1. Universidad de CaraboboFacultad de Ciencias de la SaludEscuela de Medicina Dr. Witremundo TorrealbaDepartamento de Bioqumica y FisiologaNcleo AraguaElectroforesis y Espectrofotometra Univ. Wilson Torrealba. Univ. Paola Torres. Univ. Andrea Torres.Grupo #08Tcnicas IISeptiembre, 2014.Profesora: Fabiola Sarco-Lira.

2. Agenda Analizar los fundamentos tericos de la Electroforesis y su utilidad: Movimiento inico en un campo elctrico, proceso electrofortico, cmaraelectrofortica, materiales de soporte y utilidad de cada una de ellas. Electroforesis en geles de Poliacrilamida. Electroforesis en geles de Poliacrilamida SDS. Electroforesis Bidimensional. Electroforesis en geles de Agarosa. Aplicar la Ley de Lambert y Beer para determinar la concentracin deun soluto en solucin mediante Espectrofotometra: Fundamentos Tericos de la Espectrofotometra. Espectro de Absorcin. Utilidad. Ley de Lambert y Beer. Curvas de Calibracin. Problemas. 3. ElectroforesisEs una tcnica de separacin que consiste en la migracin de partculas cargadassometidas a la influencia de un campo elctrico, de tal forma que las molculas concarga positiva migran al ctodo (electrodo con carga negativa) y las molculas con carganegativa migran al nodo (electrodo con carga positiva). Mtodo Analtico. Calcular el pesomolecular de unaprotena. Distinguir molculas porsu carga neta o forma. Detectar cambios deaminocidos, de restospolares o no polares yviceversa. Para separarcuantitativamentedistintas especiesmoleculares.Tomado de: Principios deBioqumica Lehninger: Movilidad Electrofortica.E (potencial elctrico): La fuerzaque mueve la macromolcula.V: Velocidad que mueve lapartcula.Z: Carga neta de la molcula.f: Coeficiente friccional. 4. Tomado de: Electrophoresis inPractice, Reiner Westermeier.Electroforesis de Lmite Mvil (movingboundary electrophoresis): Una mezcla deprotenas por ejemplo, se coloca en unaclula de observacin en forma de U llenacon una solucin buffer y al final del cualson introducidos los electrodosArne Tiselius (1902 1971),ganador del premio Nobel deQumica en 1948 por eso y porsu trabajo de los anlisis deabsorcin. 5. Tipos de Electroforesis De Frente Mvil: Las macromolculas de la muestra estn presentes en toda ladisolucin y su posicin se determina en funcin del tiempo por ptica de Schlieren.Esta tcnica analtica ha sido utilizada principalmente para la determinacin de lasmovilidades y puntos isoelctricos de las protenas. Zonal: La muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran atravs de un disolvente, utilizando adems un medio que soporta a ste (tal como elpapel o ciertos tipos de geles). En este caso no se determina la cuantitativa de lamovilidad, sino que el objetivo de esta tcnica se basa en analizar mezclas, la purezade una mezcla y la purificacin de sustancias, y para detectar cambios de movilidad oconformacin. Continua: La muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministracontinuamente a lo largo del proceso. 6. Proceso Electrofortico 7. Cmara ElectroforticaEl dispositivo donde tiene lugar la electroforesis propiamente dicha se denomina cubetaelectrofortica o cmara electrofortica, en l se introducen el medio de soporte de lasmuestras en la que se producir la separacin electrofortica, y el medio o tampn deelectroforesis, que debe encontrarse en contacto con los electrodos (ctodo y nodo) ybaar el sistema.Unidad Horizontal Unidad VerticalUnidad de Varios Geles 8. Materiales de Soporte Papel y Film: Se suelen utilizarpara polisacridos de gran pesomolecular y lipopolisacridos. Acetato de Celulosa: Esprincipalmente usada para anlisisclnicos de rutina y aplicacionesrelacionadas para el anlisis delsuero sanguneo o de isoenzimas. Geles: Los ms utilizados suelenser el almidn (son preparadosdesde la hidrolizacin de elalmidn de una papa), la agarosa(anlisis de molculas de unos10nm de dimetro) y lapoliacrilamida.Tomado de: Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular, DavidFreifelder.Tomado de:Electrophoresis inPractice,ReinerWestermeier. 9. Tintes de Alta MovilidadElectrofortica Verde de Bromocresol. Pironina. Azul de Metileno. Azul de Bromofenol. Xylenecyanol. Naranja G 10. Electroforesis en Geles dePoliacrilamida (PAGE)La poliacrilamida es un polmero que se obtienepor medio de la co-polimerizacin de losmonmeros de acrilamida con un entrecruzadoreactivo (bisacrilamida o N,N'-metilenbisacrilamida). Reemplazaronampliamente a los geles de almidn por su mejorefecto como tamiz molecular, por proporcionar elcontrol del tamao de sus poros y porque nopresentaba una gran adsorcin del materialproteico.Tomado de: Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular, DavidFreifelder.Raymond, S. y Weintraub, L.(1959) 11. Tomado de: Electrophoresis inPractice, Reiner Westermeier. 12. Electroforesis con geles en depoliacrilamida en placa: La polimerizacin del gel selleva a cabo directamente en elaparato. Durante la misma se coloca unmolde de forma adecuada en laparte superior para conseguirlas hendiduras en donde sesituaran las muestras. Despus de la electroforesis, sepuede teir la placa aadiendocolorante al depsito superiorde la disolucin tampn.Tomado de: Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular, DavidFreifelder. 13. Tomado de: Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular, DavidFreifelder.Electroforesis con geles en depoliacrilamida en columna: La polimerizacin del gel tiene lugardirectamente en la columna y esta secoloca entre los depsitos de tampn. La muestra se suspende en unadisolucin concentrada de sacarosa y sedeposita sobre el gel. Despus de la electroforesis, se saca elgel de la columna y se somete a unadeterminada tincin. 14. Electroforesis en Geles dePoliacrilamida SDSTomado de: Electrophoresis inPractice, Reiner Westermeier. El Dodecilsulfato Sdico (SDS por sus siglasen ingls, sodium dodecyl sulphate) es undetergente anionico. Separa las protenas en funcin de su masamolecular. Puede ser usada para la estimacin de la masamolecular de una protena. Se suele usar en combinacin con elmercaptoetanol. Se utiliza con colorantes como el azul deCoomasie. 15. Tomado de: Principios deBioqumica Lehninger1. Se cargan diferentes muestras en lospocillos o depresiones en la partesuperior de un gel de poliacrilamidaSDS.2. Las protenas se trasladan a travsdel gel cuando se aplica un campoelctrico.3. Despus de la electroforesis, sevisualizan las protenas al tratar elgel con Azul de Coomassie y cadabanda de gel representa una protenadiferente (o una subunidadproteica).Electroforesis PAGE SDS para lapurificacin de la enzima ARNpolimerasa de la bacteria E. coli 16. Tomado de: Principios deBioqumica LehningerEstimacin de la masa molecular deuna protena por PAGE SDS: Las protenas patrn de masamolecular conocida se someten alproceso de electroforesis y tincinen el primer carril. La protena de masa moleculardesconocida se somete al procesode electroforesis PAGE SDS ytincin en el segundo carril. Se realiza una grfica del LogM delas protenas marcadoras, lo quepermitir leer la masa molecular dela protena desconocida a travs deella. 17. Enfoque IsoelctricoTcnica variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradientede pH fijado en su estructura y es utilizado para determinar el punto isoelctrico de unaprotena. Adems, al utilizarse en una muestra con distintas protenas, las separa segnsu pI y no su masa molecular como otras tcnicas.http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm 18. Electroforesis BidimensionalMtodo electrofortico que seutiliza para separar protenasde masa molecular idnticaque difieren en su puntoisoelctrico o protenas conpuntos isoelctricos similares,pero diferentes masasmoleculares.Enfoque Isoelctricohttp://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm+Electroforesis conSDS 19. Electroforesis en Geles deAgarosaTomado de: Electrophoresis inPractice, Reiner Westermeier. La agarosa es un polisacrido obtenido de lasalgas rojas. Se utiliza para grandes molculas de ADN yARN, previamente fragmentadas. Se conoce como Electroforesis HorizontalSubmarina. Separa los fragmentos de ADN o ARN deacuerdo con su longitud en pb (nmero depares de base). Se requieren colorantes como Azul deBromofenol y Xileno Cianol. 20. 1. Se aade el tampnelectrofortico enconjunto con el gel deagarosa a la cmaraelectrofortica.2. Luego, se aade lamuestra preparada enconjunto con el tinte yse comienza el procesode electroforesis.3. Se visualizan losfragmentos de ADNmediante luz UV.http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm 21. ESPECTROFOTOMETRA 22. Es Importante hablar dealgunos trminos primeroLuz 23. Es Importante hablar de algunostrminos primeroColor 24. Es Importante hablar dealgunos trminos primeroReflexin 25. Es Importante hablar dealgunos trminos primeroDispersin 26. -Ley de Lambert y BeerLa cantidad de luz que sale de una muestra es disminuidapor tres fenmenos fsicos:1._La cantidad de material de absorcin en su trayectoria(concentracin)2._La distancia que la luz debe atravesar a travs de lamuestra (distancia de la trayectoria ptica)3._La probabilidad de que el fotn de esa amplitudparticular de onda sea absorbido por el material(coeficiente de extincin molar) 27. Instrumentos parala Medicin de la Absorbanciade Luz Visible y Ultravioleta 28. Factores que afectan laspropiedades de Absorcin de unCromforoEfectos del pHEfectos de la PolaridadEfectos de la Orientacin 29. Mximos de Absorcin (mx.) y coeficientes de extincinmolar () a pH neutro de varias sustancias, frecuentes enlos estudios biolgicos.Tomado de Serie de Biologa Fundamental Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular. D. Freifelder 30. Problemas1) Curva de Calibracin:Se realizaron dos diluciones iguales a partir de una muestra problema, al medirla Absorbancia de estas soluciones problema se obtuvo 0,180 y 0,195, lo quepromedia 0,188.Este valor ser el utilizado para calcular la concentracin de la solucin. 31. AbsorbanciaConcentracinInterpolando el GrficoOcon la Ecuacin de laRectaTomando dos puntos:A (1,5 0,05)B (7 0,237)Calcular la concentracin del solutoAB 32. 2) El porcentaje de Tramitancia de una solucinintensamente coloreada es 8,4%Cul es su Absorbancia?3) Una solucin colocada en una cubeta de 1 cmtransmite 50% de la luz de una cierta longitudde onda.Qu porcentaje se transmitira (a) en unacubeta de 4 cm, (b) en una cubeta de 0,5 cm? 33. Referencias BibliogrficasLibros: Freifelder, David. Tcnicas de bioqumica y biologa molecular. 2 ed.Barcelona: Revert, 2003. Nelson, David; Cox, Michael. Lehninger: Principios de bioqumica. 5 ed.Barcelona: Omega, 2007. Roca, Pilar; Oliver, Jordi; Rodrguez, Ana. Bioqumica. Tcnicas y mtodos.Madrid: Helice, 2003. Westermeier, Reiner. Electrophoresis in Practice. 4 ed. Alemania: Wiley-VCH,2005.Pginas Web: Herrez, ngel. Electroforesis de protenas y de cidos nucleicos [en lnea].Madrid, 2009. [Consulta: 14 de Septiembre 2014]. Disponible en:http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm