Sequenziamento ed assemblaggio di genomi batterici

Andrea TelatinBecoming a BioinformaticianAndrea TelatinSequenziamento di Piccoli Genomi

Minicorsi NGS 14 novembre 2014Andrea TelatinBecoming a BioinformaticianAndrea TelatinSequenziamento di Piccoli Genomi

Minicorsi NGS Bioinformatics Specialist

de novo genomeSequenziamento di genomi batterici

Ottobre 2014



Sequenziamento de novo

• “Piccoli genomi” in senso strettoGenomi procariotici fino a 10 Mb

• Genomi “abbastanza” piccoliEucariotici o procariotici < 40 Mb



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• Gli step dell’analisi bioinformatica…

• …ed i formati dei files di output

• Disegno sperimentale



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Come?Whole genome shotgun

L’assemblaggio de novo produce i contigs

Lo scaffolding produce scaffold, o addirittura i cromosomi



Shotgun

ACGTACGTAGCTGACGA

AGCTGACGATCGATCGTAGCTAGCTA

ATCGTAGCTAGCTAGATTACA

AGATTACAGTCTACGTACTATCGA



ShotgunACGTACGTAGCTGACGAAGCTGACGATCGATCGTAGCT

AGCTA ATCGTAGCTAGCTAGATTACAAGATTACAGTCTACGTACTATCGA



ShotgunACGTACGTAGCTGACGAAGCTGACGATCGATCGTAGCT

AGCTA ATCGTAGCTAGCTAGATTACAAGATTACAGTCTACGTACTATCGA

contig



Problema



Problema



Soluzione



Soluzione



Come usare i Mate PairValidazione ScaffoldingGap Filling



Metrica

N50: lunghezza minima di un set di contigs contenenti metà assemblaggio

Generalmente un assemblaggio è molto frammentato



A cosa servono?

Con contig validi è possibile:

Cercare geni (gene prediction)

Lavorare con i geni (cloning, PCR)



Che file ottengo?



Formato FASTQ@N2OAK:00951:07085 ATTCAATAAAATTTTATCATAAATACCGAAATCCATCTAAAATGGTACCCGCTACAACAAAAGTAGTCATGACATGTGCAGGCGTGAGTTTAAGTACGTCTAGTAAAAGCTGGACCAATGACGCAAATAAGTCCGCCTGCCACAAAAGCGATAAGATAATCCA + 5549:55555)555)5::99::29::6555*554:<<=BBB5;;7997=7<;;8885::::09;777<<<;::;:777<;<6;;;;;;;<5:6<</..8888:<<<<2;<991557:7;;?9:557/7<388;45505886::999/55555:5:;5505948 @N2OAK:01697:04302 TCAATAAAATTTTAGTACAATATGCTGCTTATCGGTTAACTCATCTACAAATAATTCTTCAAACTCTAATCGGAGCTTTTGATGGATGCGGGCTTCGATATTGTTTTAGCTCTTGAATCATAGCTGTTTTGGATGTCACTTTTATCACCTTCATAATTAAGATAACTTAAGTATAAAGCAACCTTTATATTAAAACAAGAAAAATCCCATC + 78808855)755)5888;=8===;;;<==8==<;6<9>7;;;<<<<<<<<7<<9=7<<6;;;4;<<<=9=<>;>B?<==4=<==8==<=<>8==9===<:;57777)5:8::>6;=9>=;>;<==?A==4=398<<<=>>>>*0/8;:5;8=;<<8;9>9===>9==7;6;<<;==8===9=6;:089..*.99...).7777(555(393 @N2OAK:03081:06574 CTCAATAAAATTTTATCAATTCGATATTGAAGACTGTTTCTGTGAACATATAACGCTTTTGCTGCCTTGGATGCGTTTAAATTACATTGCATATAGGTCATGAGAGTGCGATAAAACATCCCGGTCAAAGACCGCTTCTTTAAAAGCATCTGAAATAGCGTGAGAGAGTGCAGATGCATCATAACAAATGAACGATGGCAGGCATTGATAAAATGTGGAAGCCCCTGATCTAAGCTTTTCTCGCTT + :;;;57777)555)58994:7=>>===9==7<;<<===8<888=?7;::875/599:@=2<=@<<8<8=8<;;;;<=7<=7=288;;4:<777;::5:9:777:::<::787777)58555/57<=@B69991559599:3:::/5558;;<<=5::;;;;<<<<888;887;=;:;<9////)/7717::4::;::8<?>8<=>8;<====7>;;;7;08888)8:;;;<<8;??@>5=<;://)



Input (sequenze FASTQ)

Tecnologia: Ion Proton

Sequenze: 1.462.220

Basi sequenziate: 247.13 Mbp

Lunghezza media read: 169 bp



Output (FASTA contigs)>contig00001 length=381398 numreads=107891 TTTGGCGAACAGCCGGTCAATCTCTCCCGGCGTCGTTTCTGATTTCGGGCAGCGGTCTGG CGGGCGCGCTGGTGCTGGGCGTCGGGTTGCCGGTCGGACAGAGCCGCGCACAGTCCGCCG CGGCCGCAATGCCAGCCGGTACCCGGGTGCCAGCCTTTCTGGAAATACGCGCGGACAGCT CAGTGAAATTTCTGTCGCCCTTTATTGAAGGCGGGCAGGGGATTTTCACCGCCATGGCGC AGATTGTCGGTGAAGAACTGGACGCCGATCCGGCATCCTTCGTGGTGGAGAACGCGCCGC CTGGTTCGCAATATCAGGTAATGGATAACGGGATGCGCATCACCGGCGGAAGCCAGTCGG TGCGGACCAGCTATACCACCATGCGACGGCTCGGCGCGCTGGCACGACAGATGCTGATCG AGGCCGCTGCCGCTGAACTGGCGGTGCCGGTTACCAGCCTGCACACTGAGCCGGGACGGG TGATCCATGGCGAATCAGGgCGCTCATTACGCTATGGCGAACTGGCTGCGCGGGCGCGTG AGCTGCCGGTACCCTCAGTCGATTCGGTCAGCCTGAAAGATCCCGCTCACTTTCGCTGGA TTGGTAAGCCGGTTCAGCGACTGGATATGCATGAAAAATCGACCGGCAAGGCGATTTACA CCATCGACTGCCGGGTGGATAACATGCTGCACGCGGCGGTACAGCACGCGCCGCGACTCG GTCTGACGGTGGGTACGCTGCGCAATGCCGCACAGGTCAGCGCGATGAAAGGCGTGCATT CGGTTCATCAACTGCCTGGCGCCGTCGCGGTGGTGGCCGAACGCTGGTGGCAGGCGAAAC GTGCGGTTGAAACGCTGCAGGTTGAGTGGCTGGAGCCAGAGAAGCCAGACGGCAGCTATA TGCCCGCTGACTTCTCCTCTGATGCGTTCGCCGCCGTGCTGGCGCAGCAGCCTGGCGACG GGGAAAACGCTGAGGTTCGTGGCGACCTTCAGCACGGACTGGCTGAGGCGAAGAGCACCT TTAGCGCCCACTACCAGAGCCAGTATCTTAACCACGCCCAGCTTGAGCCGCCGTCCGCGC TGGCACGTTTTAATTCCGACGGCTCGCTGGAGTTGTGGATCCCCAATCAGGCACCGGAAA TGTTCCAGGCCGACGTGGCTAAGCGTACCGGCCTCAGCCcGGATAAGATCATTATCCATT CCCCGCTGCTGGGCGGATTTTTTGGCCGTCACTTCCTCTATGAGTCCGCGATGGTCTGGC CACAAGCCGTTCAGCTGGCCAGGGCGGTCGGgCGCCCCGTCAAACTGATCTGGAGTCGTG AAGAGGAGTTCCTGCGCGATACCCATCGCCCGATGGCCGCGGTGCGGTTTCGTGCCGGAC TGGATGCCGACGGCTACCCGCTGGCGCTGGAGGCGGTCAGCATCTGTGAAGGGCCGACCG AGGGGCTGGCCGGTCAGCACGGCGACACGCTGGATCCTACCGCGGTGGAAGGGTTATCGG GCAAAGCCTACGCCATTCCGCACGTTCGTATCGCGCAGATTTATCATAAAGGCCCGGTGC GGCTGGGTTACTGGCGATCGGTCGGCAATTCGATGAATGACTTTTTCTATGAATGCTTCC TCGATGAAATTGCCGAGCGGGGCAGGCTCGATCCGATGGCGCTCAGGCTGCATCTGCTGC

Output: contig, eventualmente in ordine di dimensione (decrescente)



Output summaryFormato: FASTA contigs

Sequenze: 159

Totale basi: 4.97 Mbp (~70X)

Lunghezza media: 31.26 kb

N50: 103 kb



Predizione genicaLa ricerca di regioni codificanti

Viene fatta con modelli matematici, generalmente con un training set

Ci fornisce le coordinate dei geni

Per i batteri Glimmer3



Output di Glimmer3>contig00001 length=381398 numreads=107891 orf00001 381318 42 +1 2.14 orf00003 72 2207 +3 12.84 orf00004 2232 2882 +3 12.45 orf00006 3282 3569 +3 13.34 orf00007 3735 4952 +3 18.89 orf00008 5019 5966 +3 14.28 orf00009 6015 6500 +3 12.14 orf00011 6509 7258 +2 15.23 orf00012 7653 7772 +3 4.67 orf00013 7651 7310 -2 14.63 orf00014 8062 7892 -2 0.92 orf00015 9139 8321 -2 5.61 orf00017 10407 9196 -1 6.34 orf00021 11793 11419 -1 13.01 orf00022 12266 13387 +2 13.84 orf00023 13508 14086 +2 13.78 orf00024 14960 14073 -3 15.20 orf00025 15052 15366 +1 15.60 orf00026 15357 15746 +3 15.27 orf00028 15743 16279 +2 15.66



Come si annotano? Un esempio

>contig00001 length=381398 numreads=107891 orf00001 381318 42 +1 2.14 orf00003 72 2207 +3 12.84 orf00004 2232 2882 +3 12.45 orf00006 3282 3569 +3 13.34 orf00007 3735 4952 +3 18.89 orf00008 5019 5966 +3 14.28 orf00009 6015 6500 +3 12.14 orf00011 6509 7258 +2 15.23 orf00012 7653 7772 +3 4.67 orf00013 7651 7310 -2 14.63 orf00014 8062 7892 -2 0.92 orf00015 9139 8321 -2 5.61 orf00017 10407 9196 -1 6.34 orf00021 11793 11419 -1 13.01 orf00022 12266 13387 +2 13.84 orf00023 13508 14086 +2 13.78 orf00024 14960 14073 -3 15.20 orf00025 15052 15366 +1 15.60 orf00026 15357 15746 +3 15.27 orf00028 15743 16279 +2 15.66

<Hit_num>1</Hit_num> <Hit_id>gnl|BL_ORD_ID|951553</Hit_id> <Hit_def> |27544250|dbj|BAC54899.1| aldehyde oxidase small subunit [Methylobacillus sp. KY4400] </Hit_def> <Hit_accession>951553</Hit_accession> <Hit_len>162</Hit_len> …



Come si arriva fin qui?



E se facciamo lo scaffolding?



Uno scaffold è una lista ordinata di contig

Non aggiunge sequenze nuove…

…ma permette di farlo (Gap Filling)






Minicorsi NGS 14 novembre 2014

Riassumendo









Due esempi



Organismo: microalga (~30Mb)

Obiettivo:studio metabolismo

Correva l’anno: 2009

Approccio misto:454 (shotgun)SOLiD (mate pair)

Contig 43 kb

Scaffolds1.01 Mb



Organismo: batterio patogeno

Obiettivo:confronto con reference


Approccio: Illumina MiSeq (2x300)



Organismo: batterio patogeno

Obiettivo:confronto con reference


Approccio: Illumina MiSeq (2x300)

Assemblaggio

Mapping su reference (regioni coperte)

Mapping su contig delle sequenze non mappate sul reference



Regioni assenti nel reference



Polimorfismi



Unmapped



Perché?



Perché?• Punto di partenza per approfondire

la biologia molecolare (disegno primer, ricerca di geni e promotori)

• Genomica comparata

• Cerco un gene (che non ho trovato)



Lavorare con organismi modello rende la vita più semplice

MA

Sequenziare un genoma non ti mette automaticamente in questa situazione

Perché?



Quali aspettative?



Quali aspettative?



Check listCosa voglio fare? (= che output)

Quando DNA serve?

Che tipi di librerie? Quale strumento?

Che analisi mi servono?Come gestirò l’output?



Domande?



Grazie dell’attenzione

Science

Sequenziamento ed assemblaggio di genomi batterici