Técnicas Histológicas – Biologia Celular

Técnicas Histológicas

A técnica histológica visa a preparação dos tecidos destinados ao estudado à microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes.

Visão Geral do Processamento de Tecidos

Os tecidos a serem processados para estudo ao microscópio devem ser preparados de modo a preservar sua estrutura original ao máximo possível. Entretanto, isso não é possível e todos os preparados apresentam artefatos, que são alterações produzidas nas células pelas técnicas utilizadas. Podemos resumir os passos das técnicas histológicas com a seguinte seqüência: fixação dos tecidos, desidratação, inclusão, microtomia (corte em fatias finas), coloração e montagem de lâminas. Essas etapas serão descritas adiante.

OBTENÇÃO DO MATERIAL E FIXAÇÃO

Uma boa preparação histológica se inicia com o uso correto das técnicas de obtenção do material. Os cuidados devem ser observados já no sacrifício dos animais de laboratório para o estudo histológico de seus tecidos. Em se tratando de animais de laboratório o sacrifício pode ser obtido através de técnicas como, traumatismo brusco, intoxicação (overdose de anestésico) e perfusão/imersão.

Objetivos da fixação

Utiliza-se formol a 10%. Esta substância tem como característica evitar o processo de autólise da célula, impedir a destruição do tecido por procariontes, endurecer o material para melhor tratamento posterior e aumentar a capacidade de coloração do material. O tempo de fixação pode variar entre 12 e 24 horas, dependendo do material a ser processado e a sua finalidade posterior.

Material cortado e colocado no cassete para o processamento.

Material em cassetes plásticos e mergulhados no frasco contendo formol a 10%.

DESIDRATAÇÃO , INCLUSÃO E MICROTOMIA

ObjetivosPara a observação ao microscópio de luz a espessura da secção do tecido presente em uma lâmina deve ser delgada o suficiente para que possa ser atravessado por um raio de luz. Para tal os tecidos devem ser criteriosamente preparados para receber um meio endurecedor, ou seja meio de inclusão. Desta forma será possível a obtenção de cortes delgados, obtidos no processo de microtomia.

• Após a fixação com as soluções aquosas de glutaraldeído ou formalina, os tecidos devem ser desidratados, uma vez que a água presente nos tecidos não é miscível em substancias apolares como a parafina e as resinas de inclusão. A desidratação será feita através de imersão numa bateria de soluções alcoólicas em concentrações graduais e crescentes. A graduação pode ser iniciada, se necessário, a partir de 50% e terminando finalmente em álcool absoluto. A graduação nas concentrações é imprescindível para que ocorra a desidratação homogênia dos tecidos, evitando que ocorram danos na estrutura tecidual.

DESIDRATAÇÃO – O material é mergulhado em frascos contendo álcool de concentrações crescentes de álcool a 85%; 95%. Absoluto I, Absoluto II, Absoluto III. O álcool absoluto correponde a 99% de pureza.

Bateria de álcool para desidratação. O frasco 1 corresponde a maior proporção água/álcool e o frasco 5 e menor proporção (absoluto).

DIAFANIZAÇÃO OU CLAREAMENTO – Utiliza-se Xilol para permitir melhor a penetração de parafina na peça, num total de 3 banhos de xilol.

Bateria de frascos com xilol.

Após a diafanização, a amostra é colocada em parafina (microscopia de luz) ou em resina (microscopia de luz e eletrônica) a fim de torná-la rígida e, dessa forma, permitir o corte em lâminas finas no micrótomo. Ao ser imersa em parafina fundida e colocada em uma estufa a 58-60°C, o calor promove a evaporação do xilol e a ocupação dos espaços teciduais por parafina. O tecido embebido por parafina se torna rígido após ser retirado da estufa. Uma das vantagens da resina em relação à parafina é que aquela produz menos artefatos, gerados pela alta temperatura da estufa.

Inclusão

Peças dentro de fracos de vidro contendo parafina no interior da estufa a 60º C dentro

Material já incluído na parafina. O bloco da direita foi processado para ser cortado no micrótomo

MICROTOMIA: Os blocos de parafina são cortados para a obtenção de cortes da material, utilizando-se para isso o aparelho denominado micrótomo. Os cortes tem a espessura de 5 a 6 micrômetros.

BANHO-MARIA”: Os cortes são distendidos em água aquecida a 56º C em aparelho aquecedor com termostato para evitar microdobras no material.

Cortes sobre a água aquecida em "Banho Maria"

PESCAGEM: Consiste em mergulhar a lâmina na água e coletar o material esticado sobre a lâmina. Em seguida a lâmina é colocada sobre uma platina aquecedora para que seja feita a secagem, a fusão da parafina impregnada no tecido e evitar o aparecimento de microdobras

Lâminas de vidro com os cortes já distendidos sobre a platina aquecedora

Coloração com Hematoxilina e Eosina (HE)

Objetivo da coloração

Os cortes de tecidos apresentam-se incolores após a microtomia. A coloração visa contrastar as estruturas teciduais. A ação da maioria dos corantes se baseia na interação entre os radicais ácidos ou básicos dos elementos químicos dos mesmos com os dos tecidos. No entanto existem outros tipos de corantes, como será descrito adiante.

Corantes Ácidos e Básicos

Eosina e Hematoxilina: A hematoxilina é um corante básico que carrega uma carga positiva na porção da molécula que irá conferir cor ao tecido. Corantes básicos reagem com componente aniônicos das células e tecidos, os quais incluem grupos fosfatos, ácidos nucléicos, grupos sulfatos de glicosaminoglicanas e grupos carboxila das proteínas. A habilidade de grupos aniônicos reagirem com corantes básicos é chamada basofilia, estruturas celulares que se coram com corantes básicos são denominadas basófilas. Estruturas celulares que podem ser coradas com corantes básicos incluem heterocromatina, nucléolo, RNA ribossômico, matriz extracelular da cartilagem. A hematoxilina cora geralmente as estruturas em azul. Corantes ácidos reagem com componentes catiônicos das células e tecidos. Quando usados juntamente com corantes básicos como a hematoxilina, coram o citoplasma, filamentos citoplasmáticos e fibras extracelulares. A eosina geralmente cora as estruturas em vermelho ou rosa.

• Outros exemplos:corantes ácidos: fucsina ácida, azul de anilina e orange G; básicos: azul de metileno, verde metil e azul de toluidina.

• Outras técnicas de coloração• Hematoxilina e eosina são corantes adequados para evidenciar

características estruturais, mas eles não são capazes de revelar todos componentes celulares. Outras técnicas de coloração são disponíveis para evidenciar diferentes componentes.

• Coloração pela prata – Algumas substâncias intra e extracelulares promovem a redução do nitrato de prata que formam precipitados negros em estruturas como fibras reticulares dos linfonodos, por exemplo.

• Associação de corantes - É a somatória de corantes diferentes, como o Tricrômico de Gomori, que usa verde luz, cromotropo 2R e hematoxilina

• Após a coloração as lâminas são montadas ou seja, os fragmentos são protegidos pela cobertura com lamínulas de vidro. Esta é colada na lâmina através de substâncias selantes como por exemplo o Entellan. Após a secagem, as lâminas podem ser observadas ao microscópio de luz.

• http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar/plantilla.asp?zona=modtecni

• http://histologiavet.blogspot.com.br/2007/02/etapas-na-preparao-dos-tecidos-ou-rgos.html

• http://bioceletecidual.blogspot.com.br/2014/11/preparacao-de-laminas-histologicas.html

• http://compartilhandoamedicina.blogspot.com.br/2013/12/histologia-tecnicas-de-preparacao-de.html

• http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/histologicabasica.htm