UNIVERSIDAD PEDAGOGICA EXPERIMENTAL LIBERTADOR

INSTITUTO PEDAGOGICO DE BARQUISIMETO"LUIS BELTRAN PRIETO FIGUEROA"

Bachilleres:Sánchez JoséBioquímica Paena 2008

Hidrólisis Química de Ácidos NucléicosHidrólisis Enzimática de Ácidos Nucléicos Estructura Primaria de Ácidos Nucléicos

Los ácidos nucléicos son macromoléculas biológicas

portadoras de información genética. Son

polímeros de elevado peso molecular

constituidos por bases orgánicas heterocíclicas,

hidratos de carbono (Pentosas) y ácido

fosfórico

Estructura General

Sus bases nitrogenadas son:

Pirimidas: como el Citosina (C) y Timina (T).

Purinas: como Adenina (A) y Guanina (G).

Para el ADN el hidrato de carbono presente es la desoxirribosa.

Sus bases nitrogenadas son:

Pirimidas: como el Uracilo (U) y Timina (T). Purinas: como Adenina (A) y Guanina (G).

Para el ARN el hidrato de carbono presente es la ribosa.

Hidrólis is Enzimática de ADNHidrólis is Enzimática de ADN

Endonucleasas: que rompen enlaces internucleotídicos del interior de la cadena .

Los ácidos nucleicos son hidrolizados

enzimáticamente por medio de: Exonucleasas: que

rompen los enlaces internucleotídicos de los extremos de la cadena.

Hidrólis is Enzimática de ADNHidrólis is Enzimática de ADN

Las Exonucleasas, liberan secuencialmente nuclósidos 5’ -fosfato o 3’ –fosfato, dependiendo de la especificidad de la rotura.

En la tabla que se presentará a continuación , se indican algunos de los tipos más importantes de exonucleasa.

Enzima Tipo de ataque

Macro molécula hidrolizada

Enlaces hidrolizados Productos formados

Fosfodiesteraza de veneno de serpiente

(FVS)

Exo RNA, DNAd pXpYp… Yn--- pZ Nucleósidos 5’ - Fosfato

Fosfodiesteraza de bazo bovino (FDB)

Exo RNA, DNAd XP---Yp… Yn pZp Nucleósidos 3’ – Fosfato

Exonucleasa de Bascillus subtillis

Exo RNA, DNAd

RNA, DNAn

HOXp---Yp…Z

pXpYp…p---ZOH

Nucleósidos 3’ – Fosfato

Fosfodiesterasa de L. acidophilus

Exo RNA, DNAd Xp---Yp…Yn pZ Nucleósidos 3’ - Fosfato

Nucleasa de Micrococo

Endo

ExoRNA, DNAd

Xp---Ap, Xp---Tp, XpYp-- Zp 3’ Terminal

Nucleósidos 3’ - Fosfato

Endonucleasa de Veneno

Endo RNA, DNAd Gp --- Gp Tri a Hepta Nucleósidos 5’ - Fosfato

Endonucleasa St Endo RNA, DNAd pXpYp… Yn--- pZ Mono a Penta Nucleósidos 5’ - Fosfato

Nucleasas InespecíficasNucleasas Inespecíficas

Hidrólisis Enzimática de ADNHidrólisis Enzimática de ADNLa Fosfodiesterasa de Veneno de Serpiente (FVS) comienza la hidrólisis por el extremo 3’ –terminal cuando este se encuentra libre de fosfato.

La Fosfodiesterasa de Bazo de Bovino (FDB)hidroliza a partir del extremo 5’ –terminal, cuando esta posición no está fosforilada.

La Fosfomonoesterasa (FME), como la fosfatasa alcalina de E. coli, liberan fosfato de las posiciones 2’, 3’, 5’, no actuando sobre los enlaces internucleotídicos.

PP P P

B1 B2 B3 B4 B5

OH OH + FVS

5’ 5’ 5’ 5’ 5’

3’ 3’ 3’ 3’ 3’

3’

OH

5’

P

Nucleósido 5’

Primero en regenerarse

TIPO DE RUPTURA:

PP

X Y

OH

3’ 3’

5’ 5’

FVS

X

3’

5’

B5

POH +

Y

3’

5’

OHP

ROMPIMIENTOS ENZIMÁTICOS EXTERNOS

(EXONUCLEASAS)

PP P P

B1 B2 B3 B4 B5

OH OH

5’ 5’ 5’ 5’ 5’

3’ 3’ 3’ 3’ 3’+ FDB

B1

OH

5’

3’

P

Nucleósido 3’

Primero en regenerarse

TIPO DE RUPTURA:

P P

X Y

5’ 5’

3’ 3’

OH

FDB

X

5’

3’

POH + P

5’

3’Y

OH

Cuando los extremos de un ologinucleótido se encuentran fosforilados:

5’ 5’ 5’ 5’

3’ 3’ 3’ 3’

PP P PP

B1 B2 B3 B4

+FME

E. coli

5’ 5’ 5’ 5’

3’ 3’ 3’ 3’

OHP P POH

B1 B2 B3 B4

+2 Pi

PIROFOSFATO

SE REESTRUCTURAN LOS OH

ROMPIMIENTOS ENZIMÁTICOS EXTERNOS

(ENDONUCLEASA)

PP P P

B1 B2 C B4 B5

P P

5’ 5’ 5’ 5’ 5’

3’ 3’ 3’ 3’ 3’

+ RIBONUCLEASA

PANCREAS

BASES PIRIMIDICAS:

C,T,U

P P P

B1 B2 C

P

5’ 5’ 5’

3’ 3’ 3’

Nucleótido con p-3’ Terminal

Pirimida

+ POH

B4 B5

P

5’ 5’

3’ 3’

BASES PURICAS:

A,G

PP P P

B1 B2 A B4 B5

P P

5’ 5’ 5’ 5’ 5’

3’ 3’ 3’ 3’ 3’

+RIBONUCLEASA

U2

P P P

B1 B2 A

P

5’ 5’ 5’

3’ 3’ 3’

+

Nucleótido con p-3’ Terminal

Purina

POH

B4 B5

5’ 5’

3’ 3’

P

PP P P

B1 B2 G T B5

P P

5’ 5’ 5’ 5’ 5’

3’ 3’ 3’ 3’ 3’

++ DNA asa I

P P OH

B1 B2 G

P

5’ 5’ 5’

3’ 3’ 3’

+

Nucleótido con 3’ OH

Purina

PP

T B5

5’ 5’

3’ 3’

P

Nucleótido con 5’ P

Pirimidica

Tratamientos Químicos sobre DNA

• No posee grupo hidroxilo en el C2

• Es sensible a la hidrólisis con ácido diluido (HCl o Acido Fórmico) a un pH ≤ 3. es decir los enlaces β-glicosídicos entre las bases púricas y la desoxirribosa se rompen sin alterar el esqueleto, ni la unión pirimídica desoxirribosa.

P P P

O O l l Pi l l Pi

……

H2o

H +P P P

Pu Pi Pu Pi

… …

Acido Apurínico

+ Unidades de Purina

Tratamientos Químicos sobre DNA

• Al ser tratado con hidrazina, las bases de naturaleza Pirimídica se separan y en su lugar que da una hidrazona. El ácido pirimídico es sensible a hidrólisis alcalina y ácida, obteniendo tras éste desoxioligonucleótidos con los extremos doblemente fosforilados.

P P P

Pu Pi Pu Pi

P P P

O OPu l l Pu l l

Hidrazina

Acido Pirimídico

Hidrólisis Enzimática de ADNHidrólisis Enzimática de ADNEnzima Tipo de

ataque Especificidad Enlaces hidrolizados Productos formados

DNasa I (pancreatica) Endo DNA n , d . pPu …. pPy Di y trinucleósidos 5’ - fosfato

DNasa II (bazo, de timo)

Endo DNA n , d Preferentemente Gp ….. Cp Oligonucleósidos – 3’ fosfato

Endonucleasa I de E. coli

Endo DNA n , d No especificidad por bases Oligonucleósido – 5’ fosfato

Endonucleasa IV Endo DNA d …pT…. P Cp… Oligonucleósidos – T

Exonucleasa I de E. Coli

Exo DNA d

XpYpY’p…. … Yn--- pZNucleósidos 5’ fosfato dinucleósido XpY

Exonucleasa II de E. Coli

Exo DNA n 5’ 3’ Nucleósidos 5’ fosfato

Exonucleasa III de E. Coli

Exo DNA n 3’ 5’ Nucleósidos 5’ fosfato

Exonucleasa de Lambda

Exo DNA n 5’ 3’ Nucleósidos 5’ fosfato

• Indique los productos que se obtendrán por la acción de la FVS, FDB, Ribonucleasa T1, Exonucleasa III y Desoxirribonucleasa pancreática sobres el siguiente desoxioligonucleótido:

• dTpdCpdApdGpdTpdA

Solución: dTpdCpdApdGpdTpdA + FVS dTpdCpdApdGpdTpdA

Entonces los fragmentos quedan: dT, pdC, pdA, pdG, pdT, pdA

Hidrólisis Enzimática de ADNHidrólisis Enzimática de ADN

Hidrólisis Enzimática de ADNHidrólisis Enzimática de ADNContinuación:

dTpdCpdApdGpdTpdA + FDV dTpdCpdApdGpdTpdA

Entonces los fragmentos quedan: 2dTp, dCp, dAp, dGp, dA

dTpdCpdApdGpdTpdA + T1 No Hidroliza

dTpdCpdApdGpdTpdA + EXO III No Hidroliza

dTpdCpdApdGpdTpdA + Desoxirribonucleasa Pancreática

dTpdCpdApdGpdTpdA entonces los fragmentos son:

dTpdCpdApdG, pdTpdA

Una alícuota de un Oligorribonucleótido que contiene 2A, 2G, 2C, U se sometió a los siguientes análisis:2.Tratamiento con FVS y originó C libre3.Tratado con FDB originó A libre4. al ser sometido a la Ribonucleasa Pancreática rindió un tetranucleótido formado por 2A, U, G y un trinucleótido formado por 2C y G.

•El tetranucleótido fue tratado por separado con:T2 y rindió A + A, G + UT1 rindió A,G + A, U

•El trinucleótido por otro lado fue sometido a la acción de U2 y rindió G libre + 2C

Tratamiento Enzimatico (Elucidación)