Iv Encuentro De InvestigacióN CaracterizacióN Del Haplotipo En Trichechus Manatus

Grupo de Investigación en Grupo de Investigación en Inmunología y Biología Inmunología y Biología

MolecularMolecular

Universidad del Atlántico

2008

Carlos Alberto Beltrán SánchezMileydis María Vargas Rodríguez

Caracterización del haplotipo en la secuencia Caracterización del haplotipo en la secuencia de la región control (D-Loop) del ADN de la región control (D-Loop) del ADN

mitocondrial en el manatí mitocondrial en el manatí Trichechus manatusTrichechus manatus

Director: PhD (C) Lourdes Varela

Grupo de Investigación en Inmunología y Biología Molecular

CARACTERIZACIÓN DEL HAPLOTIPO EN LA SECUENCIA DE LA REGIÓN CONTROL (D-LOOP) DEL ADN MITOCONDRIAL EN EL MANATÍ TRICHECHUS MANATUS

Introducción

• El manatí ha sido explotado durante muchos años por diversas poblaciones humanas.

• Trichechus manatus, forma parte de la lista de especies amenazadas de la convención CITES y el libro rojo de la UICN.

• La conservación de los manatíes es necesaria debido a su importancia ecológica.

• Estudios moleculares anteriores sugieren que Colombia puede ser el lugar de origen del Manatí Caribeño (T. manatus)

• El estudio del ADNmt es importante para reconocer zonas variables dentro del genoma de las especies.

• La región control se ha empleado como punto de referencia para investigar estructura genética de poblaciones entre diferentes especies.


ADN mitocondrial• Material genético circular de doble cadena

• El estudio del ADN mitocondrial de una especie, permite detectar polimorfismos: distintos tipos de ADNmt que se presentan en una misma especie y que corresponden a distintos linajes (haplotipos).

• La región control del ADNmt se destaca por su elevada tasa de mutación, y por esto es utilizado como marcador molecular.


Trichechus manatus• Se distribuye en aguas costeras, ríos, estuarios y lagunas desde el

norte de Florida hasta el noreste de la costa de Brasil. (Mou & Chen, 1990).

• En Colombia se encuentra en el bajo Magdalena, Atrato, Sinú y algunos ríos de la Orinoquía colombiana.



Ficha Taxonómica Ficha taxonómica

Reino Animalia Subreino Metazooaria Filo Chordata Subfilo Vertebrata Superclase Tetrapoda Clase Mammalia Subclase Theria Infraclase Eutheria Orden Sirenia Familia Trichechidae Género Trichechus Especie Trichechus manatus Subespecie Trichechus manatus manatus


Objetivo General

Caracterizar el haplotipo en la secuencia de la región control (D-Loop) del ADN mitocondrial en el manatí Trichechus manatus.

Objetivos Específicos


• Determinar el método mas confiable de obtención de ADN de alta calidad y en suficiente cantidad a partir de muestras de piel, sangre y hueso de manatí T. manatus, mediante la comparación de tres métodos de extracción.

• Identificar el haplotipo de las muestras analizadas mediante la secuenciación del producto amplificado con la técnica de PCR.

• Relacionar el haplotipo del individuo estudiado con otros haplotipos obtenidos para esta especie en investigaciones anteriores.

DISEÑO METODOLÓGICO

Colecta de las muestras Fase de laboratorio Procesamiento de los datos

Extracción de ADN

Amplificación de marcadores moleculares

Secuenciación de los productos

Descripción del producto

Base de datos GenBank

Software Mega 4, BioEdit, Clustal W

Se tomó una porción de hueso manatí proveniente del

caño aguas negras

Se tomó la muestra de cuatro individuos

1ml de sangre, manatí del Caño aguas negras y

Ciénaga grande de Santa Marta

Una biopsia de tejido manatí de San Bernado del Viento

Córdoba


Resultados• Las modificaciones a este protocolo consistieron en:

- Tiempo adecuado de incubación: 1h- Temperatura de incubación: 70 – 80º- Cantidad de la muestra empleada: 1cm cuadrado- Tiempo de agitación con vórtex: 10seg cada 15min

• Comparación de los métodos


Fuente de ADN

Método Protocolo Resultado

Sangre 1 Chelex 5% (mancha s de sangre en papel filtro) +

Piel 1 Chelex 5% (Tejido cutáneo), Chelex 20% - Proteinasa K Solución Lisis - Chelex 5%

-

2 Tritón - Fenol:Cloroformo - CTAB - 3 Kit de extracción de ADN +

Hue so 2 Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) con precipitación con acetato de amonio.

+

• Gel de agarosa 1.5% teñido con bromuro de etidio, muestras amplificadas con los iniciadores H16894 y L15925. 1. Chelex 5% en manchas de sangre, 2. Chelex 5% en tejido cutáneo, 3.Solución Lisis-Chelex 5%, 4. Chelex 20%-Proteinasa K, 5.Método 2: Tritón- Fenol: cloroformo-CTAB. 6. Reamplificación método 2, 7. Marcador de Peso Molecular 1Kb.


Métodos 1 y 2 para muestras de sangre y piel

500 pb650 pb550 pb

Aprox.

1 2 3 4 5 6 7 8


• Gel de agarosa 1.5% teñido con bromuro de etidio, muestras amplificadas con los iniciadores H16894 y L15925 1. Marcador de Peso Molecular 100pb, 2. y 3. Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) 4. y 5. Reamplificación 6. y 7. Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1) – Acetato de amonio 8. Control positivo

Método 2 para muestras de hueso

550 pb aprox.

500pb

600pb

1 2 3 4 5 6 7 8


Métodos 1 y 3 en muestras de sangre y piel

• Gel de agarosa 1.5% teñido con bromuro de etidio, comparando de los métodos de extracción positivos 1 y 3 muestras amplificadas con los iniciadores H16894 y L15925 1. Marcador de Peso Molecular 100pb, 2. y 3. Método 1: Chelex 5%, manatí Zoológico de Barranquilla 4. y 5. Método 3: Kit de extracción, manatí San Bernardo del Viento, 6. y 7. Método 1: Chelex 5% manatí Ciénaga Grande de Santa Marta

550 pb aprox.500 pb

600 pb

1 2 3 4 5 6 7 8

Cuantificación del ADN genómico

• Se obtuvo un ADN de 89% de pureza y 103.7µg/ml de concentración con el uso del Kit Wizard de Promega


Muestra Tipo de muestra

Método de extracción

Abs 260

Abs 280 Abs260/280 µgADN/

ml Caño Aguas Negras, Rio Magdalena

Sangre Chelex 5% 0.054 0.054 1.000 17.49

San Bernardo del viento

Piel Kit Promega 0.071 0.050 1.78 103.7

Ciénaga Grande de

Santa Marta Sangre Chelex 5% 0.063 0.049 1.56 77.66

Secuenciación del producto de la amplificación de la región control del ADN mitocondrial de la muestra del individuo

proveniente de San Bernardo del Viento - Córdoba

• Se obtuvo un cromatograma con el que se estableció la secuencia nucleotídica de 550pb aproximadamente, la secuencia se denominó Tma1.


Segmento del cromatograma obtenido a partir de la secuenciación de la Región Control del ADN mitocondrial en T. manatus

Determinación del haplotipo del ejemplar de San Bernardo del viento - Córdoba

• Del alineamiento en el programa BLAST, se determinó la secuencia consenso para la muestra analizada correspondiente a 410pb.

• La secuencia obtenida presentó un porcentaje de máxima identidad nucleotídica 98% con el haplotipo C01


Número de acceso

DescripciónMax-score

Total score

E value

Max ident

AY963846.1Trichechus manatus haplotype C01 control region, partial sequence; mitochondrial

736 736 0.0 98%

AY963840.1Trichechus manatus haplotype A01 control region, partial sequence; mitochondrial

725 725 0.0 98%

AY963847.1Trichechus manatus haplotype D01 control region, partial sequence; mitochondrial

719 719 0.0 97%

AY963845.1Trichechus manatus haplotype B01 control region, partial sequence; mitochondrial

719 719 0.0 97%


719 719 0.0 97%


719 719 0.0 97%


719 719 0.0 97%


719 719 0.0 97%

AY963893.1Trichechus inunguis haplotype X01 control region, partial sequence; mitochondrial

634 6349e-179

94%

AY963895.1Trichechus senegalensis haplotype Y02 control region, partial sequence; mitochondrial

606 6062e-170

92%

AY963899.1Dugong dugon haplotype Dd control region, partial sequence; mitochondrial

326 326 6e-86 81%

• Para determinar los sitios de identidad nucleotídica con los haplotipos reportados en GenBank se obtuvo un alineamiento múltiple permitiendo destacar los sitios conservados y polimórficos

• El alineamiento se presenta en base al haplotipo C01


• Los sitios conservados se representan por puntos y los sitios variantes o polimórficos están determinados por los cambios de base en diferentes puntos de la secuencia.


• Los sitios variantes van desde 2 bases para el haplotipo A01 hasta 28 bases en los haplotipos G02 y H01.


• Se presentan sitios de confusión representados por la letra N correspondiente a las bases 229, 347, 352, 358 y 362, sin embargo corresponden a sitios conservados o comunes en todos los haplotipos reportados para la especie


• Para Colombia se han reportado 8 haplotipos para la especie y la secuencia de este estudio, sigue presentando alta similaridad con el haplotipo C01.


• Se descarta el haplotipo A05 que presenta porcentaje similar de 97% ya que en el sitio 192 presenta la base guanina.

Composición y frecuencia nucleotídica


T(U) C A G Total HaplotypeA01 31.0 28.5 26.6 13.9 410 HaplotypeA02 30.7 28.8 26.6 13.9 410 HaplotypeA03 31.0 28.5 26.3 14.1 410 HaplotypeA04 31.2 28.3 26.6 13.9 410 HaplotypeA05 30.7 28.8 26.6 13.9 410 HaplotypeB01 31.2 28.3 26.6 13.9 410 HaplotypeC01 30.7 28.8 26.8 13.7 410 HaplotypeD01 30.7 28.8 27.1 13.4 410 HaplotypeE01 31.0 28.5 28.3 12.2 410 HaplotypeG01 31.0 28.5 28.0 12.4 410 HaplotypeG02 31.0 28.5 27.8 12.7 410 HaplotypeH01 30.7 28.8 28.0 12.4 410 HaplotypeI02 31.2 28.5 28.0 12.2 410 HaplotypeJ01 31.0 28.8 28.0 12.2 410 HaplotypeK01 31.2 28.8 27.6 12.4 410 HaplotypeL02 31.5 28.3 27.3 12.9 410 HaplotypeM01 31.5 28.3 27.1 13.2 410 HaplotypeM02 31.7 28.0 27.1 13.2 410 HaplotypeM03 31.2 28.5 27.1 13.2 410 HaplotypeN01 31.2 28.3 27.1 13.4 410 HaplotypeO01 31.5 28.3 26.8 13.4 410

Tma1 30.7 28.7 26.7 13.9 404 Promedio 31.1 28.5 27.2 13.2 409.7

Discusión


• Se obtuvo el análisis genético completo para el manatí proveniente de San Bernardo del Viento – Córdoba. Sugiriendo la presencia del haplotipo C01 en Colombia como lo plantea Vianna et.al (2006) quien clasifica a los individuos de esta especie en tres clusters ubicando al C01 dentro del Cluster I.

• En Colombia la variedad haplotípica es alta confirmado por la presencia de 8 haplotipos (Vianna et. al 2006) principalmente por las características hidrográficas del país.

• Existe similaridad alta con el haplotipo A01 que no esta reportado para Colombia.

• La especie T. manatus presenta porcentaje de similaridad de 94% con T. inunguis, dato que concuerda con los resultados de estudios evolutivos como el de Vianna et.al (2006) donde destaca esta especie como el pariente mas cercano del manatí caribeño.

• En filogeografía el estudio de la región control del ADN mitocondrial constituye la vía mas acertada para determinar el origen de la especie T. manatus soportado por investigaciones anterirores como la de Vianna et.al (2006), la cual sugiere a Colombia como el probable lugar de origen del manati antillano debido a la alta variabilidad genética encontrada en el país.


Conclusiones• La secuenciación de la región control del ADN mitocondrial,

permitió identificar el haplotipo del individuo de San Bernardo del Viento Córdoba.

• Se obtuvo una secuencia cercanamente relacionada con el haplotipo C01 con un porcentaje de filiación de 98%.

• Para las manchas de sangre vertidas en papel filtro el método 1 fue el mas confiable para la obtención de ADN; para las muestras escasas de tejido cutáneo el Kit Wizard mostró los mejores resultados y en la obtención de ADN de hueso el fenol: cloroformo: alcohol isoamílico con acetato de amonio fue el método que mostró resultados positivos.


Recomendaciones

• Utilizar un método de extracción de ADN con el cual se logre aislar directamente ADN mitocondrial

• Para las extracciones de ADN de material antiguo se empleen protocolos que garanticen el total aprovechamiento de toda la fuente de extracción.

• Emplear un protocolo de purificación del ADN inmediatamente después de amplificado.

• Secuenciar en ambos sentidos para asegurar la ocurrencia de las bases en el ADN estudiado.

• Completar este estudio con las muestras que no se pudieron secuenciar y unificar la información que se obtenga del análisis a otros individuos de la especie Trichechus manatus.


Agradecimientos • A la Fundación Zoológico de Barranquilla, la Fundación Omacha y al Museo

de Colecciones Biológicas de la Universidad del Atlántico por la ayuda en la consecución de las muestras.

• Al grupo de Investigación de Inmunología y Biología Molecular de la Universidad del Atlántico por el apoyo y financiamiento de este proyecto.

• A nuestra directora Lourdes Varela Prieto por formarnos en el camino de la investigación.

• A los profesores Carmiña Vargas y Alfredo Lagares de la Universidad del Atlántico, por sus asesorías que fortalecieron esta investigación.

• A nuestros pares evaluadores Dary Luz Mendoza y Roger del Valle por sus valiosos aportes y conocimientos.

• A los integrantes del grupo de investigación Samir, Gina, Juan, Isis, Jose, Aimara y demás integrantes por colaborarnos en la ejecucion de este trabajo.



Método 1: Extracción con Quelex


MANCHAS DE SANGRE

En un eppendorf se agregó un trozo de papel filtro con agua, 200 ml resina chelex 5%, se incubó 70-80º y vórtex. Se centrifugó y se extrajo el sobrenadante. Walsh et.al (1991)

PIEL

• Se colocó un pedazo en sln Chelex 5%, se incubó 45min 100º, vórtex y se centrifugó 13000 rpm cada 15 min. Se extrajo el sobrenadante. Morín et. al. (1994)

• Se coloco un fragmento en sln Chelex 20% y Proteinasa K 20mg/ml, se incubó 12h 55º se centrifugó y se colectó el sobrenadante Goupurenco (2002)

• Se colocó un fragmento en una sln lisis celular (Chelex 5%, SDS 0.2%, Tris 10mM pH 8.0 EDTA 0.5mM pH 8.0 y Proteinasa K 20mg/ml) se incubó 12h 65º, vórtex y se colectó el sobrenadante

Método 2: Extracción con Solventes orgánicos


PIEL

Se maceró la muestra y se agregó Tritón 2%, se calentó a 94º, se centrifugó a 13000rpm se tomó el sobrenadante y se extajo con fenol: cloroformo 24:1, seguido de la adición de NaCl y CTAB, se agregó igual volumen de fenol: cloroformo 24:1, fue precipitado con isopropanol y lavado con etanol. Saad et.al (1995)

HUESO

El hueso se desinfectó con hipoclorito, se pulverizó con martillo estéril a 0.3gr de hueso se agregó Tris-HCl 10mM pH8.0, NaCl 100mM, SDS 2%, Proteinasa K 1mg/ml se incubó a 60º en agitación continua durante 72h. Se centrifugó y se extrajo el sobrenadante con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25:24:1. Se precipitó con Acetato de amonio 3M. Riego et.al. (1997)

Método 3: Extracción con Kit

PIEL Se utilizó Kit Wizard Genomic DNA siguiendo el protocolo de instrucción del fabricante

Cuantificación del ADN Genómico

• Espectofotometría UV


Dilución 1:50 de ADN en TE 1X

Cubetas de cuarzo

Spectronic BioMate3 (Thermo)

260nm 280nm

µg/ml de ADN = (Abs260 X Factor Dilución X 50 mg ADN/ml)

Reacción en cadena de la polimerasa• Amplificación del marcador molecular mediante PCR:

– Región Control L15926 (5’-TCA AAG CTT ACA CCA GTC TTG TAAACC - 3’) y H16498 (5’- CCT GAA CTA GGA ACC AGA TG -3’) Kocher, T. D. 1989

• Protocolo de Vianna et.al (2006) 35 ciclos de amplificación:



Mezcla para la PCR

Componentes Volumen x Reacción 25µL

Concentración final

Buffer PCR 10X 2.5µL 1X

MgCl2 50mM 0.8 µL 1.5mM

dNTPs 10mM 0.5 µL 200µM

Primer L 10 µM 1.5µL 0.5µM

Primer H 10 µM 1.5µL 0.5µM

Taq Polimerasa 5U/µL

0.25 µL 2.5 U

ADN (muestra) 10 µL 20µg/ml

Electroforesis • Geles de agarosa estándar 1.5% • 1µg/ml bromuro de etidio• Buffer TBE 0.5X• Condiciones del corrido: 70V durante 1h.


• Geles de agarosa bajo punto de fusión 3.0%

• 0.6µg/ml bromuro de etidio• Buffer TBE 0.5X• Condiciones del corrido:

45V durante 6h.

• Visualizados en el fotodocumentador Universal HoodII

Secuenciación


• Secuenciador MegaBace DNA analysis system (Amersham)

• kit DYEnamic ET Dye Terminador Kit (Amersham)

• PCR Clean-Up System (Promega)


Números de acceso a las secuencias de los haplotipos en la base de datos GenBank

Número HAPLOTIPO Numero de

acceso GenBank

1 Haplotipo A01 AY963840.1 2 Haplotipo A02 AY963841.1 3 Haplotipo A03 AY963842.1 4 Haplotipo A04 AY963843.1 5 Haplotipo A05 AY963844.1 6 Haplotipo B01 AY963845.1 7 Haplotipo C01 AY963846.1 8 Haplotipo D01 AY963847.1 9 Haplotipo E01 AY963848.1 10 Haplotipo G01 AY963849.1 11 Haplotipo G02 AY963850.1 12 Haplotipo H01 AY963851.1 13 Haplotipo I02 AY963852.1 14 Haplotipo J01 AY963853.1 15 Haplotipo K01 AY963854.1 16 Haplotipo L02 AY963855.1 17 Haplotipo M01 AY963856.1 18 Haplotipo M02 AY963857.1 19 Haplotipo M03 AY963858.1 20 Haplotipo N01 AY963859.1 21 Haplotipo O01 AY963860.1

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