TRABAJO FIN DE CARRERA «Estudio de la diversidad de poblaciones de romero (Rosmarinus sp.) de la Península Ibérica mediante RAPDs»

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TRABAJO FIN DE CARRERA

Estudio de la diversidad de poblaciones naturales de romero (Rosmarinus sp.) de la Península Ibérica mediante RAPDs

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Estudio de la diversidad de poblaciones de Rosmarinus sp. de la Península Ibérica mediante RAPDs AAGGRRAADDEECCIIMMIIEENNTTOOSS

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AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a todas las personas que han colaborado en este trabajo,

principalmente a mis tutoras Dña. Mª Carmen Martín Fernández y Dña. Elena

González Benito por la oportunidad que me han dado de realizar este estudio de

investigación, por su inestimable dirección y las horas que me han dedicado en este

trabajo.

Asimismo me gustaría dar las gracias a todos aquellos que a lo largo de este

tiempo han colaborado en mi formación, en especial a Beatriz Guerra que estuvo

ayudándome durante la fase experimental y a David Draper por la elaboración del

mapa donde quedaron reflejadas las poblaciones recolectadas.

Finalmente, deseo agradecer a mis padres, hermanos y a mi abuela, su apoyo

y confianza en mí.

Estudio de la diversidad de poblaciones de Rosmarinus sp. de la Península Ibérica mediante RAPDs RREESSUUMMEENN

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RESUMEN

El presente trabajo se ha llevado a cabo en el contexto del proyecto de

investigación ‘Recolección, conservación y caracterización de germoplasma de

poblaciones españolas de varias especies de los géneros Rosmarinus y Origanum’

(Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias), en el cual se plantea la

caracterización de la diversidad existente entre las poblaciones silvestres de romero

de España recolectadas y conservadas en el Banco de Semillas de la Universidad

Politécnica de Madrid (UPM).

Los objetivos del estudio han sido la puesta a punto de un protocolo para la

obtención de marcadores moleculares para caracterizar poblaciones de romero

(Rosmarinus officinalis L. y Rosmarinus eriocalyx Jordan & Fourr.), el estudio de la

diversidad interpoblacional y el análisis de factores (geográficos y ambientales) que

puedan explicar el grado de similitud entre las poblaciones estudiadas.

La metodología se basa en la obtención de marcadores moleculares RAPDs

(Random Amplified Polymorphic DNA) mediante el procesado de muestras de hoja

de trece poblaciones españolas de Rosmarinus. El nivel de similitud entre las

muestras estudiadas se analizó a partir de la matriz binaria de datos generada por

los RAPDs. Los análisis de clasificación de las muestras se realizaron por el método

de agrupamiento (UPGMA) y se representaron gráficamente mediante un

dendrograma. El test de correlación de Mantel se utilizó para comprobar el ajuste

de los dendrogramas en la representación del grado de similitud entre muestras, así

como en el análisis de la correlación entre matriz de distancias genéticas y las

matrices de distancias geográficas y ambientales. Finalmente, para estimar la

diversidad genética se utilizó la expresión propuesta por Nei de 1973 y la realización

de un análisis de varianza molecular (AMOVA).

Estudio de la diversidad de poblaciones de Rosmarinus sp. de la Península Ibérica mediante RAPDs RREESSUUMMEENN

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Como conclusiones, la utilización de marcadores RAPDs ha permitido

establecer la singularidad de las poblaciones de las que proceden las muestras de

semillas conservadas en el banco de Germoplasma de la UPM. Existe una elevada

diversidad entre las poblaciones analizadas y también, en la mayoría de los casos,

entre las muestras de una misma población. Los resultados obtenidos también

permitieron detectar un posible error en la determinación de una de las poblaciones

estudiadas que había sido considerada como R. eriocalyx y que sin embargo los

análisis de los marcadores moleculares llevados a cabo parecen indicar que también

se trata de una población de R. officinalis. La falta de correlación observada entre la

matriz de distancias genéticas y las matrices de distancias geográficas y ambientales

refuerza la hipótesis de falta de diferenciación entre las distintas provincias

biogeográficas.

Estudio de la diversidad de poblaciones de Rosmarinus sp. de la Península Ibérica mediante RAPDs AABBRREEVVIIAATTUURRAASS

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Índice de ABREVIATURAS

- AFLP Amplified Fragment Lenght Polimorphism

- AMOVA Análisis de la Varianza Molecular

- d.e. desviación estándar

- dNTPs desoxinucleótidos

- PCR Polymerase Chain Reaction

- RAPD Random Amplified Polymorfic DNA

- RFLP Restriction Fragment Length Polimorphisms

- SSR Simple Sequence Repeats

- pb. pares de bases

- PVP polivinilpirrolidona

Estudio de la diversidad de poblaciones de Rosmarinus sp. de la Península Ibérica mediante RAPDs ÍÍNNDDIICCEE

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ÍNDICE

I. Introducción ..................................................................................................... pág.01

1.1. Descripción botánica y distribución de las poblaciones de romero ……………….. pág.01

1.1.1. Descripción geográfica y hábitat del género Rosmarinus …………….. pág.05

1.1.2. Especies objeto de estudio: R. officinalis y R. eriocalyx ………………... pág.06

1.2. Importancias de las labiadas: usos y cultivo ………………………………………... pág.09

1.2.1. Cultivo del romero ……………………………………….……………… pág.12

1.3. Importancia de la conservación ……………………………………………...…........ pág.14

1.4. Caracterización del material conservado …………………………………………… pág.20

1.4.1. La caracterización vegetal: diferentes enfoques ………………………. pág.22

1.4.2. La caracterización mediante marcadores moleculares ………………... pág.23

1.5. Técnicas moleculares usadas en caracterización de poblaciones …………………. pág.25

1.5.1. Tipos de marcadores moleculares …………………….………………... pág.25

1.5.2. Tipos de ensayos de marcadores moleculares ………………………… pág.26

1.6. Utilización de marcadores moleculares en estudios de poblaciones ……………… pág.33

1.7. Estudios de poblaciones de romero ………………………………………………… pág.34

II. Interés y objetivos …………………………………………………………… pág.35


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III. Material y métodos ……………………….…………………………………. pág.36

3.1. Material vegetal ……………………………………………………………………….. pág.36

3.1.1. Poblaciones estudiadas ………………………………………………………… pág.36

3.1.2. Recolección del material ……………………………………………………….. pág.38

3.1.3. Conservación del material ……………………………………………………… pág.39

3.2. Extracción de ADN ……………………………………………………………………. pág.40

3.2.1. Protocolo de extracción de ADN ………………………………………………. pág.40

3.2.2. Preparación de las soluciones de trabajo (ST) ………………………………… pág.41

3.3. Amplificación del ADN (RAPDs) ………………………………………………………. pág.41

3.3.1. Protocolo de amplificación mediante PCR …………………………………….. pág.42

3.4. Separación de los productos de amplificación por electroforesis ………………….. pág.43

3.4.1. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % en TBE ………………………………. pág.43

3.4.2. Tinción y adquisición de imágenes …………………………………………….. pág.44

3.5. Análisis estadísticos …………………………………………………………………... pág.44

IV. Resultados y discusión ………………………………………………………. pág.47

4.1. Caracterización de las poblaciones de romero ………………………………………. pág.47

4.2. Análisis de agrupamiento …………………………………………………………….. pág.50

4.3. Distancias genéticas ….………………………………………………………………. pág.56


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4.4. Correlaciones entre distancias genéticas, geográficas y ambientales ……………... pág.59

4.4.1. Correlación entre las distancias geográficas y genéticas …………………….. pág.59

4.4.2. Correlación entre las distancias ambientales y genéticas ……………………. pág.60

4.5. Diversidad genética …………………………………………………………………... pág.62

4.5.1. Diversidad genética según Nei ………………………………………………… pág.63

4.5.2. Análisis de la varianza molecular (AMOVA) …………….…………………….. pág.66

4.6. Conclusiones ………………………………………………………………………….. pág.68

V. Bibliografía …….……………………………………………………………... pág.71

VI. Anejos ………………………………………………………………................ pág.78

Anejo I ……………………………………………………………………………………… pág.78

Anejo II ……………………………………………………………………………….......... pág.80

Anejo III ………………………………………………………………………………......... pág.83

Anejo IV ………………………………………………………………………………......... pág.90

Estudio de la diversidad de poblaciones de Rosmarinus sp. de la Península Ibérica mediante RAPDs II.. IInnttrroodduucccciióónn

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1. Introducción

El presente trabajo se ha realizado en el contexto de un proyecto de

investigación que lleva por título ‘Recolección, conservación y caracterización de

germoplasma de poblaciones españolas de varias especies de los géneros

Rosmarinus y Origanum’ financiado por el Instituto Nacional de Investigaciones

Agrarias (INIA).

Dentro de las tareas propuestas en dicho proyecto se encontraba la

caracterización mediante marcadores moleculares de las poblaciones silvestres de

romero recolectadas para su conservación en el Banco de Semillas de la Universidad

Politécnica de Madrid (UPM). La puesta a punto de la caracterización de esas

poblaciones y la obtención de unos resultados preliminares han dado lugar a este

trabajo.

1.1. Descripción botánica (clasificación taxonómica) y distribución de las

poblaciones de romero

El romero pertenece a la familia de las Labiadas (Lamiaceae), que se

encuentra dentro del orden Lamiales, subclase Asteriadae, clase Magnoliopsida,

División Magnoliophyta y reino Plantae (Cronquist, 1981). Todas o casi todas las

plantas de esta familia, consideradas como las plantas aromáticas por excelencia,

tienen el tallo cuadrado y las hojas opuestas, acopladas, una frente a la otra. En

general, las flores se forman a manera de una boca abierta, con ambas quijadas muy

separadas, llamadas labios de la corola: el labio superior, por lo común bilobulado y

algo más corto que el inferior, y éste trilobulado. El cáliz suele estar dividido en

cinco dientes o gajos (tanto iguales como desiguales). Casi todas poseen cuatro

estambres fértiles (una excepción es el romero), adheridos al tubo de la corola, y de

longitud casi siempre desigual: dos estambres largos y dos cortos. Las flores suelen


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agruparse en inflorescencias de unas seis flores, entorno al tallo, y entre cada dos

hojas floríferas de las sumidades florales. El fruto se compone de cuatro

subunidades, que se ven en el fondo del cáliz, verdes y diminutas en la planta

florida; de color más o menos oscuro y endurecidas cuando llegan a la madurez. En

cada subunidad hay una semilla (Font Quer, 1981).

Las Labiadas agrupan a unas 3.000 especies de plantas herbáceas, de las

cuales, casi una décima parte vive en la Península Ibérica, ya que la mayoría de ellas

suelen crecer bien en suelos secos y soleados (Font Quer, 1981). En los países de la

región mediterránea viven unas 1.000 especies silvestres de labiadas

correspondientes a 48 géneros, aproximadamente la cuarta parte en número de

géneros y especies del total mundial (Morales, 2000). Según Flora Europaea existen

41 géneros de labiadas y 449 especies en toda Europa, de las cuales 290 se

encuentran en la Península Ibérica e Islas Baleares (corresponden a 36 géneros

diferentes, aproximadamente la tercer parte del total de la región Mediterránea)

(Morales, 2000). En la Península Ibérica viven 342 taxones de Labiadas (incluidas

subespecies), 11 especies viven en Baleares y 6 de ellas son endemismos de estas

islas. Centrándonos en España (incluidas las islas Baleares), las labiadas son en

general abundantes, pero escasean hasta desaparecer en las regiones húmedas del

norte y noroeste de la Península, desde Galicia al País Vasco.

Las propiedades aromáticas de estas plantas se encuentran en la esencia que

se halla alojada principalmente en las hojas, el cáliz y la corola, en el interior de unas

glándulas redondeadas que se suelen ver como diminutos puntitos brillantes a la luz

del sol, de color áureo o pálido. Cuando se hallan en las hojas, es frecuente que

mirándolas a contraluz aparezcan como otros tantos puntos traslúcidos (Font Quer,

1981).

Los géneros de la familia de las Labiadas se pueden agrupar de acuerdo al

número de especies que engloba cada uno, estableciéndose así tres grandes

grupos: el de los grandes, con más de 20 especies, el de los medianos de 5‐20, y los


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pequeños, con menos de 5 especies. El grupo en el que nos vamos a centrar es el de

los pequeños, ya que en él se encuentra el género en estudio del presente trabajo.

Los 22 géneros pequeños, suman en total 41 especies, de ellas 2 endemismos

ibéricos y uno balear: Ancinos (3), Ajuga (4), Ballota (2), Calamintha (3), Cleonia (1),

Clinopodium (1), Dracocephalum (1), Glechoma (1), Horminum (1), Hyssopus (1),

Leonurus (1), Lycopus (1), Marrubium (3), Melissa (1), Melittis (1), Molucella (2),

Origanum (3), Prasium (1), Prunilla (4), Rosmarinus (3), Timbra (1) y Ziziphora (2)

(Morales, 2000).

La distribución del género Rosmarinus es entorno al mar Mediterráneo

(figura 1). Las tres especies incluidas en el género Rosmarinus son: R. officinalis L.

(figura 2), R. eriocalyx Jordan & Fourr (figura 3) y R. tomentosus Huber‐Morath &

Maire (figura 4). Esta última especie es endémica de una pequeña zona costera

entre las provincias de Granada y Málaga, con una distribución muy restringida y

cuyas poblaciones no se han incluido en este trabajo.

Fig. 1. Distribución del género Rosmarinus sp. Se aprecia la distribución entorno al Mediterráneo, destacando su alta presencia en el norte de África y la Península Ibérica (Fuente: de Bolòs y Vigo, 1995).


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Fig. 2. Rosmarinus officinalis L. Aspecto de las hojas y flores.

Fig. 3. Rosmarinus eriocalyx Jordan & Fourr. Detalles de las hojas y flores.

Fig. 4. Rosmarinus tomentosus Huber‐Morath & Maire. Detalle del arbusto. Presenta hojas dénsamente cubiertas con pelos blanquecinos.


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1.1.1. Distribución geográfica y hábitat del género Rosmarinus

Se distribuye por la cuenca del Mediterráneo, de donde es originario, tanto

en el sur de Europa como en el norte de África y suroeste de Asia, presentándose

tanto en forma silvestre como cultivada. Habita en laderas y collados de tierra baja,

encontrándose también en las proximidades del litoral (Morales, 2000).

El romero, junto con el espliego, son las plantas aromáticas más abundantes

en rodales o matas aisladas, frecuentemente asociado con el tomillo vulgar y

ajedrea, en altitudes desde el nivel del mar hasta los 1.500 m en las montañas más

cálidas, aunque el óptimo, en parte por su carácter de planta termófila, es en

altitudes inferiores a los 1.000 m, sobre todo en zonas bajas y medias, y con

precipitaciones entre 280‐300 y 600 mm anuales (Gónzalez López, 1982; Aberturas

Aguado, 1986).

Según la clasificación fito‐sociológica, dentro de los matorrales calcícolas

está el orden Rosmarinetalia, el cual engloba a romerales, tomillares, salviares, etc.

que se desarrollan sobre suelos bien drenados, formados a partir de sustratos

básicos, no salinos, como son las margas, calizas y dolomías principalmente

(Ferreras y Arozena, 1987; Sanchis Duato et al., 2003).

Aunque la planta del romero es muy plástica, los lugares en que se desarrolla

más favorablemente corresponden a zonas secas, áridas y soleadas, es decir, con

clima moderado, templado o templado‐cálido, más bien con poco agua,

principalmente ambiente de encinar (etapas degradadas por tala o quema, o laderas

pedregosas y erosionadas). El óptimo de estos suelos se produce en la región

mediterránea occidental y últimamente se han expandido notablemente debido a la

degradación de los bosques y de los suelos que en dicha región se daban. Con el

paso del tiempo, este tipo de matorrales se han constituido en comunidades

estables y permanentes (Sanchis Duato et al., 2003). Además, precisa de protección

contra el viento y heladas. Desaparece en las umbrías más frescas, llegando a


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alcanzar las cotas más elevadas en las zonas de solana (López González, 1982;

Morales, 2000).

1.1.2. Especies objeto de estudio: R. officinalis y R. eriocalyx

Al romero se le conoce también como romaní, romeo, erromeru, alecrín,

alecrimzeiro. Según la etimología latina, romero procede de ‘ros’ (rocío) y ‘marinus‘

(mar), en alusión a su aroma y su hábitat próximo al litoral, pues ‘rocío de mar’

parecía indicar el hábitat de una especie típica de la cuenca mediterránea (Mendiola,

1989). La etimología griega le hace proceder de los vocablos ‘rhos’ (arbusto) y

‘myrinos‘ (aromático), característica de la planta, algo que es más acorde con la

realidad que la interpretación anterior, es decir, con su porte y aroma característico.

El nombre específico officinalis expresa o alude a sus aplicaciones farmacéuticas y

medicinales.

Rosmarinus officinalis L. es una planta de tipo subarbustiva o mata vivaz,

leñosa, rústica, erguida o ascendente, siempre verde, que puede alcanzar 2 m de

altura, muy ramificado (de 50‐80 cm de altura y de 1,5‐1,8 m de vuelo o anchura),

con ramas marrones y muchas hojas, con tallos cuadrangulares y algo vellosos

cuando son jóvenes, rodeándose y haciéndose quebradiza su corteza al envejecer,

al mismo tiempo que se pierde el vello. Es además una planta muy aromática y

melífera (Aberturas Aguado, 1986; Mendiola, 1989).

Las hojas son pequeñas, gruesas y estrechas (de 15 a 35‐40 mm x 1,2‐3,5 mm

de longitud), perennes, sentadas, casi lineales, enteras, opuestas, coriáceas,

lanceoladas, lampiñas, con los bordes enteros y vueltos hacia abajo, de color verde

(oscuro e intenso) brillante, ligeramente rugosas por el haz y suaves, con tomento

blanquecino, por su envés. Los pedúnculos y pedicelos son tomentosos‐estrellados.

Tanto las hojas como las flores tienen un olor o aroma intenso, algo picante y, en el

caso de las hojas, un sabor acre (Aberturas Aguado, 1986; Mendiola, 1989).


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Las flores (fig. 5a) son subsésiles, agrupadas en pequeños y cortos racimos

axilares (de las hojas) y terminales (por estar en las cimas de las ramas). Se

desprenden con gran facilidad. El cáliz es de 3‐4 mm de longitud, acampanado,

bilabiado, verde o pulverulento y tomentoso de joven, posteriormente subglabro,

con la garganta desnuda, donde el labio superior es oval, entero, y el inferior con

dos lóbulos lanceolados. La corola es de 10‐12 mm de longitud, de color azul o lila

pálido, a veces rosa y más rara vez blanca; bilabiada, con el tubo saliente, siendo el

labio superior en forma de casco, bífido, y el inferior con tres lóbulos, el central más

ancho y ligeramente cóncavo. Por último, el androceo está formado por dos

estambres únicamente, de filamentos salientes, insertos en la garganta de la corola

y provistos en su base de un pequeño diente, terminados por dos anteras lineares y

con un solo lóbulo (Aberturas Aguado, 1986; Mendiola, 1989).

El fruto es seco, en tetraquenio, con semillas menudas (fig. 5b). Los aquenios

son obovales, sésiles, de color marrón, con cuatro semillas menudas. En el interior

de cada aquenio hay un embrión desprovisto de albúmen, con dos cotiledones

convexos (Aberturas Aguado, 1986; Mendiola, 1989).

a) b)

Fig. 5. Rosmarinus officinalis L. Detalle de las flores (a) y el fruto en tetraquenio (b).

El romero está en flor casi todo el año, aunque la floración es mayor desde

febrero hasta noviembre. Especialmente es más intensa de marzo‐abril a mayo, si


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bien se produce una renovación de la floración durante un amplio período

(Aberturas Aguado, 1986).

El Rosmarinus eriocalyx se diferencia fácilmente por sus inflorescencias

densamente cubiertas de largos pelos glandulares y sus hojas más cortas (5 a 15

mm), lampiñas y verdes; es de ramas grises y presenta mayor porte.

Rosmarinus officinalis L. es una especie de amplia distribución (figura 6), bajo

diversas formas, debido a su alta capacidad de adaptarse a áreas de condiciones

ecológicas muy variables. Esta especie habita principalmente en el contorno de la

región mediterránea. En lo que se refiere a España, se encuentra en las islas

Baleares y en la Península Ibérica. Sólo falta en algunos puntos del norte y noroeste,

siendo especialmente frecuente en las tierras bajas de clima cálido (López González,

2001).

Fig. 6. Distribución aproximada de R. officinalis L. (trazo de líneas continua) en el Mediterráneo occidental, y localidades en que se han encontrado distintos taxones: R. eriocalyx – R. tomensus – R. x mendizabalii – R. x lavandulaceus: 1. var. lavandulaceus; 2. var. noeanus; 3. var trogloditarum; 4. var. subtomentosus; 5. var clementei (Fuente: Rosua,1986).


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La distribución de Rosmarinus eriocalyx Jordan & Tour es mucho más escasa

comparada con R. officinalis L. Se distribuye por distintas regiones áridas y

semiáridas del Mediterráneo (ej. sur de Andalucía y norte de África), pero

principalmente en la zona subcostera de las provincias de Almería, Granada y

Málaga (López González, 2001). En muchas ocasiones se encuentra ligada a

formaciones de Tetraclinis articulata y en otras convive con R. officinalis L., con quien

hibrida con facilidad (Mendiola, 1989).

1.2. Importancia de las labiadas: usos y cultivo

La familia botánica Labiatae, plantas aromáticas por excelencia, ha tenido

siempre gran importancia para el hombre debido a los usos culinario y medicinal, tal

como indica Pío Font Quer en el compendio de El Dioscórides Renovado de plantas

medicinales, donde recopila un total de 62 plantas de esta familia (espliego,

alhucema, lavanda, salvia, toronjil, ajedrea, hisopo, mentas…) de las cerca de 3000

que contiene la publicación (Font Quer, 1981). Uno de los representantes más

conocidos es el romero y es en el que está centrado este trabajo.

Las aplicaciones del romero se basan en sus propiedades, derivadas de su

particular composición química, tanto de las partes enteras (hojas y sumidades

floridas) como de su extracto (aceite esencial) (Font Quer, 1981; Aberturas Aguado,

1986; Mendiola, 1989; Fernández‐Pola, 2001). Además de por su uso medicinal

(industria farmacéutica) y culinario (condimento), el romero es también utilizado en

jardinería (setos ornamentales y aromáticos) y, en el ámbito de la industria

alimentaria, como planta melífera (Font Quer, 1981; Aberturas Aguado, 1986;

Mendiola, 1989; Fernández‐Pola, 2001).

Las hojas y sumidades floridas se utilizan tanto para uso interno como

externo, dependiendo de la forma de aplicación. Las hojas en su uso interno, según

recopila Font Quer (1981) y los autores anteriormente mencionados, preparadas en


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forma de infusión y extracto fluido, son consideradas como estomacales, en la

insuficiencia hepática, espasmolíticas, vulnerarias, tónicas y aperitivas, sedantes,

diaforéticas, emenagogas, antioxidantes y facilita la curación de la ictericia. Además,

las hojas frescas o desecadas a la sombra, cocidas en vino, se utilizan para aumentar

el apetito y favorecer la digestión, como diuréticas, también carminativas e incluso

febrífugas, coleréticas y colagogas (referido sobre todo a la secreción biliar),

pudiendo ser abortivo y tóxico en dosis elevadas (Font Quer, 1981; López González,

2001). En lo que se refiere a su uso externo, tanto hojas como sumidades floridas se

utilizan como cicatrizantes, desinfectantes y como antirreumáticas. En cuanto a la

cocina, por su sabor penetrante, el romero se emplea como condimento de asados

de carnes, pescados, parrilladas y caza, salsas, etc (Mendiola, 1989; Fernández‐Pola,

2001).

El aceite esencial es utilizado fundamentalmente por las industrias de

cosmética y de perfumería; en esta última, tanto para colonias (ya que mezcla muy

bien con otros aceites), como para aromatizar jabones, insecticidas domésticos,

desodorantes, ambientadores, detergentes, etc, no sólo por su olor fresco sino por

su facilidad de enmascarar los olores de alquitrán y fenoles. También es utilizado,

con carácter medicinal, como analgésico (en usos interno y externo),

antiespasmódico, detersivo, cicatrizante, y estimulante. Del romero se obtiene

aproximadamente un 2% de aceite esencial, cuya composición depende de la época

del año y de la zona en que se recolecte el romero (Mendiola, 1989; Fernández‐Pola,

2001).

En el aceite de romero se han descrito hasta 53 componentes diferentes,

siendo los compuestos más frecuentes: α‐pineno, canfor, 1,8‐cineol, canfeno (o

eucaliptol), borneol, β‐pineno, verbenona, β‐cariofileno, limoneno (hidrocarburo

aromático), α‐terpineol, mirceno, p‐cimeno, acetato de bronilo, linalool y terpinen‐4‐

ol (Salido, et al., 2003), componentes fenólicos (mentol, timol, pulegona, esclarol,

carvacrol, piperitona), pigmentos flavónicos, flavonglucósidos (apigenina y

luteolina), ácidos fenólicos (cafeico, clorogénico, neoclorogénico, rosmarínico,


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gálico, gentísico, siríngico) y una lactona diterpénica llamada picrosalvina o carnasol

(amarga, que en el proceso de destilación se transforma en el ácido carnosólico, no

amargo), una resina y ácidos orgánicos, junto con pequeñas cantidades de

rosmaricina (alcaloide), ácido ursólico, taninos, azúcares y elementos minerales (Na,

K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn y Mn) (Mendiola, 1989; Hidalgo et al., 1998; Fernández‐Pola,

2001; Del Bano et al., 2003; Almela et al., 2006; Moreno et al., 2006). Otros

componentes se encuentran en cantidad inferior al 2% (Atti‐Santos et al., 2005;

Carvalho et al., 2005; Ramírez et al., 2006).

El ácido rosmarínico extraído del romero posee una fuerte actividad

antioxidante que recientemente está siendo utilizada por la industria alimentaria. El

extracto de romero (extracto supercrítico) es uno de los componentes de la

patente Vidalim1 ® para el desarrollo de productos cárnicos funcionales, donde es

añadido por su capacidad antioxidante para preservar la relación de ácidos grasos

poliinsaturados omega‐6/omega‐3 introducidos en la composición de una conocida

marca de productos cárnicos española (Frial, S.A.).

En esta línea, la compañía eslovena Vitiva ha desarrollado un concentrado del

ácido rosmárinico en forma soluble en agua, dirigido al mercado de suplementos

dietéticos, cosméticos y productos alimenticios (una pureza del 5 al 70%). Este

ingrediente se considera de interés por su capacidad antioxidante, la cual puede

ejercerse tanto en alimentos evitando la oxidación de algunos de sus componentes

de interés nutricional, pero fácilmente oxidables, como para prevenir el daño celular

causado por radicales libres, que se generan de forma fisiológica en el metabolismo

aerobio de los seres vivos. Otra actividad de interés del ácido rosmarínico es su

capacidad antiinflamatoria, ya que procesos de este tipo están implicados en gran

número de enfermedades (asma, cardiovasculares, reumáticas) (Abramovic y

Abram, 2006).

1 Pertenece a un grupo de investigación de la Universidad Autónoma de Madrid y el grupo Frial (noviembre, 2005). Premios Mejor Empresa Alimentaria Española – Edición 2005. Dossier de prensa. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (www.mapya.es).


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1.2.1. Cultivo del romero

La densidad de plantación óptima varía de 15.000 a 20.000 pies/ha. Respecto

a las labores culturales a realizar, son relativamente fáciles: araduras, riegos

moderados, escardas y acepta la poda sin ningún problema. En inviernos fríos se

debe proteger. Para impedir que germinen las semillas de las malas hierbas se

emplean diferentes herbicidas (ej. Linuron), que no deben usarse si la hoja va

destinada a herboristería (Muñoz, 1987; Mendiola, 1989; Fernández‐Pola, 2001). La

multiplicación – propagación puede hacerse por semilla y vegetativamente,

mediante esquejes, división de pies y acodos.

El romero es un cultivo poco exigente en cuanto a fertilización. En un cultivo

bien dirigido se impone un aporte bien fermentado en la labor preparatoria del

terreno de invierno, junto con otra labor a finales de primavera. Cabe reseñar que,

como planta poseedora de aceite esencial, requiere gran cantidad de azufre

(Muñoz, 1987; Mendiola, 1989; Fernández‐Pola, 2001).

La recolección puede realizarse mecánicamente. Mientras las hojas pueden

ser recolectadas en cualquier época del año (óptimo al final de verano) desde el

segundo o tercer año, las flores son recolectadas inmediatamente antes de la plena

floración. El secado se hace a la sombra, de forma extendida y sin exceder los 35ºC.

Las hojuelas se separarán de los tallos después del secado. Se suele destilar la planta

entera, salvo en las regiones muy secas, que sólo se hace con las ramas tiernas y

floridas. Las plantas recolectadas por la mañana temprano son más ricas en aceite

esencial que las cortadas por la tarde (Aberturas Aguado, 1986; Muñoz, 1987;

Mendiola, 1989; Fernández‐Pola, 2001).

Respecto al apartado de las enfermedades, se cree que el amarillamiento de

algunas ramas, seguido del desecamiento de la planta, es debido a la presencia de

nemátodos, aunque en la mayoría de los casos, el responsable es el frío. Otro

organismo que ataca a tallos y hojas, es un coleóptero parásito (Chrisolina americana


P á g i n a | 13

L.), el cual se combate eficazmente con Actellic 50‐E. El tiempo de duración de un

cultivo es de unos 10‐12 años, pero conviene renovarlo cada 5‐7 años. Los

rendimientos en hojas secas son del 20 al 25 % de la producción de planta fresca, de

la que se obtiene aceite esencial entre el 0,5 y 0,6 % (Muñoz, 1987; Mendiola, 1989;

Fernández‐Pola, 2001).

En cuanto a la comercialización, la demanda de hojas se satisface con plantas

de flora espontánea. En España, las principales provincias productoras son Murcia,

Granada y Jaén. La demanda de aceite esencial es baja y estabilizada, pero el aceite

esencial obtenido de cultivo no puede competir con el del silvestre ni con el del

Norte de África. A pesar de la gran importancia comercial del género, todavía hay

mucha necesidad de información en cuanto a su cultivo, recolección y manejo del

germoplasma. Consecuentemente, el grado de erosión no es bien conocido. Varias

especies de Rosmarinus están en la lista de especies raras, amenazadas y endémicas

de Europa. Varias instituciones a lo largo del mundo recogen material genético de

Rosmarinus, especialmente para fines de investigación.

El conocimiento de la amplia diversidad morfológica y química del género

Rosamarinus y la distribución nativa de sus diferentes taxa es esencial para mejorar

la explotación de este cultivo muy prometedor. El romero es un cultivo en el que la

mejora genética resulta interesante debido a su alta heterogeneidad química y

fisiológica. La mejora de cultivos es altamente recomendable teniendo en cuenta su

amplio rango de usos y las grandes dificultades que el hecho de que el material no

sea uniforme puede causar al sector. Teniendo en cuenta tanto a los productores

como a los consumidores, los esfuerzos de cualquier programa de mejora del

romero, deben estar dirigidos a mejorar los siguiente objetivos: parámetros

relacionados con el rendimiento (ej. hábito de crecimiento), desarrollo rápido de las

plantas jóvenes, ramificación, ratio hoja/tallo, tolerancia ante diversos factores

ambientales (salinidad y frío), resistencia a patógenos o enfermedades y

parámetros relacionados con la calidad (ej. mejores características aromáticas,

contendido y composición en aceite esencial, propiedades antioxidantes y


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antimicrobianas). Para lograr estos objetivos las herramientas más adecuadas para

la mejora del cultivo son los métodos de selección e hibridación, combinados con

controles analíticos de la variabilidad encontrada en el material. Para poder ir más

allá, investigando en estas especies, se requiere de la aplicación de la biotecnología

en esta área, con la finalidad de obtener nuevas variedades. Para llevar a cabo esta

tarea y desarrollarla en profundidad, además de los caracteres de tipo fisiológico‐

agronómico que debe poseer cualquier nueva variedad para distinguirla de otras del

mismo cultivo ya existentes, es necesario utilizar otros caracteres morfológicos y

moleculares, que hagan más sencilla esta diferenciación, sin necesidad de recurrir a

su cultivo en campo, que es donde se muestran las características fisiológico‐

agronómicas. En todos estos procesos interesa la búsqueda de marcadores

(morfológicos o moleculares), es decir, caracteres que resulten ser fácilmente

observables y se encuentren estrechamente ligados, desde el punto de vista

genético, a una característica agronómica de interés (Muñoz, 1987; Mendiola, 1989;

Fernández‐Pola, 2001).

1.3. Importancia de la conservación

Desde el inicio de la agricultura, el hombre ha domesticado especies

vegetales para su aprovechamiento y ha seleccionado a lo largo de las generaciones

aquellos caracteres que mejor se adaptaban a sus necesidades. Simultáneamente

con el proceso de domesticación y diversificación, ha existido una constante

preocupación por la conservación de los recursos biológicos disponibles, sin

embargo, la conciencia de la erosión genética como un problema a escala mundial

no ha tenido lugar hasta bien entrado el siglo XX. A comienzos de dicho siglo, la

mayor parte de la población humana utilizaba técnicas de producción agraria que no

habían variado sustancialmente durante los últimos mil años, pero en unas pocas

décadas, la agricultura experimentó una profunda transformación que permitió

incrementar de forma espectacular la productividad alimentaria. La conocida

‘revolución verde’ fue consecuencia de la aplicación masiva de fertilizantes, la lucha


P á g i n a | 15

química contra plagas y enfermedades y la progresiva mecanización de las

actividades agrícolas, sin olvidarse, de que el principal factor fue la introducción de

cultivares vegetales cuidadosamente seleccionados por procedimientos de mejora

genética. De esta forma, se ha producido una doble erosión genética de las plantas

cultivadas: por un lado se ha reducido ostensiblemente su número y se han

conservado solamente aquellas en las que se han realizado programas de mejora, y

por otra parte, se ha reducido drásticamente el número de cultivares por especie

(Iriondo Alegría, 2001; Scarascia‐Mugnozza y Perrino, 2002).

Actualmente, los recursos fitogenéticos se encuentran en grave peligro de

extinción al ser sustituidas las variedades locales por variedades más productivas y

resistentes a diferentes tipos de estrés. Estos recursos contienen la variabilidad de

la información genética que las variedades productivas y resistentes modernas no

tienen, por lo que las variedades locales son necesarias para la creación hoy,

mañana y en los sucesivos años de nuevas variedades en un futuro. El concepto

clásico de recursos fitogenéticos incluye el material de reproducción o de

propagación vegetativa de variedades cultivadas, cultivares en desuso, cultivares

primitivos, especies vegetales silvestres emparentadas con cultivares, estirpes

genéticas especiales (entre ella las líneas y mutantes selectos de los mejoradores) y

especies de malas hierbas. Si se tiene en cuenta que con los conocimientos actuales

se permite hoy utilizar genes procedentes de cualquier ser vivo en los programas de

mejora de especies cultivadas, todas las especies vegetales, cultivadas o silvestres,

deben ser consideradas como recursos fitogenéticos. Por tanto, los recursos

fitogenéticos constituyen una auténtica garantía de la seguridad alimentaria

mundial ya que son fuente insustituible de características tales como la adaptación a

condiciones ambientales, la resistencia a enfermedades y plagas, los tratamientos

agronómicos, la calidad nutritiva y, principalmente, la productividad, aspecto

importante ante el crecimiento continuo de la población mundial. La reducción de la

base genética conlleva un aumento en la vulnerabilidad de los cultivos ante

inesperados cambios ambientales o a la aparición de nuevas plagas y enfermedades

(Nevo, 1998; Iriondo Alegría, 2001; García Olmedo et al., 2001).


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La toma de conciencia sobre la magnitud de los problemas mencionados ha

derivado en el desarrollo de iniciativas destinadas a contrarrestar la pérdida de

biodiversidad tanto en el ámbito de las plantas cultivadas como en el de las plantas

silvestres. La actual alarma global de crisis y extinción de la biodiversidad afecta

negativamente a la biosfera. La conservación de la biodiversidad es una de las

herramientas posibles para paliar el agotamiento de la biosfera por parte de los

humanos. La diversidad genética, la base de la evolución por selección natural, está

gravemente afectada en las especies emparentadas de las plantas cultivadas y su

exploración, evaluación, conservación in situ y ex situ es imprescindible para poder

garantizar un desarrollo sostenible (Nevo, 1998). En este contexto, la conservación

se define como la gestión de la utilización humana de la biosfera para que pueda

aportar el máximo beneficio sostenible a las generaciones presentes y futuras

(Tratado internacional sobre los recursos fitogenéticos para la alimentación y la

agricultura, www.fao.org).

La conservación puede realizarse, al menos teóricamente, a tres niveles de

organización: génica, organísmica y ecológica. Tradicionalmente, los métodos de

conservación se clasifican en dos grandes grupos: métodos de conservación in situ y

métodos de conservación ex situ. Los métodos de conservación in situ, permiten la

conservación de las especies en los entornos ecológicos naturales y culturales en los

que han desarrollado sus propiedades específicas. Por el contrario, la conservación

ex situ implica la conservación de las especies fuera de sus respectivos entornos,

llevándose esto a cabo, en el caso de las especies vegetales, bien a través de

colecciones de plantas (jardines botánicos y colecciones de plantas en campo) o de

bancos de germoplasma (Iriondo Alegría, 2001; Scarascia‐Mugnozza y Perrino,

2002).

Los jardines botánicos pueden considerarse las primeras instituciones

implicadas en la conservación ex situ de recursos fitogenéticos. En la actualidad hay

cerca de 1500 jardines botánicos por todo el mundo, de los cuales unos 800

desarrollan actividades de conservación. Las colecciones de plantas en campo,


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conjunto de individuos de una misma especie seleccionados para que sean

representativos de la variabilidad genética existente, son particularmente

apropiadas para especies perennes que tardan años en producir semillas (ej.

especies forestales), especies que se reproducen exclusivamente de manera

vegetativa o para la conservación de plantas cuyas semillas no pueden ser

fácilmente almacenadas (ej. cultivos tropicales).

Los bancos de germoplasma son centros orientados al almacenamiento de

una gran parte de la variabilidad genética correspondiente a una determinada

especie o cultivar. Dentro de esta categoría podemos distinguir los bancos de

semillas, bancos de cultivo in vitro y bancos de genes o bancos de ADN. El

almacenamiento del material a conservar en forma de semillas – bancos de semillas

– constituye uno de los procedimientos de conservación ex situ más válidos y

extendidos en la actualidad, que permite mantener un gran número de semillas de

especies cultivadas durante largos períodos de tiempo y con un mínimo riesgo de

daños genéticos. Las semillas presentan una serie de características que hacen que

el almacenamiento sea el método más eficaz y económico para la conservación ex

situ de especies vegetales. Por un lado, las semillas, son unidades adapatadas a al

dispersión en el tiempo, y por tanto, capaces, en la mayoría de los casos, de

permanecer viables, de forma natural, durante largos períodos de tiempo; en

segundo lugar, su pequeño tamaño, unido a la posibilidad de que cada una de ellas

posea una constitución genética diferente, asegura la conservación de una gran

diversidad genética en un espacio reducido. Sin embargo, esta técnica no es

aplicable a todas las especies vegetales ya que las semillas de un número

considerable de especies no sobreviven a estas condiciones de almacenamiento

(semillas recalcitrantes). Si bien, la mayoría de las especies silvestres y de los

cultivos de las zonas templadas del planeta forman semillas ortodoxas, por lo que

pueden ser conservadas en bancos de semillas, con condiciones de temperatura y

humedad bajas (Iriondo Alegría, 2001).


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Una alternativa a los bancos de semillas, es la crioconservación, que permite

almacenar el material vivo a muy bajas temperaturas (en general a menos de ‐130

ºC). Las principales ventajas de la crioconservación sobre otras técnicas radican en la

ausencia de controles complicados de humedad y temperatura, la inexistencia de

daños de plagas y patógenos en las colecciones y, en teoría, en una viabilidad del

material vegetal sin límites temporales y sin daños genéticos, lo que permite, en

principio, reducir o eliminar la realización de controles periódicos de viabilidad.

Otra posibilidad para la conservación, es la aplicación de las técnicas de

cultivo in vitro, utilizada en los casos de especies con semillas recalcitrantes,

especies que no producen semillas o con producción reducida de semillas, especies

con ciclos de vida muy largos que no producen semillas hasta que la planta alcanza

su madurez al cabo de muchos años y clones con elevado grado de heterocigosis

que han sido seleccionados y mantenidos por el agricultor mediante propagación

vegetativa. Las ventajas de las técnicas de cultivo in vitro son principalmente la

obtención de elevadas tasas de multiplicación, el carácter aséptico del cultivo, el

reducido espacio ocupado por las colecciones, la reducción del riesgo de pérdidas

de material debido a catástrofes naturales y sus múltiples aplicaciones en

programas de mejora genética. Entre los inconvenientes que conlleva la utilización

de esta técnica se puede mencionar el elevado coste de infraestructura, la

necesidad de personal cualificado y los riesgos de alteraciones genéticas durante el

cultivo (variación somaclonal).

Con el avance de las técnicas de ingeniería genética que, en principio,

permiten la transferencia de genes entre especies totalmente distintas,

pertenecientes incluso a distintos reinos, se ofrece una nueva alternativa, la

instalación de bancos de ADN. En los bancos de ADN se procede a la extracción del

ADN procedente de individuos de una determinada especie o cultivar y

posteriormente, el ADN extraído se conserva a bajas temperaturas (cámaras

congeladoras a ‐80ºC o tanques de nitrógeno líquido). En la actualidad, esta

alternativa se utiliza en el caso de especies o cultivares cuyo genoma ha sido


P á g i n a | 19

estudiado en detalle y donde se conocen las secuencias de numerosos o

importantes genes (Iriondo Alegría, 2001).

La conservación in situ de especies cultivadas supone el mantenimiento de

variedades tradicionales por parte de los agricultores, bien porque existe una

subvención económica a las prácticas tradicionales, o porque determinadas

variedades tradicionales o de especies en desuso resultan competitivas en ámbitos

locales gracias al desarrollo y promoción de sus productos ligados a valores

culturales de la zona. En el caso de la conservación de especies silvestres, la solución

idónea consiste en la protección de los ecosistemas en donde habitan las especies

consideradas (conservación in situ), si bien, en muchas ocasiones, la degradación o

destrucción del hábitat natural hace que la conservación ex situ en bancos de

germoplasma constituya la única alternativa posible.

La conservación in situ implica una adecuada protección y gestión de los

ecosistemas naturales. Existen numerosas formas para proteger los espacios

naturales de la actividad humana, sin embargo, estas medidas no resultan siempre

suficientes para asegurar la supervivencia de las especies a conservar. En todo

momento, la conservación ex situ de especies silvestres constituye una herramienta

de apoyo fundamental para las operaciones de conservación in situ, al tiempo que

cumple una función de seguro ante la destrucción de las poblaciones naturales. Los

programas de conservación ex situ suplementan la conservación in situ

proporcionando almacenamiento a largo plazo, análisis, ensayos y métodos de

propagación de especies amenazadas y sus propágulos.

Para llevar a cabo una gestión adecuada de la conservación in situ resulta

necesario recavar previamente una gran cantidad de información básica sobre la

especie a proteger y su ecosistema. Una parte fundamental del proceso de

conservación son los procedimientos de documentación, caracterización y

evaluación del material conservado. La documentación hace referencia al conjunto

de datos que identifican cada muestra y describen la localización y características


P á g i n a | 20

del lugar de recolección así como la ubicación presente del material conservado. Los

descriptores juegan un papel importante en la caracterización y evaluación del

material conservado y se definen como características o propiedades de una

muestra que son identificables y medibles. En el proceso de caracterización se

utilizan descriptores que permiten una fácil y rápida discriminación entre fenotipos.

Se suelen utilizar caracteres que poseen un fuerte componente genético y que son

independientes de las condiciones ambientales. La utilización de marcadores

moleculares (ej. isoenzimas, RFLPs, RAPDs, AFLPs, SSRs) es muy recomendada en

estos casos (ver más adelante). En el proceso de evaluación los descriptores están

relacionados con caracteres que son útiles en la mejora del cultivo y que, a menudo,

dependen de las condiciones ambientales, tales como productividad y

susceptibilidad a diferentes tipos de estrés (Iriondo Alegría, 2001).

La conservación activa de los recursos fitogenéticos ha aportado ya

importantes beneficios a la agricultura. La conservación y evaluación de la

diversidad biológica vegetal no sólo aporta beneficios en el área de la producción

alimentaria, sino que puede contribuir sustancialmente a otras áreas de la actividad

humana, como la medicina o la industria. En la actualidad, el 25% de los

medicamentos de la industria farmacéutica tienen como principio activo

compuestos procedentes de plantas, mientras que en los países en desarrollo, el

80% de los fármacos son de origen vegetal. Muchos de los compuestos que se

emplean en investigación clínica proceden de material vegetal por lo que los

esfuerzos que se realicen en la conservación de recursos fitogenéticos serán

altamente rentables para la sociedad.

1.4. Caracterización del material conservado

La caracterización de las especies permite abordar el análisis de la diversidad

genética de una determinada especie, teniendo como objetivo el conocimiento de

la diversidad tanto a nivel interpoblacional como intrapoblacional. Ello resulta


P á g i n a | 21

fundamental a la hora de diseñar estrategias de conservación vegetal in situ y ex

situ. Para aumentar las probabilidades de éxito en el mantenimiento de especies a

través de programas de conservación, en la conservación in situ deberían

protegerse, de entre todas las áreas en las que habite la especie, aquellas que

presenten mayor diversidad genética, y en lo referente a la conservación ex situ, la

recogida de germoplasma vegetal deberá realizarse en las mismas zonas.

Sin embargo, este aspecto no solamente tiene interés desde el punto de

vista conservacionista, ya que la domesticación de especies silvestres con la

finalidad de poder ser utilizadas y/o aprovechadas por el ser humano, requiere

también un exhaustivo estudio de la biodiversidad existente en las poblaciones

naturales, con el objetivo de identificar aquellas que mejor se adaptan al cultivo.

Esta diversidad genética puede analizarse utilizando caracteres morfológicos,

generalmente cuantitativos, o bien utilizando marcadores moleculares (González‐

Andrés, 2001).

Otra finalidad de la caracterización es poder llevar a cabo una correcta

gestión de los bancos de germoplasma, para lo que es necesario evitar duplicados, e

identificar las sinonimias (el mismo material con diferentes nombres) y homonimias

(materiales diferentes con el mismo nombre). En este caso se trata de identificar

como igual o diferente, respectivamente, accesiones que pertenecen a la misma

especie, y con frecuencia a la misma variedad, como cuando se trabaja con clones

de cierta variedad. Por tanto es necesario buscar e identificar las características que

diferencien a materiales por otra parte tan similares. Los métodos de

caracterización que permiten evaluar estas diferencias con mayor fiabilidad están

basados en la utilización de marcadores moleculares (tanto isoenzimas como

marcadores de ácidos nucleicos), si bien en los últimos años las técnicas más

empleadas son las basadas en el estudio del ADN.


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1.4.1. La caracterización vegetal: diferentes enfoques

Los estudios de caracterización pueden estar basados en distintos tipos de

caracteres. Centrándose en las condiciones en las que se desarrollan los individuos,

los caracteres ecológicos analizan el hábitat, los parásitos, los alimentos, las

variaciones estacionales, etc., mientras que los geográficos hacen referencia entre

otros a la distribución de las especies, a las relaciones entre las poblaciones, tanto

de simpatría como de alopatría, etc (González‐Andrés, 2001).

Por otra parte, en el estudio directo de los organismos se pueden distinguir

los caracteres de tipo: morfológicos, citológicos, bioquímicos, embriológicos y

basados en el ADN. Los caracteres morfológicos son los más clásicos y estudian

cualquier órgano de la planta desde el punto de vista cualitativo (formas, colores,

presencia de estructuras singulares, etc) o desde el punto de vista cuantitativo.

Los caracteres citológicos se centran fundamentalmente en el estudio del

núcleo celular, en especial el número de cromosomas. Son los bioquímicos quienes

abarcan o incluyen el estudio de metabolitos del metabolismo principal y secundario

de las plantas, fundamentalmente los basados en compuestos de bajo peso

molecular (flavonoides, alcaloides, aminoácidos no proteicos, aceites esenciales) y

los basados en el estudio de proteínas (proteínas totales, isoenzimas).

Los embriológicos están basados en el desarrollo embrionario de los

individuos, siendo los basados en el estudio del ADN los que incluyen a todos los

marcadores moleculares basados en la secuencia primaria del ADN.

En el siglo XX se ha asistido a un espectacular crecimiento de los estudios

bioquímicos en plantas y a su aplicación en taxonomía, identificación y filogenia. En

la actualidad la caracterización con marcadores moleculares ha cobrado gran

predominio y protagonismo, aunque no por ello las técnicas basadas en la

morfología quedan obsoletas ni han sido desechadas. Existen posturas extremas a


P á g i n a | 23

favor de un sistema u otro, pero en la actualidad hay gran cantidad de pruebas que

indican que ambos tipos de estudios son complementarios, y la integración de los

resultados obtenidos por ambos medios enriquece de manera notable las

conclusiones que puedan extraerse y contribuyen a una aproximación más exacta a

la realidad (González‐Andrés, 2001).

La clasificación de organismos y los estudios filogenéticos pueden ser

abordados desde dos perspectivas: la escuela cladística y el feneticismo. La escuela

cladística defiende que las relaciones existentes entre los organismos no pueden ser

deducidas a partir de cualquier similitud que presenten, sino que esas relaciones son

un reflejo de una serie de caracteres que sólo serán compartidos por dos o más taxa

que desciendan de un ancestro común.

El feneticismo entiende que la caracterización deber abordarse sobre

diferentes partes de la planta, en diferentes estados fisiológicos de las mismas, y

con diversos tipos de caracteres, debiéndose analizar todos ellos en conjunto,

otorgándoles a priori la misma importancia.

Con el desarrollo de las técnicas estadísticas de análisis multivariante, y de

los programas informáticos para llevarlos a cabo con rapidez y precisión, el

feneticismo ha encontrado el soporte técnico necesario para establecerse

sólidamente en el campo de la sistemática. Dicho soporte técnico permite analizar

cientos de caracteres simultáneamente y de una manera rápida.

1.4.2. La caracterización mediante marcadores moleculares

Se consideran marcadores moleculares todos aquellos basados en moléculas

biológicas, es decir todos los bioquímicos que engloban compuestos de bajo peso

molecular (flavonoides, alcaloides, terpenoides, etc.) y proteínas (proteínas totales,

isoenzimas), más los basados en la molécula de ADN.


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Frente a la metodología clásica de la caracterización basada en morfología,

fisiología y embriología, los marcadores moleculares presentan, entre otras las

siguientes claras ventajas: detectan mayor variabilidad, no son susceptibles de estar

afectados por el ambiente (sólo los basados en la molécula de ADN) y, valorados de

forma conjunta con los caracteres morfológicos (como resultado final de una serie

de rutas metabólicas complejas e interconectadas, controladas por un elevado

número de genes e influidas por factores externos), se pueden obtener mejores

resultados que con métodos independientes cuando se valora la herencia poligénica

(Torres Lamas, 2001).

El marcador molecular ideal, debe de tener las siguientes cualidades: 1) ser

polimórfico – presentar diferente expresión en las diferentes unidades taxonómicas

operativas a analizar. Así, por ejemplo, los isoenzimas son menos polimórficos que

los marcadores basados en ADN; 2) ser específico de un determinado locus – lo que

quiere decir que cada banda corresponda a un único locus, ya que con frecuencia en

determinados marcadores moleculares basados en ADN se da el problema de la “no

homología”, es decir, que bandas correspondientes a fragmentos de igual movilidad

electroforética, corresponden a diferentes loci. Este problema es tanto mayor

cuanto más alejados filogenéticamente se encuentren las unidades taxonómicas

operativas; 3) heredable y preferentemente con herencia codominante – es decir,

que cuando en un individuo se presentan dos alternativas alélicas de un locus,

ambas se manifiesten. Esto permite diferenciar homocigotos de heterocigotos, y

permite calcular las frecuencias de cada uno de los alelos en cada uno de los loci; 4)

estar ampliamente distribuido en el genoma – cuando lo que se pretende conocer

es la diversidad genética existente en un taxón, o bien establecer las relaciones

genéticas entre genotipos, interesa explotar la mayor parte del genoma, y en

consecuencia interesa que los marcadores estén distribuidos por todo el genoma; 5)

reproducible entre laboratorios y dentro de un mismo laboratorio – ser reproducible

y repetible; y 6) fácil, rápido y económico de detectar.


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1.5. Técnicas moleculares usadas en caracterización de poblaciones

Las técnicas y los marcadores moleculares aplicados al estudio de la

variación genética de las plantas se empezaron a utilizar a mediados del siglo

XX. Estos estudios son imprescindibles cuando se trata de conservar

eficazmente y utilizar los recursos fitogenéticos, ya que para ello hay que

ampliar los conocimientos acerca de la extensión y distribución de las

variaciones genéticas. Los marcadores más adecuados deben constituir

caracteres hereditarios, discriminar entre los individuos, poblaciones o taxa

examinados, ser fácilmente evaluables y aportar resultados que puedan ser

comparados con los de otros estudios (Westman y Kresovich, 1997).

1.5.1. Tipos de marcadores moleculares

Los marcadores moleculares pueden ser muy invariables o ser altamente

variables y pueden ser tanto proteínas como ácidos nucleicos. Existe una alta

variedad de fragmentos de ácidos nucleicos que son utilizados como

marcadores, entre los que se encuentran genomas completos, cromosomas

individuales, fragmentos de ADN o ARN y nucleótidos simples. Mientras

algunos se repiten una vez en el genoma, otros se repiten varias veces. Muchas

de las secuencias repetidas usadas como marcadores son no codificantes; otras

son elementos de familias multigenómicas. Algunas secuencias repetidas están

intercaladas por todo el genoma, bien distribuidas al azar o en grupo (Westman

y Kresovich, 1997).

Fue a partir del año 1970 cuando los marcadores moleculares basados en

el ácido nucleico ganaron popularidad, con la ventaja de la secuenciación del

ADN y el análisis de fragmentos de restricción. De esta forma, desde el siglo

pasado se han desarrollado numerosas técnicas que permiten detectar

variaciones en la secuencia de ADN al comparar distintos individuos. Gran parte


P á g i n a | 26

de la investigación actual se centra en la identificación de las secuencias

repetidas que suceden en tándem y existe una alta variedad de fragmentos de

ácidos nucleicos que son utilizados como marcadores. Las clases de

repeticiones en tándem se pueden diferenciar por la longitud de la unidad

central de repetición, el número de unidades repetidas por locus y la

abundancia y distribución de los loci (Westman y Kresovich, 1997).

1.5.2. Tipos de ensayos de marcadores moleculares

Generalmente, los ensayos con marcadores moleculares se clasifican en

función de si las moléculas estudiadas son proteínas o ácidos nucleicos y, en

este último, también por el tipo de material genético analizado en un ensayo de

marcador con ácido nucleicos: el genoma entero, un cromosoma, un fragmento

o un nucleótido. Alternativamente, los ensayos con marcadores pueden ser

clasificados por el tipo de carácter medido. Algunos métodos miden diferencias

cuantitativas, otros miden caracteres cualitativos, cada uno con dos o más

estados posibles. Los ensayos con marcadores también difieren en el número

de loci evaluados por análisis, bien si los múltiples loci son evaluados

simultáneamente o secuencialmente, y según el tipo y cantidad de información

que se necesita acerca del locus marcador antes de llevar a cabo el ensayo

(Westman y Kresovich, 1997).

Los tipos de ensayos con marcadores moleculares se pueden clasificar

en: ensayos con marcadores de proteínas, ensayos con marcadores de ácidos

nucleicos, que a su vez pueden utilizar marcadores de ADN genómico total y

cromosomas o bien marcadores de fragmentación. Estos últimos, los

marcadores de fragmentación, pueden ser: fragmentos que se producen, se

someten a electroforesis y se detectan, fragmentos producidos por enzimas de

restricción digestiva, fragmentos producidos por la reacción en cadena de la


P á g i n a | 27

polimerasa, fragmentos detectados directamente por sondas de hibridación o

por secuenciación de nucleótidos.

Cuando las proteínas se utilizan como marcadores genéticos, se supone

que cualquier variación entre proteínas refleja la variación hereditaria en la

secuencia de sus aminoácidos. Existe un tipo de ensayo de marcadores que

miden la distancia migrada por una proteína a través de un gel de almidón,

poliacrilamida o acetato de celulosa en respuesta a la aplicación de una

corriente eléctrica. Muchas de las proteínas usadas como marcadores son

isoenzimas, que son formas funcionalmente similares de una enzima,

codificada por loci diferentes o alelos diferentes de un locus, es decir, son

múltiples formas moleculares que catalizan una misma reacción. De esta forma

es posible separar enzimas codificadas por genes diferentes o productos de

diferentes alelos de un mismo gen (González‐Andrés, 2001). Con este tipo de

marcadores se llevan a cabo ensayos de medida de propiedades inmunológicas

de las proteínas, pero ha quedado en desuso porque pocas proteínas han

podido ser identificadas correctamente, pero no por ello han dejado de ser una

herramienta útil. Las isoenzimas son frecuentemente usadas para describir la

variación entre y dentro de poblaciones, especies y géneros, para mapas

genéticos y diagnóstico, y en algunos casos para identificación (Westman y

Kresovich, 1997). Uno de los usos más precisos de las isoenzimas es su

aplicación en estudios de análisis de variación intraespecífica, pero su uso está

limitado por el pequeño y limitado número de polimorfismos detectados

(Klaas, 1998).

Los ensayos con marcadores de ácidos nucleicos utilizan como

marcadores el ADN genómico total y los cromosomas. Aunque los marcadores

que utilizan proteínas son útiles como marcadores genéticos, el fenotipo que

cada proteína describe está determinado por el genotipo y por el tipo de tejido

muestreado, el estado fenológico de la planta, medio ambiente y proceso

postranscripcional. Por otra parte, el porcentaje del genoma muestreado por


P á g i n a | 28

los marcadores de proteínas es limitado, ya que estos marcadores sólo

describen las secuencias codificantes y no todas las proteínas pueden ser

separadas y detectadas por los métodos establecidos. En cambio, los ácidos

nucleicos están presentes en todos los organismos y son considerados material

genéticos comunes en la comparación virtual de cualquier taxa. La metilación

del ADN y la estructura secundaria pueden causar variaciones artificiales en

algunos ensayos, alterando la relación directa entre marcador y genotipo. Sin

embargo, estas circunstancias pueden ser detectadas a menudo y eliminadas.

Los marcadores de ácidos nucleicos describen genotipos y no fenotipos y

pueden muestrear tanto regiones codificantes como no‐codificantes de un

genoma. Los primeros ensayos con marcadores de ácidos nucleicos midieron

propiedades del ADN genómico total. Este tipo de marcadores han sido usados

para caracterizar y comparar secuencias repetidas entre especies de plantas e

híbridos (Westman y Kresovich, 1997).

Los ensayos con marcadores de ácidos nucleicos que utilizan fragmentos

de ADN o ARN son actualmente los marcadores genéticos más empleados. Este

tipo de marcadores requieren cantidades mínimas de material de partida y

aportan una información cualitativa de alta resolución acerca de la variación de

la secuencia (Westman y Kresovich, 1997).

Los fragmentos producidos, son separados por electroforesis en gel de

agarosa o poliacrilamida, y en ese momento son detectados. La longitud y

conformación de un fragmento determina su tasa de migración en el gel. Varios

enfoques diferentes se pueden tomar para detectar fragmentos. En algunos

ensayos todos los fragmentos son detectados y visualizados. En otros, los

fragmentos diana específicos son detectados y visualizados mediante

hibridación (Westman y Kresovich, 1997).

Los fragmentos producidos por digestión con enzimas de restricción son

muy utilizados en la genética de plantas. Estos fragmentos de restricción se


P á g i n a | 29

generan por medio del tratamiento de la doble cadena de ADN con

endonucleasas de restricción (que son enzimas generadas por bacterias).

Cuando se evalúan los fragmentos producidos, las variaciones en la

longitud de dichos fragmentos se denominan polimorfismos de longitud de

fragmentos de restricción (RFLPs).

El análisis de los fragmentos de ADN se comenzó a utilizar en la década

de los 70 del pasado siglo XX, con la introducción de los RFLPs, y creció

exponencialmente una década después con el desarrollo de la ‘reacción en

cadena de la polimerasa’ (PCR, de sus siglas en inglés). La PCR utiliza los

principios de reasociación del ADN y la acción de la ADN‐polimerasa para

amplificar los fragmentos de ácidos nucleicos in vitro. Cada una de las

soluciones de la reacción de la PCR contiene un ADN molde de doble cadena,

“primers” (cebador, oligonucleótidos cortos de cadena sencilla), ADN‐

polimerasa termoestable, cofactores enzimáticos y los cuatro

desoxinucleótidos (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP). El ADN molde se

desnaturaliza por el calor; la temperatura disminuye y los primers se unen a las

secuencias complementarias en el ADN molde. La solución se calienta de nuevo

y la polimerasa añade dNTPs en el extremo 3’ de cada uno de los primers

anillados. Se producen los fragmentos de doble cadena y sirven de molde para

el ciclo siguiente, el cual genera fragmentos con las secuencias del primer en

cada extremo. Durante los ciclos siguientes, estos fragmentos se amplifican en

progresión geométrica.

La especificidad y reproducibilidad de la PCR depende de varios

factores: la concentración y calidad de los ingredientes de la reacción, el diseño

y contenido de GC de los primers y la temperatura, duración y número de ciclos

llevados a cabo. Cuando se utilizan para describir variaciones entre y dentro de

las especies, los fragmentos amplificados se pueden detectar por el marcaje de


P á g i n a | 30

primers o de los dNTPs en la solución de reacción, por los productos marcados

de PCR, o por tinción de los geles después de la electroforesis.

Se han desarrollado y utilizado en la genética de plantas numerosos

ensayos de marcadores basados en PCR. Estos pueden ser clasificados según si

las secuencias dianas son conocidas previamente a la amplificación, o si las

secuencias de los primers están diseñadas o son arbitrarias, el número de

primers, y el tamaño del rango de productos amplificados.

Desde comienzos de los 90, se han desarrollado una serie de técnicas

basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que no requieren un

conocimiento previo de secuencias específicas, tanto de la región diana como de las

secuencias flanqueantes, o de genes en los organismos examinados (Klaas, 1998).

Entre ellas la RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA = polimorfismo de ADN

amplificados al azar) es la más utilizada debido a su sencillez (Klaas, 1998; Torres

Lamas, 2001; Wang et al., 2004). Es en esta técnica en la que más nos detenemos

por ser la que se ha manejado para el presente trabajo.

En el proceso se utiliza un único primer de secuencia arbitraria y más corto

(normalmente de 10 nucleótidos) que los generalmente empleados para amplificar

fragmentos específicos, con las únicas limitaciones de poseer un contenido en G+C

comprendido entre el 50‐70% y carecer de secuencias palindrómicas de más de 6

bases. Distintos laboratorios ofrecen cebadores especialmente diseñados para el

ensayo RAPD, a priori utilizables en un amplio rango de especies que incluye tanto

organismos eucariotas como procariotas, y tanto para su uso con ADN nuclear

como ADN plastídico. Un programa típico de PCR / RAPD consta de unos 35‐45

ciclos, cada uno con las etapas de desnaturalización del ADN molde, unión y

elongación del primer. La temperatura de unión del cebador debe estar entre 35‐37

ºC. Al tratarse de un cebador corto, por encima de 38‐40 ºC no suele permanecer

unido al ADN molde, y por debajo de 35 ºC el porcentaje de uniones inespecíficas es

elevado (Torres Lamas, 2001).


P á g i n a | 31

En cada reacción (fig. 7) el primer se anilla al patrón de las secuencias

complementarias en ambos sentidos (“sense” y “antisense”), haciendo posible

la amplificación de las regiones entre los primers en sentidos opuestos. El

número y longitud de fragmentos amplificados puede variar, de forma que, un

primer corto produce generalmente un amplio número de fragmentos

pequeños. En los análisis RAPDs, las muestras que son homocigotas para la

presencia de un fragmento no se pueden diferenciar de las heterocigotas, por

lo que la presencia de los fragmentos generalmente domina sobre la ausencia.

La reacción permite obtener millones de copias de un fragmento del ADN

molde mediante la repetición de un ciclo compuesto por una etapa de

desnaturalización, otra de unión de cebadores a las secuencias flanqueantes de

dicho fragmento y una final de elongación de los cebadores mediante una ADN

polimerasa termoestable.

Fig. 7. Pasos de la técnica PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). Fases: 1) Desnaturalización; 2) Unión al cebador; 3) Elongación del cebador. * Los extremos 5` de las moléculas de ADN se representan mediante un círculo (Fuente: Torres Lamas, 2001).


P á g i n a | 32

Esta técnica se ha utilizado ampliamente para realizar análisis entre

especies de plantas y también estudios dentro de una misma especie,

identificar entradas en los bancos de genes y cultivares y, en la construcción de

mapas genéticos (Westman y Kresovich, 1997).

La técnica de los RAPDs consta de las etapas siguientes: 1) extracción del

ADN; 2) amplificación de los fragmentos de ADN mediante PCR; 3) separación de los

fragmentos de ADN por electroforesis en geles de agarosa; 4) tinción de los

fragmentos de ADN con bromuro de etidio y 5) visualización con luz ultravioleta y

captación de imagen. El polimorfismo detectado es de tipo presencia/ausencia y se

debe a mutaciones en la secuencia del ADN molde a la que se une el cebador, o bien

a inserciones o deleciones entre las dos zonas de unión de los cebadores (Torres

Lamas, 2001).

Esta técnica ofrece varias ventajas: 1) no se precisa un conocimiento previo

del genoma; 2) se necesitan pequeñas cantidades de ADN (5‐50 ng de ADN por

reacción), lo cual es especialmente importante cuando se trabaja con especies

amenazadas; 3) los métodos de extracción de ADN son sencillos, ya que es

suficiente un ADN molde de calidad media para obtener buenas amplificaciones; 4)

en comparación con otras técnicas, el coste en infraestructura es medio

(básicamente se necesita un termociclador, un equipo de electroforesis y una

fuente de luz ultravioleta); 5) los ensayos son fáciles y rápidos; 6) los marcadores

son abundantes en el genoma y se encuentran distribuidos al azar; y 7) el número de

polimorfismos que se pueden encontrar es teóricamente ilimitado (Torres Lamas,

2001).

En contraposición, se producen algunos inconvenientes tales como: 1) la baja

reproducibilidad de los fragmentos amplificados, especialmente de los de alto peso

molecular (>1.600 pb); 2) la incertidumbre acerca de la homología de los fragmentos

amplificados de igual peso molecular (esto es, si tienen la misma secuencia); y 3)

son marcadores dominantes (Torres Lamas, 2001).


P á g i n a | 33

Muchos otros ensayos con PCR son variaciones y combinaciones de los

primers de PCR ya diseñados y de los PCR arbitrarios. La mayoría se

desarrollaron para aumentar la reproducibilidad de los resultados y / o para

mejorar la discriminación entre genotipos altamente relacionados. Para realizar

el genotipo, diagnóstico y valorar la variación entre familias próximas, se

necesitan ensayos con marcadores basados en PCR con alta resolución.

1.6. Utilización de marcadores moleculares en estudios de poblaciones

Los marcadores moleculares pueden ser usados, si la técnica lo permite, para

analizar con una mayor o menor precisión las variaciones entre y dentro de

poblaciones, especies y géneros y, así poder conocer la estructura genética de un

determinado grupo de individuos. De esta forma es posible realizar estudios de

diagnosis, mapas genéticos y, en algunos casos, identificación.

Los estudios descriptivos que usan ensayos con marcadores moleculares

para examinar la variación entre y dentro de taxa específicos pueden generar una

información valiosa, pero algunas cuestiones sobre conservación de plantas como

son los recursos fitogenéticos, se concentran mejor mediante la realización de

varios estudios experimentales y complementarios (Westman y Kresovich, 1997).

El uso de técnicas moleculares permite, en labores de conservación de

poblaciones, comprobar si en varias entradas de un banco de germoplasma existen

duplicaciones, si las poblaciones son genéticamente distintas o si son subdivisiones

geográficas de una población, y si han ocurrido cambios genéticos en una entrada o

población al cabo del tiempo (Wetstman y Kresovich, 1997). En esta misma línea,

ayudan a evaluar las relaciones de similitud entre genotipos, la cantidad de variación

genética presente, y cómo la variación está distribuida entre los individuos,

poblaciones y taxa. La conclusión de estas valoraciones ayuda a decidir qué

genotipos son prioritarios para la conservación in situ, diseño de las estrategias de


P á g i n a | 34

muestreo de germoplasma y programas de regeneración, construcción de

colecciones base, estudios de flujo genético, y determinación del tamaño óptimo

para la conservación de poblaciones o entradas de bancos genéticos (Westman y

Kresovich, 1997; Bachmann, 2001).

1.7. Estudios de poblaciones de romero

Actualmente, Rosmarinus es un género poco estudiado desde el punto de

vista de la distribución y diversidad genética de las poblaciones existentes (Elamrani

et al., 2000; Herrera, 2004), sin embargo, sí ha sido estudiado en mayor medida para

la caracterización de los compuestos presentes en sus aceites esenciales (Almela et

al, 2006; Zaouali et al., 2005) debido a su alto interés por parte de la industria, en su

uso en diversos productos.

Hasta la fecha, sólo existe un trabajo publicado en el que se emplean

marcadores moleculares para abordar el estudio de poblaciones naturales de

romero (Martín y Hernández Bermejo, 2000). En dicho trabajo se emplean RAPDs

para el estudio de varias poblaciones de Rosmarinus tomentosus Huber‐Morath &

Maire (especie endémica en el sureste español). En este trabajo se llevó a cabo una

valoración inicial de la variación genética existente entre zonas muestreadas, entre

poblaciones y entre individuos. Los resultados obtenidos constituyen una

información de partida valiosa para la elaboración de estrategias de conservación

de la especie de romero citada que se encuentra en peligro de extinción.

Estudio de la diversidad de poblaciones de Rosmarinus sp. de la Península Ibérica mediante RAPDs IIII.. IInntteerrééss yy oobbjjeettiivvooss

P á g i n a | 35

2. Interés y objetivos

Como ya se ha expuesto anteriormente en la Introducción, la caracterización

del material conservado resulta de gran valor en los diferentes ámbitos

relacionados con la conservación.

El objetivo de este trabajo fue poner a punto un protocolo para la obtención

de marcadores moleculares (RAPDs en este caso) que permitieran caracterizar la

diversidad existente entre las poblaciones silvestres de romero de España

recolectadas y conservadas en el Banco de Semillas de la Universidad Politécnica de

Madrid (UPM) en el marco del proyecto de investigación ‘Recolección, conservación

y caracterización de germoplasma de poblaciones españolas de varias especies de

los géneros Rosmarinus y Origanum’ financiado por el Instituto Nacional de

Investigaciones Agrarias (INIA).

Como objetivos parciales destacan:

Establecer un protocolo adecuado para la obtención de marcadores

moleculares tipo RAPD que permitan caracterizar las muestras analizadas.

Estudiar la diversidad interpoblacional detectada por los marcadores

empleados.

Analizar factores geográficos y ambientales que pudieran explicar el grado

de similitud existente entre las poblaciones estudiadas en base a los

marcadores moleculares analizados.

Estudio de la diversidad de poblaciones de Rosmarinus sp. de la Península Ibérica mediante RAPDs IIIIII.. MMaatteerriiaall yy mmééttooddooss

P á g i n a | 36

3. Material y métodos

3.1. Material vegetal

3.1.1. Poblaciones estudiadas

Las muestras estudiadas proceden de poblaciones de romero silvestres

repartidas por toda la geografía española que han sido identificadas en el momento

de la recolección como (Rosmarinus officinalis L. y Rosmarinus eriocalyx Jordan &

Fourr). En la tabla 1 se muestra el número de la población, la especie y la localización

de las muestras tomadas.

Tabla 1. Listado de poblaciones de romero recolectadas.

Nº(Código) 1 Especie Término Provincia R01‐00 R. officinalis Turre Almería R04‐00 R. officinalis Valdeconcha Guadalajara R05‐00 R. officinalis Argamasilla de Alba Ciudad Real R06‐00 R. officinalis Alcaraz Albacete R07‐00 R. officinalis Villena Alicante R08‐00 R. officinalis Algimia de Almoacid Castellón R09‐00 R. officinalis San Martín de la Virgen del Moncayo Zaragoza R10‐00 R. officinalis Loporzano Huesca R11‐00 R. officinalis Leciñena Zaragoza R12‐00 R. officinalis Soto del Real Madrid R15‐01 R. officinalis Torrejón el Rubio Cáceres R19‐01 R. eriocalyx Tabernas Almería R21‐01 R. officinalis Conil de la Frontera / Chiclana Cádiz 1: Los números después del guión indican el año de recolección (2000 y 2001), que no se utilizarán en el resto del documento.

En la figura 8 se muestra la localización, en el mapa de la Península Ibérica, de

las poblaciones recolectadas.


P á g i n a | 37

Fig. 8. Situación de las poblaciones de Rosmarinus officinalis [ ] y Rosmarinus eriocalyx [ ].

En la figura 9 se muestran las provincias biogeográficas en que está dividida

España. Seguido figura la tabla 2 en la que se indica a qué población biogeográfica

pertenece cada una de las muestras tomadas.

Fig. 9. Provincias biogeográficas (Rivas‐Martinez et al, 1987). Provincias biogeográficas de España y Portugal (Península Ibérica, Baleares y Canarias).‐ Región Eurosiberiana. I: Pirenaica. II: Cántabro‐atlántica. III: Orocantábrica. – Región Mediterránea. IV: Aragonesa. V: Catalana‐Valencia‐Provenzal. VI: Balear. VII: Castellano‐Maestrazgo‐Manchega. VIII: Murciano‐Almeriense. IX: Carpetano‐Ibérico‐Leonesa. X: Luso‐Extremadurense. XI: Gaditano‐Onubo‐Algarviense. XII: Bética. – Región Macaronésica. XIII: Canaria Occidental. XIV: Canaria Oriental.


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Tabla 2. Provincias biogeográficas a las que pertenecen las poblaciones de romero estudiadas. Nº Provincia biogeográfica Población I Pirenaica R10 IV Aragonesa R11 V Catalana – Valenciano – Provenzal R07, R08 VII Castellano – Mestrazgo – Manchega R04, R05 VIII Murciano – Almeriense R01, R19 IX Carpetano – Ibérico – Leonesa R09, R12 X Luso – Extremadurense R15 XI Gaditano – Onubo – Algarviense R21 XII Bética R06

Las poblaciones en las que se basa este trabajo sólo suponen una pequeña

muestra de todas las poblaciones de romero presentes en la Península Ibérica. Se ha

intentado tener al menos una población de cada una de las provincias

biogeográficas.

Estas poblaciones eran casi todas poblaciones con un alto número de

individuos, que no presentaban tamaños poblacionales limitantes. Sólo las

poblaciones R07, R15 y R21 mostraron un censo de menos de 1.000 individuos.

3.1.2. Recolección del material

En el proceso de recolección del material se tomaron semillas de por los

menos 100 individuos, además de muestras de hojas separadas de 6 individuos para

extracción de ADN y 5 ejemplares para preparar pliegos de herbario.

En la recolección de hojas, destinadas a la extracción del ADN y objeto de

este trabajo, se debe tener en cuenta que siempre se recogieron las hojas más

jóvenes posibles. Esta recogida de material se realizó al mismo tiempo que la

recolección de semillas.


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Se recogieron muestras de 6 individuos, una muestra (tallo) por individuo.

Cada muestra se envolvió en una toalla de papel, se humedeció (sin llegar a

encharcarla) y se guardó en una bolsa de plástico pequeña con cierre (siempre una

sola muestra por bolsa). Las bolsas fueron marcadas con el código de la población

(ej. R4) y otro número para indicar el individuo (ej. R4‐1). También se anotó la fecha

de recolección. Estas muestras se guardaron en nevera portátil, transcurriendo el

menor tiempo posible desde su recogida hasta su procesado de congelación.

Inicialmente, se recolectaron 24 poblaciones, pero durante el desarrollo de

los ensayos se descartaron algunas muestras por problemas en las amplificaciones,

pudiéndose estudiar sólo las mostradas en la tabla 1. Finalmente se incluyeron en el

análisis las muestras de 13 poblaciones.

3.1.3. Conservación del material

Al llegar al laboratorio, se seleccionaron las hojas más limpias y sanas,

prefiriéndose las hojas más jóvenes. Las hojas se limpiaron con una toalla de papel

humedecida con alcohol (arrastrando para quitar posibles depósitos). Si las hojas

resultaban ser demasiado grandes se partieron, empleando bisturí y pinzas.

Se almacenaron muestras de cada individuo recogido de forma individual y

muestras que contenían mezcla de tres individuos (mezcla de los individuos 1, 2 y 3 y

mezcla de los individuos 4, 5 y 6). La primera mezcla se la denonima “1” (por

ejemplo, de la población R01, R1.1) y a la segunda “2” (ej. R1.4). En todos los casos se

conservaron dos eppendorfs (previamente autoclavados) que contienen

aproximadamente 20 mg de hoja.


P á g i n a | 40

3.2. Extracción de ADN

3.2.1. Protocolo de extracción de ADN

De cada población se utilizaron las dos muestras que contenínan hojas de 3

individuos cada una, excepto de las poblaciones R07 y R19, que sólo se pudieron

utilizar una de cada (R7.4 y R19.1).

Para la extracción del ADN de las hojas de las muestras tomadas se siguió el

método de Gawel & Jarret (1991) ligeramente modificado, quedando como se

especifica a continuación:

Se utilizaron aproximadamente 20 mg de material vegetal por muestra. Se

congeló con nitrógeno líquido en eppendorfs de 1,5 mL y se pulverizó el

material en el mismo tubo, utilizando un dispositivo manual (minimorteros

de plástico) hasta alcanzarse un grado de homogeneidad buena y suficiente.

Inmediatamente se añadieron 700 μL de tampón de extracción (mezcla de 2%

p/v CTAB (ver Anejo I) + 3,8 g∙L‐1 bisulfito de sodio + PVP 1%) al que se añadió

0,2% de β‐mercaptoetanol, sólo antes de su uso y precalentado a 65ºC. Se

mantuvieron las muestras en incubación a 65ºC durante, al menos, 1 hora.

Se añadió 600 μL de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1 v/v) y se mezclaron

las muestras por inversión durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Se centrifugó a 12.000 r.p.m. durante 5 minutos y el sobrenadante se

transfirió a un eppendorf limpio.

Se añadieron 500 μL de isopropanol frío (‐20ºC) a los 500 μL del

sobrenadante recuperado y se mantuvo en el congelador durante, al menos,

10 minutos. Después de mezclar por inversión se centrifugó nuevamente a

12.000 r.p.m. durante 5 minutos para precipitar el ADN.

Se eliminó el isopropanol completamente y se añadieron 300 μL de etanol al

70% a temperatura ambiente para lavar el precipitado de ADN.

Inmediatamente se centrifugó a 12.000 r.p.m. durante 5 minutos.


P á g i n a | 41

Después de 1 ó 2 lavados consecutivos se dejaron los tubos abiertos e

invertidos durante al menos 12 horas para asegurar que el ADN centrifugado

quedara libre de alcohol;

Finalmente se resuspendieron las muestras en 100 μL de agua destilada y se

incubaron durante 2 horas a 37ºC.

El ADN extraído se conservó a ‐20ºC.

3.2.2. Preparación de las soluciones de trabajo

Se comprobó el estado y concentración del ADN extraído mediante

comparación con concentraciones conocidas de ADN en gel de agarosa.

Las extracciones originales de ADN se diluyeron en agua destilada

esterilizada hasta alcanzar una concentración de aproximadamente 2 μg∙μL‐1. Estas

diluciones son las soluciones de trabajo con las que se prepararon las

amplificaciones.

3.3. Amplificación del ADN (RAPDs)

Para las amplificaciones, inicialmente se probaron trece primers

decanucleótidos de secuencia arbitraria (se obtuvieron de Operon Technologies Inc,

Alameda, California. USA: OPF_03, OPF_08, OPF_13, OPO_04, OPO_05, OPO_06,

OPO_07, OPO_10, OPO_12, OPO_15, OPO_16, OPO_18, OPO_20). Fueron

seleccionados (OPF_13, OPO_07, OPO_10, OPO_15 y OPO_20) aquellos que

alcanzaron mayor nivel de polimorfismo (calidad de información aportada: bandas

consistentes y bien definidas en el mayor grado posible) y generaron un mayor

número de bandas, con el objetivo de hacer más eficaz el análisis de las muestras

recogidas.


P á g i n a | 42

3.3.1. Protocolo de amplificación mediante PCR

Las reacciones de amplificación del ADN fueron realizadas en volúmenes de

25 μL que contenían los compuestos mostrados en la tabla 3.

Tabla 3. Componentes y cantidades de los compuestos usados en la PCR.

Componente Cantidad agua 14,85 μL

10 x buffer (1) 2,50 μL

Cl2Mg (50mM) 0,75 μL

dNTPs (50mM) 0,4 μL

primer (10 mM) 0,5 μL

Taq ADN polimerasa (2) 1,0 μL

ST muestra 5,0 μL

* 1 y 2 – tampón provisto por la casa comercial de la enzima (Biotools)

La mezcla de la reacción fue cubierta por una gota de aceite mineral. La

amplificación se realizó en un termociclador (DNA Thermal Cycler 480, Perkin‐Elmer

CETUR), que llevó a cabo la siguiente secuencia de ciclos programada (tabla 4).

Tabla 4. Ciclos, temperatura y tiempos de la PCR.

Num. ciclos Temperatura Tiempo 1 ciclo 94ºC 1 min.

35 ciclos 92ºC 45 s.

37ºC 1 min.

72ºC 2 min.

1 ciclo 72 ºC 3 min.


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3.4. Separación de los productos de amplificación por electroforesis

3.4.1. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % en TBE

Una vez realizada la amplificación de las muestras, los productos de

amplificación se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (p/v). Para

la elaboración de los geles se siguió el siguiente protocolo:

Se añaden 2,25 g de agarosa a 150 mL de 1 x TBE (ver Anejo I) en un

erlenmeyer.

Se calienta en microondas a 600 w durante 2 minutos tapando el recipiente.

Si es necesario se vuelve a calentar durante medio minuto más a menor

potencia para conseguir que se disuelva por completo la agarosa.

Se prepara la bandeja de electroforesis, nivelando el soporte y regulando los

peines.

Se homogeniza la muestra mediante agitación y cuando la temperatura ha

descendido a 50‐60ºC se vierte la solución en la bandeja, comprobando que

no queden burbujas o cuerpos extraños.

El gel se deja enfriando hasta que gelifica completamente.

A continuación, se insertaron en los pocillos del gel alícuotas de 12 μL de los

productos de amplificación que contenían tampón de carga (ver Anejo I). En todos

los geles se incluyó “marcador en escalera” de 100 pb (Pharmacia) para determinar

el tamaño de los productos de amplificación (Anejo I). Todas las electroforesis se

llevaron a cabo inmersas en tampón 1 x TBE (Sambrook et al. 1989), con unos

tiempos medios de 2h y 30 min y una intensidad de corriente de 100 v.


P á g i n a | 44

3.4.2. Tinción y adquisición de imágenes

Se llevó a cabo una tinción mediante inmersión en bromuro de etidio (0,5

μg∙mL‐1), durante 10‐15 minutos, seguido de un proceso de lavado en agua de 15‐20

minutos. Los geles se visualizaron y fotografiaron bajo luz ultravioleta con cámara

digital (Kodak DC 290) y fotos Polaroid.

Con la finalidad de comprobar la reproducibilidad, se realizaron al menos 2

reacciones por cada ‘primer’ con cada una de las muestras en estudio.

3.5. Análisis estadísticos

A partir del análisis de bandas generadas por los RAPDs (Random Amplified

Polymorphic DNA) se elaboró una matriz binaria de datos donde se han tenido en

cuenta las bandas de los RAPDs por su presencia (1) o ausencia (0). Los fragmentos

amplificados fueron nombrados primero por el primer usado (OPF_13, OPO_07,

OPO_10, OPO_15 y OPO_20) y seguido del tamaño de la banda expresado en pares

de bases (pb). Esta matriz permite cuantificar el número de bandas monomórficas y

polimórficas y constituye la herramienta base de todos los análisis llevados a cabo

en este trabajo.

La matriz de datos permitió el cálculo de las matrices de similitud usando los

índices o coeficientes de JACCARD (1908) y Dice (1945) (ver Anejo IV) mediante el

programa NTSYS (Numerical Taxonomy System for Cluster and Ordination Analysis). A

continuación, los datos de la matriz de similitud se sometieron a un análisis de

clasificación, usando el método de agrupamiento UPGMA (Unweighted Pair Group

Method with Arithmatic Mean) (Wilkie et al., 1993). La representación gráfica de los

resultados del análisis de clasificación se realizó mediante la obtención de un

dendrograma o árbol de similitud, usando para ello el método gráfico de SHAN

(Sequential Agglomerative Hierarical Nested Cluster Analysis). La obtención de las


P á g i n a | 45

matrices cofenéticas, a partir de las matrices de similitud, para cada índice de

similitud, permitió, a través de un análisis de correlación (Test de Mantel), estimar el

ajuste de los dendrogramas.

Paralelamente, se elaboró un diagrama de coordenadas principales,

mediante el uso del programa NTSYS, con el objeto de contrastar y complementar

los resultados de agrupamiento de muestras obtenidas por los dendrogramas a

partir de las matrices de similitud según Jaccard y Dice.

Por otra parte, se procedió al cálculo de la matriz de distancias genéticas de

acuerdo a la expresión de Nei (1978) mediante el uso del programa PopGene. Para

ello hubo que realizar una pequeña conversión previa de los valores de la matriz de

similitud en valores de dis‐similitud [D = (1‐S), siendo S el valor del coeficiente de

similitud]. A partir de ella se pudo generar un nuevo dendrograma, mediante el

método UPGMA, en el que las muestras aparecen agrupadas por poblaciones.

Para analizar la posible relación entre las distancias genéticas obtenidas y la

distribución geográfica de las poblaciones estudiadas, se construyó una matriz de

distancias geográficas, la cual recoge las distancias lineales entre los puntos de

localización de las poblaciones estudiadas.

Con el fin de analizar la posible correlación de la diversidad genética

observada con las condiciones ambientales de las localizaciones de las poblaciones

consideradas, se recogieron datos ambientales de estas poblaciones para construir

una matriz de distancias ambientales. Las variables consideradas fueron: altitud,

temperatura media anual y precipitación anual. La matriz obtenida fue comparada

con la matriz de distancias genéticas a través de un test de Mantel. Asimismo, cada

una de las tres variables ambientales consideradas fue comparada de manera

independiente con la misma matriz de distancias genéticas usando el mismo

método.


P á g i n a | 46

Para cuantificar la diversidad genética observada se procedió a calcular el

estimador de la diversidad genética ‘h’ mediante la expresión de Nei (1973) usando

para ello el programa PopGene.

Dentro del mismo apartado y con el fin de establecer un reparto de la

variación observada a distintos niveles, centrándose fundamentalmente en las

diferencias entre las distintas provincias biogeográficas analizadas, se realizó un

análisis de variación molecular (AMOVA) a través del programa WinAmova.

Estudio de la diversidad de poblaciones de Rosmarinus sp. de la Península Ibérica mediante RAPDs IIVV.. RReessuullttaaddooss yy ddiissccuussiióónn

P á g i n a | 47

4. Resultados y discusión

4.1. Caracterización de las poblaciones de romero

Para la caracterización de las 13 poblaciones de romero en estudio, se

utilizaron los marcadores moleculares RAPDs (Random Amplified Polymorphic

DNAs). La técnica de los RAPDs es una técnica muy utilizada para caracterización,

tanto de especies cultivadas como en los estudios sobre la estructura genética de

poblaciones naturales (Martín et al, 1999; Nybon y Bartish, 2000; Ortíz‐Dorda et al.,

2005).

Se analizaron 24 muestras, 2 de cada población, excepto en las poblaciones

R07 y R19 en las que finalmente sólo se pudo estudiar una muestra. Cada una de

estas muestras representa una mezcla de 3 individuos de la población (ver apartado

3.1.3 de Material y Métodos). En la figura 10 se muestra uno de los geles obtenidos

de los productos amplificados con el primer OPO_07. Otras imágenes de los geles

obtenidos están recogidas en el Anejo II.

Fig. 10. Gel obtenido mostrando los productos amplificados con el primer OPO_07.


P á g i n a | 48

El análisis de las muestras con los 5 primers seleccionados dio lugar a 51

bandas o marcadores (Anejo III, tabla A1). La nomenclatura de las bandas especifica

en primer lugar el primer que ha sido utilizado y en segundo lugar, el peso molecular

de la banda expresado en pares de bases (pb). La nomenclatura de las muestras,

está detallada en la tabla 1 (ver apartado de Material y Métodos).

El análisis de las bandas generadas, mostrado en la matriz de datos (Anejo III,

tabla A1), permite identificar 33 bandas polimórficas y 18 monomórficas. Si se

revisan las bandas de tipo polimórfico encontramos que no hay marcadores

específicos de población y que sólo en la población de San Martín de la Virgen del

Moncayo (R09) de Zaragoza, en lo que parecería ser un marcador monomórfico

(OPO 10_900), se constata la ausencia de banda para ambas muestras. Por otra

parte, tan sólo se encontraron bandas exclusivas de un individuo para una de las

muestras de las poblaciones de Argamasilla de Alba (R5.4) y Loporzano (R10.4) en

los marcadores OPO 07_325 y OPO 20_1600, respectivamente. También se observó

que algunos marcadores estaban presentes en prácticamente todas las muestras

estudiadas, excepto en una, siendo considerado entonces polimórfico: Valdeconcha

(R4.1) en las bandas OPF 13_1500 y OPO 07_1000; San Martín de la Virgen del

Moncayo (R9.4) en la banda OPO 15_950; Tabernas (R19.4) en la banda OPO

20_2000 y Conil de la Frontera / Chiclana (R21.10) en la banda OPO 10_1400, mientras

que para el resto de muestras hay presencia.

Los resultados que hemos obtenido con estas poblaciones de romero

pueden considerarse como una primera aproximación a la estimación de la

diversidad existente entre las poblaciones de romero muestreadas, ya que el

limitado número de primers que se pudo finalmente utilizar (13 primers ensayados,

pero sólo 5 utilizados), generaron 33 bandas polimórficas, cantidad relativamente

pequeña si se compara con otros estudios de este tipo donde se han podido evaluar

un mayor número de bandas polimórficas (Segarra‐Moragues et al., 2005). Sin

embargo, hay que tener presente que la frecuencia de bandas polimórficas

aportadas por los RAPDs varían de unas especies a otras; así por ejemplo, el maíz,


P á g i n a | 49

especie de polinización cruzada, es altamente polimórfica, mientras que el tomate,

especie con autopolización, es menos polimórfica (Wilkie et al., 1993; Hayward y

Sackville Hamilton, 1997).

En la tabla 5 se recoge a modo de resumen la cantidad de bandas totales

generadas por cada primer, diferenciando entre polimórficas y monomórficas.

Estos datos van acompañados del grado de polimorfismo alcanzado y el tamaño de

bandas obtenidas para cada uno de ellos.

Tabla 5. Tipos de bandas, porcentaje de polimorfismo y tamaño de bandas generado (expresado en pb).

PRIMER BANDAS

AMPLIFICADAS

% POLIMORFISMO Tamaño de bandas (pb)

TOTAL P M OPF – 13 7 2 5 28,57 650 – 1800 OPO – 07 13 8 5 61,53 325 – 1300 OPO – 10 9 3 6 50,00 600 – 2300 OPO – 15 7 5 2 71,42 800 – 2000 OPO – 20 15 15 0 100,00 450 – 2000

TOTAL de bandas encontradas

51 33 18 64,70

Los resultados mostrados en la tabla 5 reflejan grandes diferencias en el

porcentaje de polimorfismos detectados por cada uno de los primers empleados.

Así, mientras en el primer OPO‐20 todos los marcadores analizados resultaron ser

polimórficos, en el primer OPF‐13 sólo el 28,57% eran polimórficos. El valor medio de

marcadores polimórficos detectados, considerando conjuntamente los 5 primers

empleados, resulta ser del 64,70%. Comparado este valor con el obtenido en otros

trabajos similares resulta un tanto bajo. En el trabajo de estudio de diversidad

genética de Rosmarinus tomentosus se obtuvo un valor del 86% de marcadores

polimórficos de las 109 bandas estudiadas (Martín y Hernández Bermejo, 2000),

igualmente se pueden ver valores similares en otros estudios de otras especies (p.e.

Renau‐Morata et al., 2005). Sin embargo, hay que tener en cuenta que la obtención


P á g i n a | 50

en este caso de valores tan bajos está en parte justificado por el tipo de muestras

analizadas, que son mezcla de varios individuos, mientras que en los trabajos

mencionados analizaban cada individuo separadamente.

4.2. Análisis de agrupamiento

A partir de la matriz de datos (matriz de presencias y ausencias, 0 y 1, de los

marcadores analizados para las 24 muestras estudiadas, Anejo III, tabla A1), se

calcularon los índices de similitud entre todas las muestras. La matriz de similitud

obtenida mediante el coeficiente de Jaccard (Anejo III, tabla A2) presenta valores

que van de 0,568 (entre las muestras R8.4 y R15.4) a 0,971, el valor más alto,

observado entre las dos muestras analizadas de la población R11.

Excepto en las poblaciones R07 y R19, en las que sólo se pudo analizar una

muestra, en las otras poblaciones se estudiaron 2 muestras (mezcla de 3 individuos

de la población cada una de ellas), por lo que es de esperar que los índices de

similitud entre muestras de la misma población presenten valores más altos. El valor

más alto detectado mediante el índice de Jaccard se corresponde de hecho con uno

de estos valores, el correspondiente a las muestras de la población R11 como ya se

ha mencionado. Sin embargo, aunque en general todos ellos presentan valores de

similitud bastante altos (entre 0,971 – población R21 – y 0,681 – población R09) no

son los valores más altos encontrados, habiendo índices de igual valor o incluso

mayor entre muestras de distintas poblaciones.

Los resultados del análisis de similitud se muestran gráficamente en el

dendrograma obtenido mediante el método UPGMA (figura 11). En este

dendrograma se observa que el nivel de similitud mínimo es de 0,68, donde se

separan las muestras de la población de San Martín de la Virgen del Moncayo (R09)

del resto; las muestras de dicha población muestran entre ellas un coeficiente de

similitud de 0,86.


P á g i n a | 51

Al nivel de similitud del 69% se separa el grupo que contiene a las muestras

de la población de Alcaraz (R06) y la muestra R8.4 del resto de muestras. Las

muestras de la población R06 presentan entre sí una similitud del 84%, y se separan

de la de R8.4 al nivel de similitud 0,76.

El grupo que contiene las 19 muestran restantes se divide en otros 2

subgrupos al nivel 0,73 de similitud, separándose a su vez el mayor de ellos en otros

2 grupos a un nivel muy cercano al anterior (aproximadamente 0,74).

El primer subgrupo mencionado (grupo A en el dendrograma), contiene las

muestras de las poblaciones de Valdeconcha (R04), Argamasilla de Alba (R05) y

Leciñena (R11). Las muestras de la población R11 se separan del resto a un nivel del

0,75, presentando entre ellas una similitud del 0,97, la más alta de las observadas en

este trabajo. Sin embargo, las muestras de las poblaciones R04 y R05 no se agrupan

por población, presentando subgrupos con muestras mezcladas de ambas.

Para interpretar el otro subgrugrupo se han denominado como subgrupos B

y C (ver dendrograma de la figura 11) los 2 grupos en que se divide. El grupo B

contiene las muestras de las poblaciones del Soto del Real (R12), Torrejón el Rubio

(R15), Conil de la Frontera / Chiclana (R21) y la muestra R19.4 de la población de

Tabernas. Al igual que ocurría en el grupo A, se observa que sólo una de las

poblaciones que forman este grupo muestra un subgrupo formado únicamente con

las muestras de la población (R21 en este caso), apareciendo las muestras de las

otras dos poblaciones del grupo (R12 y R15) mezcladas entre sí. En esta

interpretación no se ha considerado la muestra R19.4 por ser la única de su

población.


P á g i n a | 52

Fig. 11. Dendrograma UPGMA, índice de JACCARD [NTSYS 2.20] de las muetras de cada población de romero en estudio.

El grupo C contiene las muestras de las poblaciones de Turre (R1), Loporzano

(R10) y las muestras R7.1 y R8.1, de las poblaciones de Villena y Algimia de Almoacid,

respectivamente. Estas muestras, al nivel de 0,77 de similitud se escinden en dos

nuevos grupos. Por un parte, se encuentran mezcladas las muestras R7.1, R8.1 y

R10.1, y por otro las dos muestras de la población R01, agrupadas entre sí a un nivel

del 84%, junto con la muestra R10.4.

El dendrograma obtenido a partir de la matriz de similitud usando el índice de

Jaccard refleja una gran diversidad entre las muestras analizadas, tanto entre

poblaciones distintas como incluso entre las muestras de una misma población,

habiendo casos en que las dos muestras de una población aparecen agrupadas en

grupos distintos, como es el caso de las muestras de la población R08. Sólo dos

poblaciones, R11 y R21 presentan un alto grado de similitud entre sus muestras.

Grupo C

Grupo B

Grupo A


P á g i n a | 53

Otro de los resultados más significativos que muestra el dendrograma es el

hecho de que la muestra R19.4 correspondiente a la población de Tabernas

aparezca agrupada en el grupo B junto con las muestras de las poblaciones R12, R15

y R21, ya que esta población fue determinada en el momento de la recolección

como Rosmarinus eriocalyx. Los resultados obtenidos a partir de los marcadores

moleculares de esta muestra en este trabajo, no respaldan dicha determinación, ya

que la muestra R19.4 aparece agrupada junto con muestras de R. officinalis a un

nivel de similitud bastante alto. Existe la posibilidad de que la posición de esta

muestra dentro del dendrograma se deba a un error en la determinación durante la

recolección o a la existencia de procesos de hibridación en esta población. Sin

embargo, tampoco se puede asegurar que se trate de un híbrido entre R. officinalis y

R. eriocalyx ya que no se han incluido en el análisis muestras de otras poblaciones de

R. eriocalyx que pudieran confirmar este hecho.

Las conclusiones a las que se llega al emplear para la obtención de la matriz

de similitud el índice de Dice (Anejo III, tabla A3) y el dendrograma obtenido a partir

de esta matriz (figura 12) son similares a las obtenidas utilizando el índice de

Jaccard, aunque hay que señalar que los valores obtenidos en los coeficientes de

similitud con el primer índice son algo mayores. Esto puede deberse en parte a que

en la expresión del índice de Dice se da un peso mayor a las bandas comunes de las

muestras comparadas (Anejo IV).


P á g i n a | 54

Fig. 12. Dendrograma UPGMA, índice de DICE [NTSYS 2.20] de las muestras de cada población de romero en estudio.

El análisis a través del test de Mantel (1967), se llevó a cabo para comprobar

el ajuste de los dendrogramas, comparando la matriz cofenética obtenida a partir

de la matriz de similitud y esta última. Los niveles de correlación que se obtuvieron

para los índices de similitud de Jaccard y Dice, fueron de 0,75396 (P < 0,05) y de

0,73405 (P < 0,05), respectivamente. Estos valores, de acuerdo con la clasificación

hecha por Rohlf (2005), están incluidos dentro del rango de correlaciones

consideradas como pobres estadísticamente (0,7 ≤ r < 0,8), pero sí son

estadísticamente significativos.

Por otra parte, para poder contrastar y complementar la información

extraída a partir de ambos dendrogramas, en lo referente a la evaluación del grado

de diferencia entre poblaciones y a su posible agrupación, se llevó a cabo la

elaboración de un diagrama de coordenadas principales (NTSYS) (figura 13). Los tres

primeros ejes explican el 18,0%, 12,1% y 10,4% de la varianza total.


P á g i n a | 55

Fig. 13. Diagrama de coordenadas principales, índice de JACCARD [NTSYS 2.20] – Vistas 2D (a) y 3D (b) de las muestras de cada población de romero en estudio.

a

b


P á g i n a | 56

Como se puede apreciar en las vistas 2D (figura 13.a) y 3D (figura 13.b), las

muestras de las poblaciones R09 y R21 siguen permaneciendo juntas; en menor

grado lo hacen las de las poblaciones R04, R05, R06, R10, R11, R12 y R15. A la vista de

esta disposición de las muestras se observa que éstas se hallan muy dispersas, sin

terminarse de constituir algún subgrupo bien definido, hasta el punto de que

algunas de ellas se separan mucho una de la otra (casos de las poblaciones R01 y

R08).

La distribución 2D de las muestras se asemeja a la obtenida en el

dendrograma, pero hay que reseñar que ciertas muestras o poblaciones aparecen

conjuntamente con otras que antes no lo hacían. Respecto a la vista 3D, aparecen

ciertas diferencias en cuando al grado de similitud presentado por las muestras de

una misma población, que en la vista 2D pudieran aparentar ser más cercanas. Todo

ello refuerza los resultados obtenidos inicialmente en el dendrograma, sobre la alta

diversidad de las muestras estudiadas.

4.3. Distancias genéticas

El cálculo de las distancias genéticas fue hecho de acuerdo a la expresión de

Nei (1978) mediante el programa PopGene .

De este análisis se obtiene como resultado la matriz de distancias genéticas

para el total de poblaciones (tabla 6), la cual recoge las frecuencias de alelos de

acuerdo con Nei (1978).


P á g i n a | 57

Tabla 6. Identidad genética de Nei (por encima de la diagonal) y distancia genética de Nei

(por debajo de la diagonal).

pop ID R1 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R15 R19 R21

R1 **** 0.8710 0.8885 0.7902 0.8719 0.8537 0.8070 0.9475 0.8215 0.9172 0.9181 0.8482 0.8384

R4 0.1381 **** 0.9459 0.7974 0.8303 0.8397 0.8092 0.8901 0.8033 0.8906 0.8795 0.7606 0.8323

R5 0.1183 0.0556 **** 0.8311 0.8676 0.8234 0.8772 0.9029 0.8613 0.8783 0.8502 0.7571 0.8118

R6 0.2354 0.2264 0.1850 **** 0.8014 0.8651 0.7796 0.8139 0.7298 0.8194 0.7880 0.8064 0.7673

R7 0.1370 0.1860 0.1421 0.2214 **** 0.8929 0.8325 0.9423 0.7631 0.8503 0.7998 0.7647 0.7549

R8 0.1581 0.1747 0.1943 0.1450 0.1133 **** 0.7999 0.9334 0.8081 0.8191 0.7661 0.8098 0.7577

R9 0.2144 0.2117 0.1310 0.2490 0.1833 0.2233 **** 0.8403 0.7214 0.7893 0.7464 0.7115 0.7416

R10 0.0539 0.1164 0.1021 0.2059 0.0594 0.0689 0.1739 **** 0.8728 0.9027 0.8611 0.8285 0.8006

R11 0.1966 0.2190 0.1493 0.3150 0.2704 0.2131 0.3266 0.1361 **** 0.8323 0.7817 0.8025 0.7533

R12 0.0864 0.1159 0.1297 0.1992 0.1622 0.1995 0.2366 0.1024 0.1835 **** 0.9674 0.8738 0.8810

R15 0.0854 0.1284 0.1623 0.2383 0.2234 0.2664 0.2925 0.1495 0.2463 0.0332 **** 0.8348 0.9220

R19 0.1647 0.2736 0.2782 0.2152 0.2683 0.2110 0.3403 0.1881 0.2200 0.1350 0.1805 **** 0.7549

R21 0.1763 0.1835 0.2085 0.2649 0.2811 0.2775 0.2989 0.2224 0.2834 0.1267 0.0812 0.2811 ****

A partir de la matriz de distancias genéticas de Nei (1978), el programa

PopGene permite obtener un dendrograma por poblaciones (figura 14). Este

dendrograma ofrece una disposición y agrupamiento de las poblaciones bastante

similar al dendrograma obtenido a partir de la matriz de similitud mediante el

método UPGMA. Sigue apareciendo como la población más alejada del resto la R09

(San Martín de la Virgen del Moncayo), al igual que se observaba en el dendrograma

del apartado 4.2. Esta población pertenece a la misma provincia biogeográfica que

la R12 (Soto del Real) (marcadas en el dendrograma con una flecha del mismo

color), con la cual, sin embargo, no se agrupa y de la que se encuentra bastante

alejada. Su posición en ambos dendrogramas podría deberse a que se tratara de un

error en la clasificación de la muestra o de una población resultante de un proceso

de hibridación, pero la falta de muestras de otras especies de Rosmarinus en este

análisis no permite confirmarlo, como ya se ha comentado previamente para el caso

de la población R19 (Tabernas).


P á g i n a | 58

Fig. 14. Dendrograma basado en la distancia genética de Nei (1978): método UPGMA, índice de JACCARD [PopGene]. Las poblaciones que pertenecen a una misma provincia biogeográfica se han señalado con una elipse (en el caso de estar agrupadas juntas) o con flechas del mismo color para cada provincia.

Las otras dos poblaciones que aún perteneciendo a la misma provincia

biogeográfica no se han agrupado juntas son las poblaciones R01 (Turre) y R19. En

principio no sería de esperar este agrupamiento ya que según la clasificación de

partida se trata de dos poblaciones de, en principio, distintas especies, sin embargo

los resultados obtenidos en este análisis cuestionan este hecho.

En este estudio hay otras dos provincias biogeográficas que están

representadas por dos poblaciones distintas, las provincias V (poblaciones R07

[Villena] y R08 [Algimia de Almoacid]) y VII (poblaciones R04 [Valdeconcha] y R05

[Argamasilla de Alba]). En el caso de esta última provincia, las dos poblaciones que

la representan aparecen agrupadas juntas. En el caso de la otra provincia, VII, las

dos poblaciones que la representan aparecen en el mismo grupo, pero junto a otras

dos poblaciones correspondientes a otras dos provincias distintas. El resultado

observado en el dendrograma por muestras del apartado 4.2 confirma estos

resultados. En ese dendrograma las 4 muestras de las poblaciones R04 y R05 se


P á g i n a | 59

agrupaban juntas en un mismo cluster, mientras que las dos muestras de la

provincia R08 aparecían en grupos muy separados entre sí. En este dendrograma

por poblaciones este hecho se refleja en un menor grado de relación entre las

poblaciones de la provincia V que las de la VII.

También se aprecia que, según este análisis, las relaciones genéticas más

estrechas aparecen entre las poblaciones R12 (Soto del Real) y R15 (Torrejón el

Rubio), que también aparecían agrupadas juntas en el dendrograma por individuos.

Aunque ambas poblaciones pertenecen a provincias biogeográficas distintas (IX y X,

respectivamente), los lugares geográficos de recogida de muestra se encuentran a

una distancia de unos 300 km (ver figura 8), lo cual puede ser considerado como

una distancia relativamente pequeña si se tienen en cuenta las distancias medias de

las poblaciones incluidas en este trabajo.

4.4. Correlaciones entre distancias genéticas, geográficas y ambientales

4.4.1.‐ Correlación entre las distancias geográficas y genéticas

Las distancias entre los puntos de recogida de las muestras se utilizaron para

elaborar una matriz de distancias geográficas (Anejo III, tabla A4). Estas distancias

se estimaron de forma lineal sobre un mapa de la Península Ibérica. Hay que tener

en cuenta que entre dichos puntos se suceden diversos accidentes geográficos

(cordilleras, sierras, ríos, etc.) y ello afecta a las conclusiones que podamos sacar del

análisis de su correlación con la matriz de distancias genéticas.

La matriz de distancias genéticas obtenida en el apartado anterior y la matriz

de distancias geográficas elaborada se compararon mediante un test de Mantel

(1967), usando el programa NTSYS. El grado de correlación obtenido entre ambas

matrices fue de 0.2211 (P = 0,074), valor que resulta no ser significativo y además


P á g i n a | 60

bastante bajo, lo que pudiera estar justificado por los distintos accidentes

geográficos, que impiden el flujo genético entre poblaciones.

El hecho de que no haya una correlación entre la matriz de distancias

genéticas y geográficas, junto con el alto grado de diversidad de las muestras de

romero analizadas hasta el momento en este trabajo, ponen de manifiesto el alto

grado de relación entre las distintas poblaciones de romero de la Península, no

detectándose un proceso de aislamiento geográfico que reduzca el flujo génico.

Cuando esto ocurre, lo cual se ha detectado en diversos trabajos de análisis de

estructura poblacional de especies endémicas, las cuales suelen presentar una

reducida distribución geográfica, suele establecerse una alta correlación entre la

matriz de distancias genéticas y geográficas como un reflejo del aislamiento

geográfico de las poblaciones que conduce a una mayor diferenciación entre

poblaciones (Cardoso et al., 1998; Martín et al., 1999; Martín y Hernández‐Bermejo,

2000).

4.4.2.‐ Correlaciones entre las distancias ambientales y genéticas

Se quiso analizar el efecto que algunos factores ambientales pudieran tener

relación con la diversidad de las poblaciones estudiadas. Así se propusieron tres

variables a considerar: altitud, temperatura y precipitación anual (tabla 7).


P á g i n a | 61

Tabla 7. Datos climáticos de los puntos de recogida de las muestras.

Población Término Provincia Datos ambientales

Alt. (m) Tm (ºC) Pm (mm)

R01‐00 Turre Almería 240 18,7 196 R04‐00 Valdeconcha Guadalajara 750 14,1 378 R05‐00 Argamasilla de Alba Ciudad Real 740 14,7 396 R06‐00 Alcaraz Albacete 1220 13,6 367 R07‐00 Villena Alicante 600 17,8 336 R08‐00 Algimia de Almoacid Castellón 700 17,0 442 R09‐00 San Martín de la Virgen del Moncayo Zaragoza 760 15,0 318 R10‐00 Loporzano Huesca 750 13,6 535 R11‐00 Leciñena Zaragoza 680 15,0 318 R12‐00 Soto del Real Madrid 1140 6,4 1326 R15‐01 Torrejón el Rubio Cáceres 460 16,1 523 R19‐01 Tabernas Almería 550 18,7 196 R21‐01 Conil de la Frontera / Chiclana Cádiz 20 17,1 603

Alt. (m) = Altitud Tm (ºC) = Temperatura media anual Pm (mm.) = Precipitación media anual (Ninyerola et al., 2005. http://opengis.uab.es/wms/iberia/index.htm)

A partir de los datos mostrados en la tabla 7, se calculó la matriz de distancia

ambiental conjunta (Anejo III, tabla A5), mediante el cálculo de las distancias

euclídeas, según la expresión:

( ) ( ) ( )2 2 212 1 2 1 2 1 210 m m m md Alt Alt x T T P P= − + − + −

donde los valores de la temperatura fueron ponderados (Tm x 10), con la finalidad

de manejar datos dentro de un mismo rango de valores. Igualmente, se calcularon

las matrices de distancias ambientales parciales para cada una de las variables

citadas (Anejo III, tablas A6, A7 y A8) a través de las expresiones:

( )212 1 2 1 2d Alt Alt Alt Alt= − = −

Altitud

( )212 1 2 1 2m m m md T T T T= − = −

Temperatura


P á g i n a | 62

( )212 1 2 1 2m m m md P P P P= − = −

Precipitación

Mediante la realización de un test de Mantel (1967) se calculó el grado de

correlación presente entre la matriz de distancias genéticas y las distintas matrices

ambientales mencionadas, total y parciales. El grado de correlación alcanzado fue

bajo para todas ellas (tabla 8).

Tabla 8. Correlaciones entre la matriz de distancias genética y las matrices ambientales (total y parciales).

Comparación entre matrices Correlación (r) Pvalue

d.ambiental total – d.genéticas ‐ 0,00039 0,9990 > 0,05 d.amb_altitud – d.genéticas 0,02182 0,8412 > 0,05 d.amb_temperatura – d.genéticas ‐ 0,18577 0,1096 > 0,05 d.amb_precipitación – d.genéticas 0,00321 0,9610 > 0,05

Estos resultados parecen indicar que no existe una relación clara entre los

parámetros ambientales considerados y las diferencias genéticas encontradas en las

poblaciones estudiadas en este trabajo. Hay que tener en cuenta que el grado de

diversidad genética reflejada en los análisis realizados hasta el momento en estas

muestras de romero es bastante alto y que se trata de una especie con una amplia

distribución geográfica y capaz de adaptarse a un amplio rango de condiciones

ambientales.

4.5. Diversidad genética

Para evaluar la diversidad genética de las muestras incluidas en este trabajo

se han realizado los siguientes análisis: estimación de la diversidad genética

mediante la expresión de Nei (1973) y el análisis de la varianza molecular (AMOVA).


P á g i n a | 63

Estos estudios nos aportan información complementaria con el fin de

caracterizar la estructura genética de las poblaciones analizadas a nivel global, por

provincias biogeográficas y por población individual.

4.5.1. Diversidad genética según Nei

La diversidad genética según Nei (1973) viene dada por la expresión:

21 1 l u luh m P= − ∑ ∑ Nei (1973)

donde Plu es la frecuencia de la banda ‘u’ en el locus ‘l‘ y ‘m’ es el número de loci.

La diversidad genética (h), calculada con el programa PopGene según Nei

(1973), se estimó analizando las bandas generadas por los RAPDs, por un lado las

bandas totales (mono y polimórficas) y, por otro lado, las exclusivamente

polimórficas. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 9. En los cálculos

realizados con el programa PopGene se han llevado a cabo con la opción del

programa de equilibrio de Hardy‐Weinberg.

Diversidad genética para el total de poblaciones

En los resultados de la diversidad total encontramos un valor medio de ‘h’ de

0,2009 (d.e.: 0,1966), mientras que para la debida sólo a las bandas polimórficas ‘hp‘

toma un valor de 0,3105 (d.e.: 0,1590). Ambos valores son bajos, aunque era

esperado un valor mayor asociado a las bandas exclusivamente polimórfica.

Sería de esperar un valor más alto para una especie de distribución tan

amplia. Segarra‐Moragues et al. (2005) obtuvieron un valor de h = 0,38 para la

especie Borderea chouardii. No hay que olvidar que todos los valores de diversidad


P á g i n a | 64

genética calculados en este trabajo se han obtenido a partir de muestras que son

mezcla de varios individuos, lo cual reduce los valores de diversidad.

Diversidad genética por provincias biogeográficas

Para analizar los datos de la tabla 9, lo primero que hay que tener en cuenta

es que no es lo mismo considerar provincias con una o con dos poblaciones, y que

siempre hay sólo dos muestras de pool de individuos por población. Por tanto, estos

valores que se ofrecen son meramente indicativos y sirven para comparar

provincias con la misma representación.

Tabla 9. Diversidad genétcia según Nei (1973) para bandas totales y bandas polimórficas.

Provincias biogeográficas Poblaciones Bandas totales (h) Bandas polimórficas (hp)

Media d.e. Media d.e.

prov I [Pirenaica] R10 0,0975 0,1775 0,1506 0,2023

prov IV [Aragonesa] R11 0,0081 0,0580 0,0126 0,0721

prov V [Catalana – Valenciano ‐ Provenzal] R07 R08 0,1058 0,1875 0,1635 0,2126

prov VII [Castellano – Mestrazgo ‐ Manchega] R04 R05 0,0913 0,1661 0,1411 0,1893

prov VIII [Murciano ‐ Almeriense] R1 R19 0,1016 0,1788 0,1570 0,2024

prov IX [Carpetano – Ibérico ‐ Leonesa] R09 R12 0,1429 0,2125 0,2208 0,2298

prov X [Luso ‐ Extremadurense] R15 0,0244 0,0984 0,0377 0,1209

prov XI [Gaditano – Onubo ‐ Algarviense] R21 0,0081 0,0580 0,0126 0,0721

prov XII [Bética] R06 0,0569 0,1440 0,0879 0,1720

Como ya se explicó en el apartado de Material y Métodos, la Península Ibérica

queda dividida en 12 provincias biogeográficas, de las cuales son las provincias V

(Catalana – Valenciano – Provenzal), VII (Castellano – Mestrazgo – Manchega), VIII

(Murciano – Almeriense) y IX (Carpetano – Ibérico – Leonesa), las que cuentan con

al menos dos poblaciones por provincia biogeográfica en este trabajo. Sin embargo,

de éstas sólo las provincias VII y IX habrán de considerarse que cuenta con dos

poblaciones, porque de las otras dos provincias (V y VIII) hubo que eliminar la

poblaciones R07 y R19, respectivamente, debido a que ambas cuentan con una


P á g i n a | 65

única muestra por población y dificultan tanto los cálculos como las conclusiones

que se puedan sacar.

Como se puede apreciar, los valores medios de la diversidad varían dentro del

rango de 0,0081 (d.e.: 0,0580) a 0,1429 (d.e.: 0,2125) en el caso de bandas totales (h)

y de 0,0126 (d.e.: 0,0721) a 0,2208 (d.e.: 0,2298) para el caso de bandas polimórficas

(hp).

Por un lado, tanto en el primer caso como en el segundo, el resultado menor

corresponde a la provincia XI (Gaditano – Onubo – Algarviense) que está constituida

por una única población con dos muestras, la R21 (Conil de la Frontera / Chiclana);

esta población fue la que presentó en el dendrogama uno de los coeficientes de

similitud más altos entre muestras. En contraposición, tanto en el primer caso como

en el segundo, el resultado mayor corresponde a la provincia IX (Carpetano –

Ibérico – Leonesa) que está constituida por las poblaciones de San Martín de la

Virgen del Moncayo (R09) y Soto del Real (R12).

Diversidad genética para cada población

Como se aprecia en la tabla 10, los valores de las poblaciones que

corresponden a provincias en las que sólo se ha considerado una población siguen

siendo los mismos. A este nivel de estudio, no se pudo estimar ni la diversidad

genética total (h), ni por bandas polimórficas (hp) de las poblaciones de Villena

(R07) y Tabernas (R19), debido a que sólo se cuenta con una muestra para tales

poblaciones. Para el resto, los valores de la diversidad varían dentro del rango de

0,0081 (d.e.: 0,0580) a 0,0975 (d.e.: 0,1775) para el caso de bandas totales (h) y de

0,0126 (d.e.: 0,0721) a 0,1506 (d.e.: 0,2023) para el caso de bandas polimórficas (hp).

Son en general valores muy bajos a causa, como ya se ha explicado, del tipo de

muestras analizadas.


P á g i n a | 66

Los valores más bajos son los alcanzados por las poblaciones de Leciñena

(R11) y de Conil de la Frontera / Chiclana (R21), mientras que el más alto por la

población de Loporzano (R10). Este resultado no ha de ser considerado como

representativo, debido a que el estudio por poblaciones está limitado por la

condición de las muestras manejadas en este trabajo, que son mezclas de varios

individuos. Para contar con resultados de mayor significación se habrán de realizar

estudios posteriores con muestras únicas de individuos y aumentando el tamaño de

muestra recogido por población.

Tabla 10. Diversidad para cada población según Nei (1973).

Población Bandas totales (h) Bandas polimórficas (hp)

Media d.e. Media d.e.

R01 0,0487 0,1348 0,0753 0,1622 R04 0,0569 0,1440 0,0879 0,1720 R05 0,0569 0,1440 0,0879 0,1720 R06 0,0569 0,1440 0,0879 0,1720 R07 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 R08 0,0812 0,1661 0,1255 0,1933 R09 0,0406 0,1244 0,0628 0,1508 R10 0,0975 0,1775 0,1506 0,2023 R11 0,0081 0,0580 0,0126 0,0721 R12 0,0325 0,1125 0,0502 0,1373 R15 0,0244 0,0984 0,0377 0,1209 R19 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 R21 0,0081 0,0580 0,0126 0,0721

En todos los casos ellos se ha partido de la suposición inicial de equilibrio de Hardy – Weinberg.

4.5.2. Análisis de la varianza molecular (AMOVA)

Los resultados aportados por el AMOVA (tabla 11) permiten hacer un reparto

de la variabilidad total detectada en los análisis de los marcadores moleculares

realizados en tres niveles distintos. Considerando la diversidad presente dentro de

las poblaciones consideradas, entre las poblaciones comprendidas dentro de una

misma zona o región establecida y entre las diferentes regiones.


P á g i n a | 67

En este análisis se han considerado como regiones las provincias

biogeográficas especificadas en Material y Métodos (tabla 2). Hay que tener en

cuenta que la mayoría de estas provincias (‘regiones’) viene representada por una

única población y éstas a su vez por tan sólo dos muestras. Este hecho hace que,

aunque el análisis permite el reparto de la varianza en los tres niveles mencionados,

la discusión de los resultados en este trabajo se centre en la partición de la variación

entre y dentro de regiones ya que sería el caso que mejor se ajuste al tipo de datos

manejados.

Tabla 11. Resultado del AMOVA de poblaciones de romero a distintos niveles.

Componente variación % total de la varición

ANÁLISIS GLOBAL Variación entre grupos V(A): 1,03688679250 12.59 %

Variación entre poblaciones dentro de grupos V(B): 3,1261363620 37.96 %

Variación dentro de poblaciones V(C): 4,0727272720 49.45 %

ANÁLISIS DE POBLACIONES

Variación entre poblaciones V(A): 4,12531818180 50.32 % Variación dentro de poblaciones V(B): 4,07272727270 49.68 %

ANÁLISIS DE REGIONES

Variación entre regiones V(A): 3,23289550070 39.10 % Variación dentro de regiones V(B): 5,03461538460 60.90 %

El reparto de la variación en este nivel muestra una variación del 39%

atribuible a las diferencias entre regiones y del 61% a las encontradas dentro de

regiones.

En estudios similares de especies con polinización cruzada los valores de la

variación dentro de regiones suelen ser ligeramente superiores (p.e. Martín et al.,

1999; Martín y Hernández Bermejo, 2000), pero en este caso hay que tener en

cuenta que los valores son más bajos porque se están considerando regiones en las

que realmente sólo hay una población.


P á g i n a | 68

Para poder abordar en profundidad este análisis sería necesario poder

estudiar un mayor número de muestras de cada población, o al menos tener

representadas todas las provincias biogeográficas con más de una población.

4.6. Conclusiones

Este trabajo ha permitido establecer la metodología para el uso de

marcadores moleculares tipo RAPD en el estudio de la diversidad genética presente

en las poblaciones de Rosmarinus officinalis distribuidas por una gran parte de la

Península Ibérica.

Los resultados obtenidos muestran la alta diversidad existente entre las

poblaciones analizadas. Asimismo los marcadores empleados han permitido

establecer la singularidad de las poblaciones de las que proceden las muestras de

semillas conservadas en el banco de Germoplasma de la UPM correspondientes a

las mismas poblaciones estudiadas, ya que ninguna de las muestras analizadas

mostraba el mismo patrón de marcadores, incluso entre muestras de la misma

población.

El tipo de muestras empleadas en este trabajo, mezcla de individuos de una

misma población, fue elegido porque permite abordar el análisis de un mayor

número de poblaciones al mismo tiempo sin que cada población quede reducida a

un único genotipo (correspondiente a sólo un individuo). Este tipo de muestras se

utilizan con frecuencia por ejemplo en el análisis de accesiones de bancos de

germoplasma (Martín et al., 1997). El empleo de este tipo de muestras ha permitido

en este trabajo poder establecer unos resultados preliminares acerca de las

diferencias interpoblacionales en romero a partir del análisis de unas pocas

muestras.


P á g i n a | 69

El estudio de las poblaciones teniendo en cuenta la división en provincias

biogeográficas ha puesto de manifiesto ciertas diferencias entre las distintas

provincias aunque no de forma general en todos los casos. Los dendrogramas

obtenidos muestran por ejemplo un alto grado de relación entre las dos

poblaciones analizadas de la provincia VII, pero al mismo tiempo también revelan

pocas diferencias entre otras provincias, ya que aparecen muestras de poblaciones

de distintas provincias agrupadas juntas.

La falta de correlación observada entre la matriz de distancias genéticas y las

matrices de distancias geográficas y ambientales refuerza esta hipótesis de falta de

diferenciación entre las distintas provincias biogeográficas. Estos datos reflejarían

un alto grado de flujo génico entre las distintas poblaciones de romero de la

península que están además distribuidas de manera continua en una amplia zona,

dando como resultado un alto grado de diversidad. Si bien no parece haber una

diferencia significativa entre las distintas provincias, hay que tener en cuenta que en

este análisis ninguna muestra presentó una similitud del 100% con ninguna otra.

Para poder corroborar estos primeros resultados sería necesario ampliar el

número de poblaciones estudiadas por cada una de las provincias biogeográficas.

Una de las poblaciones incluidas en este estudio estaba inicialmente

determinada como Rosmarinus eriocalyx (población R19), y como tal ha sido

conservada la muestra correspondiente en el Banco de Germoplasma de la UPM.

Los análisis realizados en este trabajo no parecen confirmar esta determinación, ya

que la muestra de dicha población no aparece claramente separada del resto de

muestras de R. officinalis. La explicación pudiera estar, bien en un error en la

determinación del material vegetal en origen o en que se trate de un híbrido entre

ambas especies. Para poder confirmar la identificación de la población R19 y

comprobar que se trata realmente de un fenómeno de hibridación sería necesario

incluir en el análisis mediante marcadores moleculares una muestra de la que se

tuviera la certeza que corresponde a R. eriocalyx. Sin embargo, el hecho de que haya


P á g i n a | 70

poblaciones, de las que hay certeza de que son realmente R.officinalis, y que

muestran muchas más diferencias, como es la población R09 de San Martín de la

Virgen del Moncayo, hacen pensar que la posición en el dendrograma de R19 se

deba más a un error de determinación que a un caso de hibridación.

Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de la caracterización de

los recursos fitogenéticos y la necesidad de abordar el estudio de las muestras que

de una manera u otra van a ser sometidas a procesos de conservación (Callow et al.,

1997).

Desde la perspectiva de la conservación, la estimación exacta de la diversidad

genética dentro y entre poblaciones es de gran importancia para el correcto diseño

de estrategias de conservación y gestión de los recursos genéticos de una especie

(Martín y Hernández Bermejo, 2000). En este trabajo sólo se ha podido abordar el

análisis entre poblaciones, ya que como ha quedado reflejado en los resultados,

para poder establecer el análisis de diversidad intrapoblacional es necesario el

estudio de los individuos de la población de manera independiente.

Estudio de la diversidad de poblaciones de Rosmarinus sp. de la Península Ibérica mediante RAPDs VV.. BBiibblliiooggrraaffííaa

P á g i n a | 71

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6. Anejos

Anejo I. Relación de las soluciones empleadas durante en los ensayos de

laboratorio.

Tampón CTAB

Composición Cantidad

2% hexadeciltrimetilamonio bromuro (CTAB, p/v) 10 g

100 mM tris‐HCl, pH 8,0 6,05 g en 500 ml (medir pH=8)

1,4 M NaCl 40,90 g

20 mM EDTA 3,72 g

Tampón de extracción.


CTAB buffer (p/v) 20 mL bisulfito sódico (3,8 g/L) 0,076 g β‐mercaptoetanol (0,2% v/v) 40 μL PVP (1% p/v) 0,2 g

10 x TBE (para 1 litro).

Composición Cantidad Tris 109,0 g Ácido bórico 55,6 g 0,5 M Na2 EDTA, pH=8,0 40,0 mL

Na2EDTA a concentración 0,5 M y pH = 8,0 (para 1 litro).


Na2 EDTA – 2H2O 18,6 g Disolvemos en 70 mL de H2O Ajustar pH=8,0 con 10M NaOH (no se disuelve hasta que no llega a este pH). Añadir agua hasta 100 mL*

* agua destilada y exenta (Bi‐hidro 10m) BiBraun Medical S.A.


P á g i n a | 79

10 x Tampón de carga.


Ficoll 400 20 g 0,2 M EDTA 37,5 mL Azul de bromofenol 100 mg Agua destilada 42, 4 mL

Marcador de pares de bases.


Agua destilada esterilizada 800 μL 10 x tampón de carga 150 μL marcador 50 μL


P á g i n a | 80

Anejo II. Imágenes de algunos geles con los productos de amplificación de RAPDs

obtenidos durante la fase experimental.

Fig. A1. Primer OPF_13 (03.05.06).

Fig. A2. Primer OPO_07 (11.05.06).


P á g i n a | 81

Fig. A3. Primer OPO_10 (10.05.04).

Fig. A4. Primer OPO_15 (11.05.06).


P á g i n a | 82

Fig. A5. Primer OPO_20 (01.03.02).


P á g i n a | 83

Anejo III. Tablas de los productos de amplificación y de sus análisis.

Tabla A1. Matriz de datos – RAPDs (NTSYSpc 2.2). Muestras eliminadas R7.4 y R19.1.

51 marcadores Q. T. R1.1 R1.4 R4.1 R4.4 R5.1 R5.4 R6.1 R6.4 R7.1 R8.1 R8.4 R9.1 R9.4 R10.1 R10.4 R11.1 R11.4 R12.1 R12.4 R15.1 R15.4 R19.4 R21.7 R21.10

OPF 13 07 1.1 1.4 4.1 4.4 5.1 5.4 6.1 6.4 7.1 8.1 8.4 9.1 9.4 10.1 10.4 11.1 11.4 12.1 12.4 15.1 15.4 19.4 21.7 21.10 OPF 13_1800 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPF 13_1700 P 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 OPF 13_1500 P 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPF 13_1300 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPF 13_1200 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPF 13_950 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPF 13_650 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPO 07 14 1.1 1.4 4.1 4.4 5.1 5.4 6.1 6.4 7.1 8.1 8.4 9.1 9.4 10.1 10.4 11.1 11.4 12.1 12.4 15.1 15.4 19.4 21.7 21.10 OPO 07_1300 P 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 OPO 07_1200 P 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 OPO 07_1100 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 07_1000 P 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 07_950 P 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 OPO 07_900 P 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 07_850 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 07_800 P 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 OPO 07_700 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 07_675 P 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 OPO 07_550 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 07_500 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 07_325 P 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

continúa …


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…continuación

OPO 10 09 1.1 1.4 4.1 4.4 5.1 5.4 6.1 6.4 7.1 8.1 8.4 9.1 9.4 10.1 10.4 11.1 11.4 12.1 12.4 15.1 15.4 19.4 21.7 21.10 OPO 10_2300 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 10_1400 P 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 OPO 10_1200 P 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 OPO 10_950 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 10_900 P 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 10_850 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 10_775 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 10_650 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 10_600 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPO 15 07 1.1 1.4 4.1 4.4 5.1 5.4 6.1 6.4 7.1 8.1 8.4 9.1 9.4 10.1 10.4 11.1 11.4 12.1 12.4 15.1 15.4 19.4 21.7 21.10 OPO 15_2000 P 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 15_1800 P 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 OPO 15_1400 P 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 OPO 15_1350 P 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 OPO 15_1000 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 15_950 P 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OPO 15_800 M º 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

continúa …


P á g i n a | 85


…continuación

OPO 20 15 1.1 1.4 4.1 4.4 5.1 5.4 6.1 6.4 7.1 8.1 8.4 9.1 9.4 10.1 10.4 11.1 11.4 12.1 12.4 15.1 15.4 19.4 21.7 21.10 OPO 20_2000 P 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1

OPO 20_1650 P 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OPO 20_1600 P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OPO 20_1450 P 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1

OPO 20_1300 P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OPO 20_1250 P 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1

OPO 20_1200 P 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1

OPO 20_1150 P 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0

OPO 20_1125 P 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

OPO 20_900 P 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0

OPO 20_700 P 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

OPO 20_600 P 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0

OPO 20_550 P 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0

OPO 20_500 P 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1

OPO 20_450 P 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1

* Q = cantidad de bandas generadas por marcador T = tipo de banda M = monomófica P = polimórfica.


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Tabla A2. Matriz de similitud de JACCARD (NTSYSpc 2.2).

R1.1 R1.4 R4.1 R4.4 R5.1 R5.4 R6.1 R6.4 R7.1 R8.1 R8.4 R9.1 R9.4 R10.1 R10.4 R11.1 R11.4 R12.1 R12.4 R15.1 R15.4 R19.4 R21.7 R21.10

R1.1 1,000 R1.4 0,838 1,000 R4.1 0,675 0,711 1,000 R4.4 0,744 0,784 0,806 1,000 R5.1 0,756 0,707 0,816 0,842 1,000 R5.4 0,825 0,732 0,750 0,868 0,829 1,000 R6.1 0,698 0,690 0,667 0,732 0,705 0,727 1,000 R6.4 0,721 0,600 0,651 0,714 0,727 0,750 0,833 1,000 R7.1 0,842 0,744 0,675 0,789 0,756 0,780 0,698 0,762 1,000 R8.1 0,769 0,718 0,650 0,763 0,690 0,714 0,674 0,738 0,865 1,000 R8.4 0,643 0,718 0,650 0,718 0,651 0,636 0,756 0,780 0,725 0,744 1,000 R9.1 0,725 0,634 0,692 0,718 0,775 0,756 0,674 0,738 0,769 0,744 0,619 1,000 R9.4 0,744 0,650 0,625 0,692 0,707 0,732 0,651 0,674 0,744 0,763 0,595 0,681 1,000 R10.1 0,763 0,806 0,684 0,806 0,725 0,750 0,667 0,651 0,861 0,784 0,737 0,737 0,667 1,000 R10.4 0,829 0,738 0,674 0,738 0,750 0,773 0,696 0,756 0,786 0,805 0,721 0,682 0,698 0,714 1,000 R11.1 0,738 0,732 0,667 0,775 0,829 0,767 0,652 0,711 0,698 0,674 0,714 0,674 0,651 0,750 0,773 1,000 R11.4 0,714 0,750 0,643 0,795 0,805 0,744 0,630 0,689 0,714 0,690 0,732 0,651 0,628 0,769 0,750 0,974 1,000 R12.1 0,750 0,838 0,718 0,838 0,756 0,738 0,738 0,682 0,795 0,769 0,683 0,725 0,659 0,861 0,705 0,780 0,800 1,000 R12.4 0,750 0,789 0,718 0,838 0,800 0,738 0,738 0,682 0,750 0,725 0,605 0,683 0,659 0,763 0,705 0,738 0,756 0,892 1,000 R15.1 0,769 0,861 0,737 0,811 0,732 0,756 0,756 0,622 0,725 0,700 0,619 0,659 0,634 0,784 0,682 0,714 0,732 0,917 0,865 1,000 R15.4 0,750 0,789 0,718 0,789 0,756 0,738 0,738 0,644 0,707 0,683 0,568 0,643 0,619 0,718 0,705 0,698 0,714 0,842 0,944 0,917 1,000 R19.4 0,700 0,784 0,585 0,737 0,667 0,651 0,732 0,674 0,700 0,718 0,675 0,595 0,650 0,711 0,698 0,732 0,750 0,789 0,838 0,763 0,789 1,000 R21.7 0,750 0,744 0,718 0,790 0,756 0,738 0,738 0,644 0,707 0,725 0,605 0,683 0,659 0,675 0,744 0,698 0,714 0,795 0,842 0,865 0,892 0,700 1,000 R21.10 0,725 0,718 0,692 0,763 0,732 0,714 0,714 0,622 0,683 0,700 0,581 0,659 0,634 0,650 0,721 0,674 0,690 0,769 0,816 0,838 0,865 0,675 0,971 1,000


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Tabla A3. Matriz de similitud de DICE (NTSYSpc 2.2).

R1.1 R1.4 R4.1 R4.4 R5.1 R5.4 R6.1 R6.4 R7.1 R8.1 R8.4 R9.1 R9.4 R10.1 R10.4 R11.1 R11.4 R12.1 R12.4 R15.1 R15.4 R19.4 R21.7 R21.10

R1.1 1,000 R1.4 0,912 1,000 R4.1 0,806 0,831 1,000 R4.4 0,853 0,879 0,892 1,000 R5.1 0,861 0,829 0,899 0,914 1,000 R5.4 0,904 0,845 0,857 0,930 0,907 1,000 R6.1 0,822 0,817 0,800 0,845 0,827 0,842 1,000 R6.4 0,838 0,750 0,789 0,833 0,842 0,857 0,909 1,000 R7.1 0,914 0,853 0,806 0,882 0,861 0,877 0,822 0,865 1,000 R8.1 0,870 0,836 0,788 0,866 0,817 0,833 0,806 0,849 0,928 1,000 R8.4 0,783 0,836 0,788 0,836 0,789 0,778 0,861 0,877 0,841 0,853 1,000 R9.1 0,841 0,776 0,818 0,836 0,873 0,861 0,806 0,849 0,870 0,853 0,765 1,000 R9.4 0,853 0,788 0,769 0,818 0,829 0,845 0,789 0,806 0,853 0,866 0,746 0,925 1,000 R10.1 0,866 0,892 0,813 0,892 0,841 0,857 0,800 0,789 0,925 0,879 0,848 0,848 0,800 1,000 R10.4 0,907 0,849 0,806 0,849 0,857 0,872 0,821 0,861 0,880 0,892 0,838 0,811 0,822 0,833 1,000 R11.1 0,849 0,845 0,800 0,873 0,907 0,868 0,789 0,831 0,822 0,806 0,833 0,806 0,789 0,857 0,872 1,000 R11.4 0,833 0,857 0,783 0,886 0,892 0,853 0,773 0,816 0,833 0,817 0,845 0,789 0,771 0,870 0,857 0,987 1,000 R12.1 0,857 0,912 0,836 0,912 0,861 0,849 0,849 0,811 0,886 0,870 0,812 0,841 0,794 0,925 0,827 0,877 0,889 1,000 R12.4 0,857 0,882 0,836 0,912 0,889 0,849 0,849 0,811 0,857 0,841 0,754 0,812 0,794 0,866 0,827 0,849 0,861 0,943 1,000 R15.1 0,870 0,925 0,848 0,896 0,845 0,861 0,861 0,767 0,841 0,824 0,765 0,794 0,776 0,879 0,811 0,833 0,845 0,957 0,928 1,000 R15.4 0,857 0,882 0,836 0,882 0,861 0,849 0,849 0,784 0,829 0,812 0,725 0,783 0,765 0,836 0,827 0,822 0,833 0,914 0,971 0,957 1,000 R19.4 0,824 0,879 0,738 0,848 0,800 0,789 0,845 0,806 0,824 0,836 0,806 0,746 0,788 0,831 0,822 0,845 0,857 0,882 0,912 0,866 0,882 1,000 R21.7 0,857 0,853 0,836 0,822 0,861 0,849 0,849 0,784 0,829 0,841 0,754 0,812 0,794 0,806 0,853 0,822 0,833 0,886 0,914 0,928 0,943 0,824 1,000 R21.10 0,841 0,836 0,818 0,866 0,845 0,833 0,833 0,767 0,812 0,824 0,735 0,794 0,776 0,788 0,838 0,806 0,817 0,870 0,899 0,912 0,928 0,806 0,986 1,000


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Tabla A4. Matriz de distancias geográficas (Km.).

R01 R04 R05 R06 R07 R08 R09 R10 R11 R12 R15 R19 R21

R01 0,00

R04 521,60 0,00

R05 326,00 215,16 0,00

R06 228,20 299,92 104,32 0,00

R07 260,80 365,12 254,28 169,52 0,00

R08 469,44 299,92 332,52 312,96 208,64 0,00

R09 723,72 247,76 449,88 508,56 508,56 339,04 0,00

R10 808,48 404,24 580,28 612,88 560,72 358,60 182,56 0,00

R11 743,28 345,56 515,08 547,68 495,52 293,40 143,44 65,200 0,00

R12 606,36 123,88 280,36 378,16 475,96 423,80 286,88 462,92 410,76 0,00

R15 632,44 378,16 371,64 469,44 625,92 658,52 586,80 762,84 710,68 299,92 0,00

R19 45,640 521,60 312,96 221,68 286,88 489,00 730,24 821,52 756,32 593,32 599,840 0,00

R21 534,64 743,28 567,24 638,96 717,20 886,72 991,04 1134,48 1069,28 730,24 521,60 489,00 0,00

Tabla A5. Matriz de distancias ambientales conjunta.

R01 R04 R05 R06 R07 R08 R09 R10 R11 R12 R15 R19 R21

R01 00,00

R04 543,45 00,00

R05 540,00 21,45 00,00

R06 996,11 470,16 481,00 00,00

R07 386,37 160,10 155,44 622,19 00,00

R08 521,92 86,24 65,15 526,48 145,95 00,00

R09 535,40 61,49 80,58 462,81 163,43 139,20 00,00

R10 636,47 202,19 192,92 513,91 298,54 188,71 256,50 00,00

R11 458,10 92,63 98,45 542,40 86,65 127,18 80,00 265,70 00,00

R12 1449,84 1027,98 1015,77 965,02 1133,44 993,12 1080,68 883,36 1111,33 00,00

R15 394,97 324,85 307,77 776,25 234,22 253,46 363,52 325,53 300,91 1056,70 00,00

R19 310,00 274,30 278,75 693,36 148,93 288,63 245,67 430,10 182,08 1280,68 340,15 00,00

R21 462,93 764,48 749,55 1223,49 638,54 698,80 793,26 749,87 719,21 1337,38 447,33 668,43 00,00


P á g i n a | 89

Tabla A6. Matriz de distancias ambientales – Altitud.

R01 R04 R05 R06 R07 R08 R09 R10 R11 R12 R15 R19 R21

R01 00,00 R04 543,45 00,00 R05 540,00 21,45 00,00 R06 996,11 470,16 481,00 00,00 R07 386,37 160,10 155,44 622,19 00,00 R08 521,92 86,24 65,15 526,48 145,95 00,00 R09 535,40 61,49 80,58 462,81 163,43 139,20 00,00 R10 636,47 202,19 192,92 513,91 298,54 188,71 256,50 00,00 R11 458,10 92,63 98,45 542,40 86,65 127,18 80,00 265,70 00,00 R12 1449,84 1027,98 1015,77 965,02 1133,44 993,12 1080,68 883,36 1111,33 00,00 R15 394,97 324,85 307,77 776,25 234,22 253,46 363,52 325,53 300,91 1056,70 00,00 R19 310,00 274,30 278,75 693,36 148,93 288,63 245,67 430,10 182,08 1280,68 340,15 00,00 R21 462,93 764,48 749,55 1223,49 638,54 698,80 793,26 749,87 719,21 1337,38 447,33 668,43 00,00

Tabla A7. Matriz de distancias ambientales – Temperatura.

R01 R04 R05 R06 R07 R08 R09 R10 R11 R12 R15 R19 R21

R01 00,00 R04 543,45 00,00 R05 540,00 21,45 00,00 R06 996,11 470,16 481,00 00,00 R07 386,37 160,10 155,44 622,19 00,00 R08 521,92 86,24 65,15 526,48 145,95 00,00 R09 535,40 61,49 80,58 462,81 163,43 139,20 00,00 R10 636,47 202,19 192,92 513,91 298,54 188,71 256,50 00,00 R11 458,10 92,63 98,45 542,40 86,65 127,18 80,00 265,70 00,00 R12 1449,84 1027,98 1015,77 965,02 1133,44 993,12 1080,68 883,36 1111,33 00,00 R15 394,97 324,85 307,77 776,25 234,22 253,46 363,52 325,53 300,91 1056,70 00,00 R19 310,00 274,30 278,75 693,36 148,93 288,63 245,67 430,10 182,08 1280,68 340,15 00,00 R21 462,93 764,48 749,55 1223,49 638,54 698,80 793,26 749,87 719,21 1337,38 447,33 668,43 00,00

Tabla A8. Matriz de distancias ambientales ‐ Precipitación.

R01 R04 R05 R06 R07 R08 R09 R10 R11 R12 R15 R19 R21

R01 00,00 R04 543,45 00,00 R05 540,00 21,45 00,00 R06 996,11 470,16 481,00 00,00 R07 386,37 160,10 155,44 622,19 00,00 R08 521,92 86,24 65,15 526,48 145,95 00,00 R09 535,40 61,49 80,58 462,81 163,43 139,20 00,00 R10 636,47 202,19 192,92 513,91 298,54 188,71 256,50 00,00 R11 458,10 92,63 98,45 542,40 86,65 127,18 80,00 265,70 00,00 R12 1449,84 1027,98 1015,77 965,02 1133,44 993,12 1080,68 883,36 1111,33 00,00 R15 394,97 324,85 307,77 776,25 234,22 253,46 363,52 325,53 300,91 1056,70 00,00 R19 310,00 274,30 278,75 693,36 148,93 288,63 245,67 430,10 182,08 1280,68 340,15 00,00R21 462,93 764,48 749,55 1223,49 638,54 698,80 793,26 749,87 719,21 1337,38 447,33 668,43 00,00


P á g i n a | 90

Anejo IV. Fórmulas utilizadas.

Fórmulas de los coeficientes de similitud de JACCARD y DICE.

ijaS

a b c=

+ + Jaccard (1908)

Donde:

a: nº de bandas comunes

b: nº de bandas sólo presentes en “i”

c: nº de bandas sólo presentes en “j”

22ij

aSa b c

=+ +

Dice (1945)

Donde:

a: nº de bandas comunes

b: nº de bandas sólo presentes en “i”

c: nº de bandas sólo presentes en “j”

En ambos coeficientes (Jaccard y Dice) lo que se viene a expresar es qué

porcentaje tienen en común las muestras. Así, en el numerador figura el número de

bandas comunes entre dos muestras comparadas, mientras que en el denominador

se recoge el número de bandas diferentes entre las dos muestras, el número de

bandas presentes en una muestra y no en la segunda, y viceversa. La diferencia

entre uno y otro, es que en el coeficiente de Dice se da un mayor peso a las bandas

comunes, por lo que los valores obtenidos a través de dicho coeficiente son un poco

mayores a los obtenidos con Jaccard.


P á g i n a | 91

Fórmula del cálculo de distancias genéticas según Nei (1978).

lnA A A A

X YXYD G G G⎛ ⎞

= − ⎜ ⎟⎝ ⎠ Nei (1978)

donde GX y GY son las medias de (2 nx Jx – 1)/(2 nx – 1) y (2 ny Jy – 1)/(2 ny – 1) de los r

loci estudiados, respectivamente, y GXY = JXY.

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TRABAJO FIN DE CARRERA «Estudio de la diversidad de poblaciones de romero (Rosmarinus sp.) de la Península Ibérica mediante RAPDs»