第二章 基因工程及其在食品科学中的应用

第二章 基因工程及其在食品科学中的应用第二章 基因工程及其在食品科学中的应用

基因工程基础基因工程基础

基因工程研究方法基因工程研究方法

基因工程在食品科学中的应用基因工程在食品科学中的应用

第一节 基因工程基础第一节 基因工程基础

一、基因工程的定义、意义及研究内容一、基因工程的定义、意义及研究内容 （一）基因工程的定义（一）基因工程的定义 gene engineeringgene engineering genetic engineeringgenetic engineering

recombinant DNA techniquerecombinant DNA technique Molecular cloningMolecular cloning

（二）基因工程的意义（二）基因工程的意义 基因工程基因工程是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特点是可打破生物点是可打破生物种属界限种属界限，进行生物种，进行生物种 (( 属、科、目、纲、门、界属、科、目、纲、门、界 ))内外基因的重组、遗传信息的转移。内外基因的重组、遗传信息的转移。

遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症症、骨质疏松症

（三）基因工程的研究内容（三）基因工程的研究内容

制备目的基因 构建重组 DNA 获得转化体

筛选出重组转化体阳性克隆 筛目的基因在受体生物细胞中高效表达隆

二、基因工程的工具酶二、基因工程的工具酶 基因工程的关键技术之一就是先将基因工程的关键技术之一就是先将目的基因目的基因 DNADNA 从供体生从供体生物体中物体中分离分离出来，再与合适出来，再与合适载体载体 DNADNA 连接连接重组重组等，这些分子操等，这些分子操作涉及多种不同的作涉及多种不同的酶酶。主要包括：。主要包括：

限制性内切核酸酶 限制性内切核酸酶 DNADNA 甲基化酶、甲基化酶、

DNADNA 聚合酶 依赖于聚合酶 依赖于 DNADNA 的的 RNARNA 聚合酶 聚合酶

连接酶 激酶 磷酸酶 核酸酶 连接酶 激酶 磷酸酶 核酸酶

（一）限制性内切核酸酶与（一）限制性内切核酸酶与 DNADNA 甲基化酶甲基化酶

11 、定义、定义

restriction endonucleaserestriction endonuclease ：：指一类能够识别和切割双链 DNA

分子内核苷酸序列的内切核酸酶

DNA methylase DNA methylase ：：是指一类能够识别 DNA 特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶

22 、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类

(1) (1) 限制酶限制酶 (( 甲基化酶甲基化酶 )) 的命名的命名 其命名主要是参照 H ． O ． Smith 和 D. Nathans 提出的待命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原则进行的，具体如下：

① 以属名的第一个字母 ( 大写 ) 和种名的最前两个字母 ( 小写 ) 组

成的三字母符号为其基本形式 如：来源于大肠杆菌 (Escherichia coli) 的酶用 Eco 表示；来

源于流感嗜血菌 (Haemophilus influenzae) 的用 Hin 表示

② 当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全相同时，则来自后一种微生物的酶的符号改用其种名词头前缀后第一个字母( 小写 ) 代替上述三字母符号中的最后一个字母

如：来自 Haemophilus parainfluenzae ( 副流感嗜血杆菌 )的用 Hpa 表示，．而来自同一属的 Haemophilus parahaemolyticus ( 副溶血嗜血杆菌 ) 的则用 Hph 表示。

③ ③ 当微生物具有当微生物具有特殊名称特殊名称时，则将代表该特殊名称的时，则将代表该特殊名称的符号符号置于上置于上述三字母符号之后述三字母符号之后

如：如：来自来自 Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae 的的 RdRd 株的用株的用 HindHind 表示；表示；来自来自 Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae 的的 RfRf 型的用型的用 HinfHinf 表示。表示。

④ ④ 当不止当不止一种限制酶一种限制酶 (( 甲基化酶甲基化酶 )) 分离纯化自分离纯化自同一微生物株系同一微生物株系时，时，则依其被分离的先后顺序则依其被分离的先后顺序以罗马数字以罗马数字 (( 大写大写 )) 置于上述命名符置于上述命名符号之后号之后

如：如：来自来自 Haemophilus aegytiusHaemophilus aegytius 的三种酶分别用的三种酶分别用 Hae IHae I 、、HaeⅡHaeⅡ 和和 HaeⅢHaeⅢ 表示；来自表示；来自 Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae 的的 RdRd株的三种酶分别用株的三种酶分别用 Hind IHind I 、、 HindⅡHindⅡ 和和 HindⅢHindⅢ 表示。表示。

⑤ ⑤ 为了区别起见，在上述命名名称之前为了区别起见，在上述命名名称之前加加 RR ．表示．表示限制酶类限制酶类；在；在上述命名名称之前加上述命名名称之前加 MM ．表示．表示甲甲基化酶类基化酶类

如：如：来自来自 Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae 的的 RdRd 株的第三种限制株的第三种限制性内切核酸酶为性内切核酸酶为 R. HindⅢR. HindⅢ ，其相应的，其相应的 DNADNA 甲基化酶则为甲基化酶则为 M. M. HindⅢHindⅢ 。。

大鼠生长激素基因转入小鼠

(2) 限制酶的分类 根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型 :

I 型 : 三种不同亚基组成；辅助因子为 ATP 、 Mg2+ 及 S- 腺苷甲硫氨酸 其切割位点距其识别位点至少 1000bp ；且切割作用是随机的

Ⅱ 型 : 两个相同亚基组成；辅助因子仅为 Mg2+ ；其识别位点常具旋转 对称性；其切割位点与其识别位点重叠或在其附近；且切割作 用特异性强

Ⅲ 型 : 两种不同亚基组成；辅助因子为 ATP 和 Mg2+ ，也受 S- 腺苷甲硫 氨酸激活，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点 3’ 端 24 ～ 26bp 处

PstI 5’-C TGCA ↓ G-3’

3’-G ↑ ACGT C-5’

HpaI 5’-GTT ↓ AAC-3’

3’-CAA ↑ TTG-5’

限制性内切酶的旋转对称性

需要指出的是， I 型和Ⅲ型限制性内切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性；而对Ⅱ型限制性内切核酸酶而言，其只具限制酶活性，与其相应的 DNA 甲基化酶才具甲基化酶活性。Ⅱ型限制性内切核酸酶及其相应的 DNA 甲基化酶对 DNA 有相同的识别序列。

(3)Ⅱ 型限制性内切核酸酶的基本特性

① 识别序列与切割位点

Ⅱ 型限制性内切核酸酶可识别长度为 4 ～ 7bp 的双链 DNA 特定序列，该识别序列 ( 识别位点 ) 常呈旋转对称性

② 切割方式

平齐末端 、 5’— 磷酸端 2 ～ 5 个核苷酸突出单链黏性末端 、 3’-羟基端 2 ～ 5 个核苷酸突出单链黏性末端

5´ 3´

3´ 5´

●● ● ●

●

● ●●●

●●

●●

5´ 3´

3´ 5´

5´ 突出——

3´ 突出——

平端——5´ 3´

3´ 5´

Ⅱ 型限制性内切核酸酶切割方式

③ 同裂酶与同尾酶

isoschizomer ：在Ⅱ型限制性内切核酸酶中，来源不同而识别序列和切割方式均相同者

如： HpaⅡ 和 Msp I 两者的识别序列都是 CCGG ，切割方式也相同，因此二者为同裂酶

isocaudamer ：来源及识别序列不同，但 DNA 经其切割后能形成相同黏性末端者

如： BamH I 、 Bcl I 、 BglⅡ 、 Mbo I 、 Sau3A I 及 XhoⅡ 切割 DNA 后都形成相同的 GATC 四核苷酸突出单链黏性末端，因此其为一组同尾酶 需要指出的是，由同尾酶切割 DNA 所得到的黏性末端可以彼此连接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。

④ ④ 限制性片段长度与切割频率限制性片段长度与切割频率

经限制性内切核酸酶切割后产生的 DNA 片段称为称为限制性片段限制性片段 (r(restriction fragment)estriction fragment) 。。一般不同限制酶切割 DNA 后所形成的

限制性片段长度不一 假设在某 DNA 分子中， A 或 T 出现的频率为 X ， G

或 C 出现的频率为 Y ，那么某限制酶在该 DNA 分子上的切割位点出现频率 ( 切割频率或位点频率 ) F 可用下式表示：

F=XnYm

式中： n—— 该限制酶识别序列中双链 A=T 碱基对的数目； m—— 该限制酶识别序列中双链 G=C 碱基对的数目

如果构成某 DNA 分子的碱基对总数目 (B) 及某限制酶识别位点核苷酸序列均为已知，那么该限制酶在该 DNA 分子上的理论切割位点数目 (N) 为：

N=BF

假定在某 DNA 分子中四种核苷酸残基数量相等，那么识别序列为四个碱基对的限制酶在该 DNA 分子中切割位点出现频率为 (1 ／ 4)4 ，即 1 ／ 256 ，也即平均 256 个碱基对出现 1 个

切割位点。

同样，识别序列为六个碱基对的限制酶在该 DNA 分子中切割位点出现频率为 (1 ／ 4)6 ，即 1 ／ 4096 ，也即平均 4096个碱基对出现 1 个切割位点。

需要指出的是：实际情况与理论不相符

(4) 影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略

① 底物 DNA 制备物的纯度：蛋白质、 SDS 、 EDTA 、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。

② 底物 DNA 的甲基化程度：大肠杆菌的绝大多数菌株含有两种DNA 甲基化酶： a 、 dam 甲基化酶； b 、 dcm 甲基化酶。

③ 底物 DNA 的结构构型：环状双螺旋 DNA 较线性 DNA 稳定。因此，在用限制性酶酶解同样分子量的 DNA 时，环状双螺旋 DNA所需酶量为线性 DNA 的 10~20倍。

④ 酶反应缓冲液的组成：

⑤ 酶反应的最适温度：

为了提高限制酶对底物 DNA低纯度制备物的反应效率，一般采用如下方法：

a 增加限制酶的用量 ( 平均每 µg底物 DNA 可用 10IU甚至更多些 ) ；

b 延长酶催化反应的保温时间，使酶解更完全；

c 扩大酶催化反应的体积，使潜在的抑制因素被稀释，以减弱其抑制作用；

d 在反应液中加入适量亚精胺 ( 一般应用浓度为 1～ 2.5mmol ／ L) ，以利限制酶对基因组 DNA 的酶解作用。

(5) 限制性内切核酸酶酶解反应的操作步骤及注意要点 ( 二 ) DNA 聚合酶

最常用的依赖于 DNA 的 DNA 聚合酶有大肠杆菌 DNA 聚合酶 I(全酶 ) 、大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段 ) 、T4噬菌体编码的 DNA 聚合酶、耐热的 DNA 聚合酶 (TaqDNA聚合酶 ) 等

依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，即逆转录酶，优先以 RNA 为模板，也可以 DNA 为模板，因此该聚合酶能以 RNA 为模板催化合成双链 DNA

11 、大肠杆菌、大肠杆菌 DNADNA 聚合酶聚合酶 I(I(全酶全酶 ))

来源：来源：大肠杆菌； 大肠杆菌； 分子量：分子量： 109×10109×1033 的多肽链的多肽链

（（ 11 ）作用）作用

① ① 具有具有 5’→3’DNA5’→3’DNA 聚合酶活性，以单链聚合酶活性，以单链 DNADNA 为模板，以带为模板，以带 3’3’ 自自由羟基的由羟基的 DNADNA 片段为引物；片段为引物；

② ② 5’→3’5’→3’ 外切核酸酶活性，从外切核酸酶活性，从 5’5’ 端既降解双链端既降解双链 DNADNA ，也降解，也降解 RNRNA-DNAA-DNA杂交体中的杂交体中的 RNARNA 链链 (RNA(RNA 酶酶 HH 活性活性 )) ；；

③ ③ 3’→5’3’→5’ 外切核酸酶活性，底物为带外切核酸酶活性，底物为带 3’3’ 自由羟基的双链自由羟基的双链 DNADNA 或单或单链链 DNADNA 。。

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 以切刻平移法以切刻平移法 (nick translation)(nick translation) 标记标记 DNADNA 。在所有聚合酶中，只。在所有聚合酶中，只有该酶能用于此反应，因为只有其具有有该酶能用于此反应，因为只有其具有 5’→3’5’→3’ 外切核酸酶活性。外切核酸酶活性。

② ② 对对 DNADNA 分子的分子的 3’3’ 突出尾进行末端标记。突出尾进行末端标记。

DNA 聚合酶Ⅰ

22 、大肠杆菌、大肠杆菌 DNADNA 聚合酶聚合酶 II 大片段大片段 (Klenow(Klenow 片段片段 ))

来源：来源：由大肠杆菌由大肠杆菌 DNADNA聚合酶聚合酶 II 全酶经枯草杆菌蛋白酶酶解获得，也可全酶经枯草杆菌蛋白酶酶解获得，也可通过克隆技术获得。通过克隆技术获得。

分子量：分子量： 76×10376×103 的多肽链的多肽链

（（ 11 ）作用）作用

① ① 5’→3’DNA5’→3’DNA 聚合酶活性，以单链聚合酶活性，以单链 DNADNA 为模板，以带为模板，以带 3’3’ 自由羟基的自由羟基的DNADNA 片段为引物；片段为引物；

② ② 3’→5’3’→5’ 外切核酸酶活性，底物为带外切核酸酶活性，底物为带 3’3’ 自由羟基的双链自由羟基的双链 DNADNA 或单链或单链 DDNANA 。。

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 补平限制酶切割双链补平限制酶切割双链 DNADNA 所产生的所产生的 3’3’凹端；凹端；

② ② 如果以标记的如果以标记的 dNTPdNTP 补平双链补平双链 DNADNA 的的 3’3’凹端，那么可对凹端，那么可对 DNADNA 分子进分子进行末端标记； ③ 对行末端标记； ③ 对 DNADNA 分子的分子的 3’3’ 突出尾进行末端标记；突出尾进行末端标记；

④ ④ 在在 cDNAcDNA 克隆中，合成克隆中，合成 cDNAcDNA 第二链；第二链；

⑤ ⑤ 应用应用 SangerSanger 双脱氧链末端终止法进行双脱氧链末端终止法进行 DNADNA测序。 测序。

Klenow 酶的作用方式

33 、、 T4T4噬菌体噬菌体 DNADNA 聚合酶聚合酶

来源：来源： T4T4噬菌体感染的大肠杆菌 噬菌体感染的大肠杆菌 分子量：分子量： 114×10114×1033

（（ 11 ）作用）作用

① ① 5’→3’DNA5’→3’DNA 聚合酶活性，以单链聚合酶活性，以单链 DNADNA 为模板，以带为模板，以带 3’3’ 自由羟基的自由羟基的 DDNANA 片段为引物；片段为引物；

② ② 3’→5’3’→5’ 外切核酸酶活性，底物为带外切核酸酶活性，底物为带 3’3’ 自由羟基的双链自由羟基的双链 DNADNA 或单链或单链 DDNANA ；；

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 补平限制酶切割双链补平限制酶切割双链 DNADNA 产生的产生的 3’3’凹端；凹端；

② ② 如果以标记的如果以标记的 dNTPdNTP 补平双链补平双链 DNADNA 的的 3’3’凹端，那么可对凹端，那么可对 DNADNA 分子进分子进行末端标记；行末端标记；

③ ③ 对对 DNADNA 分子的分子的 3’3’ 突出尾进行末端标记，并且该酶为利用此法进行此类突出尾进行末端标记，并且该酶为利用此法进行此类末端标记的首选酶；末端标记的首选酶；

④ ④ 将双链将双链 DNADNA 的突出端转化成平齐端。在制备与合成接头连接的双链的突出端转化成平齐端。在制备与合成接头连接的双链 DNDNAA 时，经常利用这一特性。时，经常利用这一特性。

44 、、 TaqDNATaqDNA 聚合酶聚合酶

来源：来源：水生栖热菌水生栖热菌 ((Thermus aquaticusThermus aquaticus)) ，现可由基因工程途径来生，现可由基因工程途径来生产产

分子量：分子量： 65×10365×103 ，是一种非常耐热的依赖于，是一种非常耐热的依赖于 DNADNA 的的 DNADNA聚合酶。聚合酶。

（（ 11 ）作用）作用

具有具有 5’→3’DNA5’→3’DNA 聚合酶活性，以单链聚合酶活性，以单链 DNADNA 为模板，以带为模板，以带 3’3’自由羟基的自由羟基的 DNADNA 片段为引物。片段为引物。

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 对对 DNADNA进行测序；进行测序；

② ② 通过聚合酶链式反应通过聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction(polymerase chain reaction ，， PCR)PCR) 对对 DNADNA分子的特定序列进行体外扩增。分子的特定序列进行体外扩增。

55 、逆转录酶、逆转录酶 (( 依赖于依赖于 RNARNA 的的 DNADNA 聚合酶聚合酶 ) )

来源：来源：一种来自一种来自禽成髓细胞瘤病毒禽成髓细胞瘤病毒 (AMV)(AMV) ，分子量为，分子量为 170×10170×1033 ；；

一种来自能一种来自能表达克隆化的表达克隆化的 MoloneyMoloney 鼠白血病病毒鼠白血病病毒 (Mo-MLV)(Mo-MLV)逆 转录酶基因的大肠杆菌逆 转录酶基因的大肠杆菌，分子量为，分子量为 84×10384×103 。。

（（ 11 ）作用）作用

（（ 22 ）主要用途）主要用途

66 、末端脱氧核苷酸转移酶、末端脱氧核苷酸转移酶 (( 末端转移酶末端转移酶 ) )

来源：来源：小牛胸腺 小牛胸腺 分子量：分子量： 60×10360×103

（（ 11 ）作用）作用

（（ 22 ）主要用途）主要用途

(( 三三 ) ) 依赖于依赖于 DNADNA 的的 RNARNA 聚合酶聚合酶

11 、、 SP6SP6噬菌体噬菌体 RNARNA 聚合酶聚合酶

来源：来源： SP6SP6 噬菌体感染的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体感染的鼠伤寒沙门氏菌 LT2LT2 株。株。

（（ 11 ）作用）作用

该酶主要具有一种活性，即该酶主要具有一种活性，即 5’→3’ RNA5’→3’ RNA 聚合酶活性聚合酶活性，识，识别双链别双链 DNADNA 模板上相应的噬菌体特异性启动子，并且以此双模板上相应的噬菌体特异性启动子，并且以此双链链 DNADNA 为模板合成为模板合成 RNARNA 。。

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 合成单链合成单链 RNARNA ，制备杂交探针；，制备杂交探针；

② ② 合成单链合成单链 RNARNA 作为体外翻译系统中的功能性作为体外翻译系统中的功能性 mRNAmRNA 或体外剪或体外剪接反应的底物。接反应的底物。

22 、、 T7T7 或或 T3T3 噬菌体噬菌体 RNARNA 聚合酶聚合酶

来源：来源： T7T7 或或 T3T3噬菌体感染的大肠杆菌。噬菌体感染的大肠杆菌。

（（ 11 ）作用）作用

该类酶主要具有一种活性，即该类酶主要具有一种活性，即 5’→3’ RNA5’→3’ RNA 聚合酶活性，识别双链聚合酶活性，识别双链 DNDNAA模板上相应的噬菌体特异性的启动子，并以此双链模板上相应的噬菌体特异性的启动子，并以此双链 DNADNA 为模板合成为模板合成RNARNA 。。

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 合成单链合成单链 RNARNA ，制备杂交探针；，制备杂交探针；

② ② 合成单链合成单链 RNARNA 作为体外翻译系统中的功能性作为体外翻译系统中的功能性 mRNAmRNA 或体外剪接反应或体外剪接反应的底物；的底物；

③ ③ 利用带有利用带有 T7T7噬菌体启动子的载体在大肠杆菌和酵母中表达克隆化基因。噬菌体启动子的载体在大肠杆菌和酵母中表达克隆化基因。

((四四 ) ) 连接酶、激酶及磷酸酶连接酶、激酶及磷酸酶

DNADNA 连接酶连接酶 (DNA ligase)(DNA ligase) ：是指将两段：是指将两段 DNADNA 拼接起来的酶拼接起来的酶类。在基因工程中，最常见的类。在基因工程中，最常见的 DNADNA 连接酶为连接酶为 T4T4 噬菌体噬菌体 DNADNA

连接酶。连接酶。

RNARNA 连接酶连接酶 (RNAligase)(RNAligase) ：能使含：能使含 5’5’磷酸基端及磷酸基端及 3’3’羟基端羟基端的单链的单链 RNA(RNA( 或或 DNA)DNA)共价连接起来。该酶主要用于对共价连接起来。该酶主要用于对 RNARNA

进行进行 3’ 3’ 末端标记，即将末端标记，即将 3232PP标记的标记的 3’3’ ，， 5’—5’— 二磷酸单核二磷酸单核苷苷 (pNp)(pNp) 加到加到 RNARNA 的的 3’3’羟基端。羟基端。

11 、、 T4T4噬菌体噬菌体 DNADNA 连接酶连接酶

来源：来源： T4T4 噬菌体感染的大肠杆菌 噬菌体感染的大肠杆菌 分子量：分子量： 68×1068×1033

（（ 11 ）作用）作用

该酶主要具有一种活性，即催化该酶主要具有一种活性，即催化 DNADNA 的的 5’5’磷酸基与磷酸基与 3’3’羟基之间形成磷酸二酯键。该酶的核酸底物为黏性末端羟基之间形成磷酸二酯键。该酶的核酸底物为黏性末端 DNADNA 、、平齐末端平齐末端 DNADNA 、带切刻的、带切刻的 DNADNA 等。等。

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 连接带匹配黏性末端的连接带匹配黏性末端的 DNADNA 分子。分子。

② ② 使平齐末端的双链使平齐末端的双链 DNADNA 分子互相连接或与合成接头相连接。分子互相连接或与合成接头相连接。这类反应要比黏性末端连接慢得多。 这类反应要比黏性末端连接慢得多。

22 、、 T4T4 噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶

来源：来源： T4T4噬菌体感染的大肠杆菌噬菌体感染的大肠杆菌

（（ 11 ）作用）作用

① ① 具有激酶磷酸化活性，催化具有激酶磷酸化活性，催化 ATPATP 的广磷酸基转移至的广磷酸基转移至 DNADNA 或或 RNARNA 的的5’5’ 末端；末端；

② ② 具有具有 3’3’ 磷酸酶活性，该酶的核酸底物为双链磷酸酶活性，该酶的核酸底物为双链 DNADNA 、单链、单链 RNARNA 或或DNADNA 、、 DNADNA 切刻或缺口、寡核苷酸等。切刻或缺口、寡核苷酸等。

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 标记标记 DNADNA 的的 5’5’ 端，以供端，以供 Maxam-GilbertMaxam-Gilbert 法测序、法测序、 S1S1 核酸酶分析核酸酶分析以及其他必须使用末端标记以及其他必须使用末端标记 DNADNA操作之需；操作之需；

② ② 对准备用于连接但缺乏对准备用于连接但缺乏 5’5’ 磷酸的磷酸的 DNADNA 或合成接头进行磷酸化。 或合成接头进行磷酸化。

33 、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶

来源：来源：大肠杆菌及牛小肠大肠杆菌及牛小肠

（（ 11 ）作用）作用

这两种来源的碱性磷酸酶，即这两种来源的碱性磷酸酶，即细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶 (bacteri alalk(bacteri alalkaline phosphatasealine phosphatase ，， BAP)BAP) 和和牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶 (calf intestin(calf intestinal alkaline phosphataseal alkaline phosphatase ，， CIP)CIP) 均具磷酸酶活性，催化去除均具磷酸酶活性，催化去除5’5’磷酸的反应。该酶的底物为单链或双链磷酸的反应。该酶的底物为单链或双链 DNADNA 及及 RNARNA 、、 rNrNTPTP 和和 dNTPdNTP 。。

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 在用在用 32P 32P 标记标记 5’5’ 末端前，去除末端前，去除 DNADNA 或或 RNARNA 分子的分子的 5’5’磷酸；磷酸；

② ② 去除去除 DNADNA 片段片段 5’5’磷酸，以防自身环化。磷酸，以防自身环化。

（五）核酸酶（五）核酸酶

11 、、 BAL31BAL31 核酸酶核酸酶

来源：来源：埃氏交替单胞菌埃氏交替单胞菌 ((Alteromonas espejianaAlteromonas espejiana)BAL31)BAL31 。。

（（ 11 ）作用）作用

（（ 22 ）主要用途）主要用途

22 、、 S1S1 核酸酶核酸酶 来源：来源：米曲霉米曲霉 ((Aspergillus oryzaeAspergillus oryzae) )

（（ 11 ）作用）作用

（（ 22 ）主要用途）主要用途

33 、核糖核酸酶、核糖核酸酶 A(RNAA(RNA 酶酶 A)A)

来源：来源：牛胰脏牛胰脏

（（ 11 ）作用）作用

该酶主要具有一种活性，即该酶主要具有一种活性，即内切核糖核酸酶活性内切核糖核酸酶活性，特异地作用于，特异地作用于 RNRNAA 分子上嘧啶残基分子上嘧啶残基 (C(C 和和 U)U) 的的 3’3’ 端，切割其与相邻核苷酸形成的磷酸端，切割其与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。在低盐浓度下，其可切割单链、双链二酯键。在低盐浓度下，其可切割单链、双链 RNARNA 及及 DNA-RNADNA-RNA杂交杂交体中的体中的 RNARNA 。。

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 从从 DNA-RNADNA-RNA杂交体和杂交体和 RNA-RNARNA-RNA杂交体中去除未杂交的杂交体中去除未杂交的 RNARNA 区。区。

② ② 确定确定 DNADNA 或或 RNARNA 中单碱基突变的位置。中单碱基突变的位置。 RNA-DNARNA-DNA杂交体或杂交体或 RNRNA-RNAA-RNA杂交体中的单碱基错配可被该酶识别并切割 杂交体中的单碱基错配可被该酶识别并切割

44 、核糖核酸酶、核糖核酸酶 H(RNAH(RNA 酶酶 H) H)

来源：来源：大肠杆菌大肠杆菌

（（ 11 ）作用）作用

该酶主要具有一种活性，即该酶主要具有一种活性，即内切核糖核酸酶活性内切核糖核酸酶活性，特异地水解，特异地水解 DNDNA-RNAA-RNA杂交体中杂交体中 RNARNA 的磷酸二酯键，但不降解单链或双链的的磷酸二酯键，但不降解单链或双链的 DNADNA 或或RNARNA 。。

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 特异地降解特异地降解 cDNAcDNA 第一链合成时产生的第一链合成时产生的 RNA-DNARNA-DNA 双链中的双链中的 mRNAmRNA分子，以利双链分子，以利双链 cDNAcDNA 的合成；的合成；

② ② 通过合成通过合成 DNADNA 及与及与 RNARNA 形成局部的形成局部的 RNA-DNARNA-DNA杂交体，诱发该酶杂交体，诱发该酶催化特异性的催化特异性的 RNARNA降解。降解。

55 、脱氧核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶 I(DNAI(DNA 酶酶 1) 1)

来源：来源：牛胰脏牛胰脏

（（ 11 ）作用）作用

该酶主要具有一种活性，即该酶主要具有一种活性，即内切核酸酶活性内切核酸酶活性，优先从嘧啶核苷酸处，优先从嘧啶核苷酸处水解双链水解双链 DNADNA 或单链或单链 DNADNA 。在。在 Mg2+Mg2+ 存在下，该酶可独立作用于双存在下，该酶可独立作用于双链链 DNADNA 的每一条链，且切割位点呈随机分布；在的每一条链，且切割位点呈随机分布；在 Mn2+Mn2+ 存在下，该酶存在下，该酶可在双链可在双链 DNADNA 两条链的大致相同位置切割，产生平齐末端两条链的大致相同位置切割，产生平齐末端 DNADNA 片段或片段或只带只带 11～～ 22 个核苷酸单链突出的个核苷酸单链突出的 DNADNA 片段。片段。

（（ 22 ）主要用途）主要用途

① ① 在以切刻平移法进行在以切刻平移法进行 DNADNA标记时，可用该酶在双链标记时，可用该酶在双链 DNADNA 上产生随上产生随机切刻；机切刻；

② ② 建立随机克隆，以便利用建立随机克隆，以便利用 M13M13噬菌体载体进行测序；噬菌体载体进行测序；

③ ③ 分析蛋白质分析蛋白质 -DNA-DNA复合物复合物 (DNA(DNA 酶足迹法酶足迹法 )) 。。