20
GVHD :Th.s NGUYỄN PHƯƠNG HOA HVTH : Viện đại học Mở Hà Nội Khoa sau Đại học TÁCH DÒNG GENE

Tách dòng gene

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Tách dòng gene

GVHD :Th.s NGUYỄN PHƯƠNG HOAHVTH :

Viện đại học Mở Hà NộiKhoa sau Đại học

TÁCH DÒNG GENE

Page 2: Tách dòng gene

ĐỊNH NGHĨATách dòng gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một gen, một đoạn DNA cần thiết (DNA ensert) vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện tích hợp để các tế bào chủ phân chia, tạo nên vô số các tế bào cùng mang một đoạn DNA insert giống nhau, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng.

TÁCH DÒNG GENE

Figure : Cloning a gene using a plasmid.(1) Chromosomal DNA of organism A. (2) PCR. (3) Multiple copies of a single gene from organism A. (4) Insertion of the gene into a plasmid. (5) Plasmid with gene from organism A. (6) Insertion of the plasmid in organism B. (7) Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B.

Page 3: Tách dòng gene

ĐỊNH NGHĨA

Vector tách dòng (vector cloning) là một phân tử DNA có kích thước nhỏ cho phép cài gắn một đoạn DNA ngoại lai vào nhằm mục đích nhân đoạn DNA ngoại lai lên với số lượng lớn. Các loại vectơ tách dòng thường dùng: Plasmid, Cosmid, Phage, Phagemid, BAC  (Bacterium artificial chromosomes), YAC (yeast artificial chromosomes)…

VECTO TÁCH DÒNG

Hình 2: Plasmid pGEX-3x là một vector tách dòng phổ biến.

Page 4: Tách dòng gene

ĐẶC ĐIỂM Có khả cài gắn các đoạn DNA

ngoại lai Phải có trình tự khởi đầu sao chép

để có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ.

Có kích thước nhỏ để xâm nhập tế bào chủ

Có thể tái bản độc lập không phụ thuộc vào bộ gen của tế bào chủ.

Có chứa các gen chỉ thị, chọn lọc (gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị màu...)

VECTO TÁCH DÒNG

Page 5: Tách dòng gene

A. Vector tách dòng là Plasmid

Kích thước 1 –5kb, sợi xoắn kép dạngvòng, trong tế bào chất của tế bàovi khuẩn hoặc tế bào nấm men

pBR332 do Bolivar và Rodiguez (1977) thiết kế, có 21 điểm cắt cho các enzym giới hạn, cho phép mang đoạn ADN cài đến 5 kb.

VECTO TÁCH DÒNG

Page 6: Tách dòng gene

A. Vector tách dòng là PlasmidNhiều loại Plasmid nhân tạo ( thế hệ 2 và 3) được tạo nên bằng cách tập hợp các đặc tính quý của plasmid tự nhiên, gắn thêm các gen chỉ thị và đoạn đa cắt nối

tạo nên plasmid mạnh.

VECTO TÁCH DÒNG

Hình : Plasmid thế hệ 2 điển hình pUC18

Page 7: Tách dòng gene

A. Vector tách dòng là PlasmidƯu điểm- Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ.- Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp.- Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh.Nhược điểm- Đôi khi, hiệu suất biến nạp vào tế bào chủ thấp.- Không hiệu quả khi biến nạp ở eukaryote.- Không tách dòng được các phân đoạn ADN kích

thước lớn (> 10 kb

VECTO TÁCH DÒNG

Page 8: Tách dòng gene

B. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ PHAGEKích thước : 15- 25kbPhage bao gồm nhiều loại thức khuẩn có bộ gen DNA mạch đơn hoặc kép sử dụng làm vector tách dòng có nhiều loại: f1, M13, fd… các vector này được tạo nên từ sự cải biến bộ gen phage.

VECTO TÁCH DÒNG

Page 9: Tách dòng gene

B. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ PHAGEƯu điểm:-Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh. Có thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote.- Có thể mang các đoạn cài đến ~ 20 kb.

-Dễ bảo quản do các hạt virut bền ở to lạnh (vd. 4oC).

Nhược điểm:- Kích thước lớn hơn plasmid, nên phân tích phức tạp hơn.- Số bản sao phage hình thành trong mỗi tế bào thấp hơn số bản sao của plasmid.

.

VECTO TÁCH DÒNG

Page 10: Tách dòng gene

C. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ PHAGEMIDMang được đoạn AND cài 20-10kbCấu tạo gồm 1 số gen của plasmid ( gen chỉ thị..) và một phần gen của phage ( đoạn ori, các gen cần thiết cho sự đóng gói)VD: Vector pEMBL8 cấu tạo từ 1 đoạn của phage M13 mang đoạn gen chỉ thị kháng sinh Amp và LacZ từ plasmid

VECTO TÁCH DÒNG

Page 11: Tách dòng gene

D. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ COSMID

- Là véctơ lai của plasmid và và đoạn cos của phage, mang các ưu điểm của hai véctơ này: (1) khả năng tự tái bản số lượng lớn của plasmid, (2) có khả năng đóng gói in-vitro như phage

- Có khả năng mang các đoạn ADN cài có kích thước đến 30 – 50 kb.

VECTO TÁCH DÒNG

Page 12: Tách dòng gene

VECTO TÁCH DÒNGD. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ COSMID

Page 13: Tách dòng gene

VECTO TÁCH DÒNG

E. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ CÁC NHIỄM SẮC THỂ NHÂN TẠO

NHIỄM SẮC THỂ NẤM MEN NHÂN TẠO (YAC) Để có thể tách dòng các phân đoạn gen kích thước lớn ở sinh vật nhân chuẩn có kích thước > 35-45 kb (vd. gen dystrophin ở người có kích thước đến 2000kb), các nhà nghiên cứu đã phát triển được véctơ nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo có thể mang các đoạn cài ADN dài từ 200 đến 500 kb. Véctơ này được tạo ra từ nhiễm sắc thể nhỏ của nấm men được cải tiến di truyền

Page 14: Tách dòng gene

E. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ CÁC NHIỄM SẮC THỂ NHÂN TẠO

NHIỄM SẮC THỂ VI KHUẨN NHÂN TẠO (BAC)Vector BAC cho phép cài gắn đoạn DNA có kích thước 100- 300kb Được thiết kế từ một phân DNA của bộ gen vi khuẩnCấu trúc Vector BAC gồm các đoạn Ori (origin reolication), các gen chỉ thị đặc hiệu, các đoạn đa cắt nối và promoter đặc hiệu

VECTO TÁCH DÒNG

Page 15: Tách dòng gene

TÁCH DÒNG GENE

TÁCH DÒNG IN VITRO

TÁCH DÒNG IN SILLICO

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN

TÁCH DÒNG GEN TỪ DNA

TÁC DÒNG GEN TỪ mRNA

Page 16: Tách dòng gene

TÁCH DÒNG GENE

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN

1. Tách dòng gen in vitroTách dòng in vitro hay tách dòng thực nghiệm là tách dòng gen được thực hiện các mẫu sinh học (mô tếvào, lông tóc, dịch sinh học…), mang các gen cần tách dòng hoặc tổng hợp nhân tạo đoạn gen cần tách dòng

Page 17: Tách dòng gene

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GENTÁCH DÒNG GENE

TÁCH DÒNG GEN TỪ DNA

Chuân bị gen cần tách dòng (gen cần thiết, gen đích - target gene) và

chọn vectơtách dòng.

Tạo vectơ tái tổ hợp.

Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ.

Sàng lọc các dòng tái tổhợp

Nuôi cấy dòng tái tổhợp thu sinh khối và protein tái tổhợp

TÁCH DÒNG GEN TỪ mARN

Tách chiết mRNA

Tổng hợp cDNA mạch kép.

Gắn cDNA mạch kép với các vectơ tách dòng thích hợp, hình thành các vectơ tái tổ hợp. Biến nạp vào tế bào chủ, sau đó sàng lọc các tế bào mang vectơ tái tổ hợp và cấy truyền vào các ống thạch nghiêng tạo nên các dòng khác nhau đuợc tách dòng từ mRNA

Page 18: Tách dòng gene

TÁCH DÒNG GENE

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN

Page 19: Tách dòng gene

TÁCH DÒNG GENE

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN 2. Tách dòng gen in sillico

Tách dòng in silico hay tách dòng ảo (cloning in silico) là sự tổng hợp, phân tích các kết quả tách dòng gen in vitro, trên cơ sở thông tin từ các ngân hàng dữ liệu (STS, EST…) để lựa chọn một đoạn DNA hoặc một gen cần thiết nào đó.

Kết quả tách dòng in silico cho phép lựa chọn phương án thiết kế vectơ tái tổ hợp có hiệu quả, dự toán trước kết quả tách dòng và hiệu quả biểu hiện gen cũng như mức độthành công của thực nghiệm.

Page 20: Tách dòng gene

Cảm ơn quý thầy cô và các bạn đã lắng nghe !