó.
Vd:
5’CGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTCCAGGCATTGAGCGGGTTTGATCCAAGAAAGGACCCGGTCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGATCCTGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACGCTTAATAGAACAANAAA3’
2. HAI PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNA
Phương pháp hoá học giải trình tự DNA
của Maxam & Guilbert (1977) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)
Walter Gilbert
Phương pháp enzyme giải trình tự của
Frederick Sanger (1977) Nobel hoá học 1958 (cấu trúc protein: Insulin)
Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)
2.1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP HÓA HỌC
1. Đánh dấu một đầu của đoạn DNA bằng gốc phospho
đồng vị phóng xạ (32P).
2. Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu 32P bằng hóa chất làm
biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide
trên đoạn DNA
3. Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4
hàng của một gel polyacrylamide biến tính
Autoradiography
Dựa trên nguyên tắc dùng enzyme polymerase để tạo sợi bổ sung từ mồi cho sợi khuôn, nhưng do trong ống phản ứng có thêm các ddNTP, nên mỗi khi men polymerase kéo nhầm ddNTP vào thì sợi bổ sung sẽ bị chặn lại và kết quả là sẽ có các sợi bổ sung với độ dài khác nhau.
2.2. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP ENZYM
ddNTP dNTP
Bốn phản ứng polymer hoá
xảy ra trong 4 ống riêng biệt
Tỉ lệ dNTP và ddNTP
= 100 : 1
Mồi đƣợc đánh dấu
T
3’
C
G
C
A
G
T
C
C
T
A
G
C
T
T
A
G
C
G
G 5’
A C G
T
Áp gel điện di lên phim (mồi đánh dấu bằng phóng
xạ hay bằng hoá quang), các vạch điện di trên gel
sẽ hiện trên phim.
C G G G C G T
Sequence 5’ to 3’
MỒI ĐÁNH DẤU PHÓNG XẠ P35
ĐÁNH DẤU ddNTP
Sequence-specific
primer
1. Gắn ddNTP ngẫu
nhiên, khi xẩy ra,
p/ứng ngừng.
2. Vì nhiều copy của
DNA đích được tạo
đồng thời, nên các
sản phẩm DNA
được tổng hợp mới
của tất cả các kích
thước đều hiện diện
với tận cùng là các
ddNTP
GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN
1. Dùng gel polyacrylamide biến
tính, có độ phân giải cao, có
thể phân biệt các đoạn DNA
khác nhau chỉ 1 nucleotid.
2. Gel polyacrylamide thường
chứa urea (tác nhân làm biến
tính DNA)
Bƣớc 1: Tinh sạch sản phẩm PCR
PCR
+ DNA đích
+ Taq polymerase
+ Mồi và dNTPs
+ PCR buffer, etc….
On to sequencing….
Sản phẩm PCR tinh sạch
+ nước
3. KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ
Sản phẩm PCR
Đo nồng độ DNA bằng máy
hay ước lượng qua điện di
Bƣớc 2: Phản ứng chu kỳ giải trình tự
(cycle sequencing reaction)
denaturation
Primer annealing
Product extension
PCR machine Tủa sản phẩm giải trình tự
loại bỏ chất đánh dấu thừa
Bƣớc 3: Điện di trên máy giải trình tự
1. Mỗi ddNTP được gắn một màu khác nhau.
2. Sản phẩm PCR được phân loại dựa trên kích
thước (khác nhau 1 nt), khi chạy qua khu vực
phát hiện sẽ được phân tích nhờ chùm tia laser
và bộ phận detector.
3. Dữ liệu được ghi nhận gồm cường độ huỳnh
quang thu được và màu sắc của mỗi đoạn DNA.
4. Trình tự của đoạn DNA được đọc theo chiều 5’
đến 3’, từ trái sang phải.
Automated DNA Sequencing with Fluorescent Dyes
Mỗi ddNTP có một màu khác nhau, ddTTP đỏ, ddGTP đen,…
1. Tối ưu hóa phản ứng PCR phải thật sự hoàn chỉnh
2. Chất lượng và nồng độ DNA đích
3. Mồi đặc hiện với nồng độ thích hợp
4. Sản phẩm PCR phải tinh sạch
5. Phải xác định đúng hàm lượng mồi và sản phẩm
PCR tinh sạch cho p/ứng chu kỳ giải trình tự
4. HIỆU QUẢ P/ỨNG GIẢI TRÌNH TỰ
Hệ thống giải trình tự Trugene Siemens Medical Solutions Diagnostics
CEQ 8000 (Beckman Coulter)
ABI 3130 ABI 3130 XL 4 Cappilaries 16 Cappilaries
CÁC HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG
ABI 3730
5. PYROSEQUENCING
Giải trình tự bằng phƣơng pháp tổng hợp, không điện di
= pyrophosphate
=pyrophosphate
Peaks in pyrogram reflect nucleotide sequence
Mostafa Ronaghi và Pal Nyrén tại Royal Institute of Techology ở Stockholm 1990s.
~500 MB on one plate, in just a few hours.
PYROSEQUENCING
Step 1: DNA đích, Primer, ủ với enzym DNA polymerase,
ATP sulfurylase, luciferase, apyrase, và cơ chất là APS
(adenosine 5’phosphosulphat) và luciferin
Step 2: 4 dNTP được đưa vào phản ứng. DNA
polymerase xúc tác gắn dNTP vào sợi DNA tiếp theo
primer nếu nó bổ xung với DNA đích. Mỗi khi 1 dNTP gắn
vào, sẽ phóng thích 1 pyrophosphat (PPi)
PYROSEQUENCING
Step 3: ATP sulfurylase
xúc tác chuyển PPi
thành ATP với sự có mặt
của APS (adenosin
5’phosphosulphat).
ATP tạo thành cung cấp
năng lượng cho luciferin
thành oxyluciferin nhờ
enzym luciferase, ánh
sáng được nhìn thấy tỉ lệ
với số ATP tiêu thụ.
PYROSEQUENCING Step 4: Apyrase, enzym phá
các dNTP và ATP không sử
dụng.
Step 5: 4 dNTP khác được
đưa vào phản ứng.
Ứng dụng
pyrosequencing: - Genotype virus và vi khuẩn
Đặc biệt là loại mới, nguy
hiểm.
- Phát hiện đột biến
Kháng thuốc
- Định danh vi khuẩn, nấm
- Phân tích SNP-Single
nucleotide polymorphisms
Pyrosequencing technology
(DNA)n + dNTP (DNA)n-1 + PPi Polymerase
STEP 1: Hybridization of sequencing primer to ssDNA
Incorporation dNTP with release of PPi
Sulfurylase
APS +Ppi ATP
Luciferase
Luciferin oxyluciferin
ATP Light
light
Time
STEP 2: Conversion of to ATP by sulfurylase
Released ATP drives conversion of
luciferin to oxyluciferin by enzym luciferase.
which produces light that is detected by the CCD
and results in a pyrogram
Apyrase
Apyrase dNTP dNTP + dNMP + phosphate
ATP ADP + AMP + phosphate
STEP 3: Degradation of unincorporated dNTP’s and excess
ATP by apyrase. After degradation the next dNTP
is added
STEP 4: The complementary DNA strand is build up as the
process continues. The sequence is determined from
the signal peaks in the pyrogram
6.1. Giải trình tự bộ gen ngƣời
HGP (10/1990): Viện quốc gia Y tế Hoa kỳ (3 tỉ USD)
- 6/2000: Crag Venter và Francis Collins
97% bộ gen người được giải mã
- 4/2003 (kỷ niệm 50 năm mô hình DNA của W-C)
Hoàn tất giải mã bộ gen người
- Bước vào kỷ nguyên Post-genomic và Proteomic
- Giá thành 2001: 1us / 1bp,
10 đến 15 năm nữa: 0,01 us/ 1bp
6. ỨNG DỤNG CỦA GIẢI TRÌNH TỰ DNA
6.2. Định danh VSV: VK kỵ khí: giải trình tự một
đoạn đặc hiệu cho giống và loài ở gen 16S
6.3. Định danh nấm: giải trình tự một đoạn đặc hiệu
cho giống và loài ở gen 28S rDNA
6.3. Xác định genotype của các VR, VSV…
HCV: genotype 1 (1a, 1b), 2 (2a, 2b, 2c)….
HPV: high-risk, low-risk…
6.4. Phát hiện các đột biến, đột biến kháng thuốc
HBV kháng lamivudine: Lamivudin ức chế virus và
làm giảm tình trạng viêm. Đột biến thường xảy ra
trong vùng YMDD (tyrosine, methionine, aspartate,
aspartate) của protein polymerase của virus.
Lao kháng thuốc Rifampicine, INH…
Sau khi xác định trình tự một đoạn DNA quan tâm, so
sánh với ngân hàng dữ liệu gene của NCBI
(National Center Biotechnology Information)
….
Genome Sequencer FLX System
1 million high-quality reads per run and
read lengths of 400 bases
Genome Analyzer Iix - Illumina
MỘT SỐ HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ MỚI
