菌根観察方法の高感度化と 最新トピックŒDAB染色の開発 FITC WGA AM fungal cell...

菌根観察方法の高感度化と最新トピック

平成28年度農研機構シンポジウム「菌根:リン酸肥料を減らせる根の秘密」

11月8日 帯広

小八重善裕

農研機構 北海道農業研究センター

菌糸

根毛

伝統的方法：トリパンブルー染色の特徴

長所• 実績が多い• 明視野観察ができる

短所• トリパンブルーが有害• 酸性溶液を使う• 高いバックグラウンド→高倍率の観察必要• 染色過程・封入剤のラクトグリセロールの操作性の悪さ

20 µm

樹枝状体

最近の方法：蛍光標識WGAの特徴WGA: wheat germ agglutinin (コムギ胚芽凝集素)

長所• 高い特異性• 高いコントラスト• 蛍光標識WGAは無害• 酸性溶液を使わない

短所• 蛍光顕微鏡が必要• 根の自家蛍光が問題になる

20 µm

樹枝状体

長所を生かして明視野観察化

AM菌DAB染色の開発

FITC

WGA

AM fungal cell wall (Chitin)

WGA: wheat germ agglutinin

FITC: fluorescein isothiocyanate

N-acetylglucosamine

(GlcNAc)

AM菌DAB染色の開発

HRP

WGA

DAB

N-acetylglucosamine

(GlcNAc)

AM fungal cell wall (Chitin)

WGA: wheat germ agglutinin

HRP: horseradish peroxidase

DAB: 3,3’-Diaminobenzidine

oxidation

トリパンブルー染色(ダイズ根)

100 µm 25 µm

DAB染色(ダイズ根)

100 µm 25 µm

高い組織保存性 (ダイズ根)

DAB TB

10 mm 10 mm

共生構造の特定が容易

0

10

20

30

40

50

60

70

arbuscule vesicle hyphae unknown

Perc

en

tag

e DAB 15x

TB 15x

TB 45x

低倍率でも正確に観察できる

様々な作物に適用できるmaize onion sunflower

potato rice

Bars=100 µm.

土壌のAM菌の感染ポテンシャルが高いと減肥可能

↓

効率的な感染ポテンシャル評価方法の開発

AM菌DAB染色

HRP

WGA

DAB

N-acetylglucosamine

(GlcNAc)

AM fungal cell wall (Chitin)

WGA: wheat germ agglutinin

HRP: horseradish peroxidase

DAB: 3,3’-Diaminobenzidine

oxidation

根の付着物と区別できない

AM菌DAB染色

HRP

WGA

DAB

N-acetylglucosamine

(GlcNAc)

AM fungal cell wall (Chitin)

WGA: wheat germ agglutinin

HRP: horseradish peroxidase

DAB: 3,3’-Diaminobenzidine

oxidation

AM菌発光検出法の開発

HRP

WGA

ECL

N-acetylglucosamine

(GlcNAc)

AM fungal cell wall (Chitin)

WGA: wheat germ agglutinin

HRP: horseradish peroxidase

ECL: Enhanced chemiluminescence

oxidation

2 mm

0

50

100

150

200

250

0 500

Sig

nal str

ength

(a.u

.)

RM

colonization

colonization

RM

Distance (pixels)

付着物の偽シグナルを低減

DAB染色

2 mm

0

50

100

150

200

250

0 20 40 60

Sig

nal str

ength

(a.u

.)

colonization

RM

colonization

RM

Distance (pixels)

ECL発光DAB染色

ハイスループットAM菌感染評価方法

1

1

0.2 mm

2

極めて高感度

DAB染色ECL発光

2

非AM菌の感染には注意が必要

0

10

20

30

40

50

1 2

Sig

nal str

ength

(a.u

.)

**

BuckwheatMaize BuckwheatMaize

ハイスループットな評価が可能

Maize: host

Buckwheat: non-host

** P < 0.01, Welch’s t test

(maize versus buchwheat).

根には多様なAM菌が感染している

各種養分吸収

病虫害抵抗性

乾燥耐性

菌糸の形態

など

200mm

土壌10gから分離したAM菌胞子

菌ごとに異なる機能がある

温度

水分

土壌理化学性

mRNA

mRNA

mRNA

mRNA

mRNA

mRNA

植物細胞 樹枝状体

日照

土壌生物性

核（異核共存体）

新たな価値

根

AM菌

樹枝状体

機能性

土壌

収穫物

養分シグナル

植物

外環境

植物種

品種

施肥

農薬

輪作

耕起

機械設備

収益性

栄養状態

生育ステージ

生産者

菌糸吻合(anastomosis)

菌根機能は様々な要因を受けて発揮される

どの機能がいつ・どこで・なぜ発揮されているのか

温度

水分

土壌理化学性

mRNA

mRNA

mRNA

mRNA

mRNA

mRNA

植物細胞 樹枝状体

日照

土壌生物性

核（異核共存体）

新たな価値菌根機能マーカーの開発

根

AM菌

樹枝状体

機能性

土壌

収穫物

養分シグナル

mRNA

代謝変化

植物

外環境

植物種

品種

施肥

農薬

輪作

耕起

機械設備

収益性

栄養状態

生育ステージ

生産者

菌糸吻合(anastomosis)

圃場における具体的な機能

いつ、どこで、なぜ

樹枝状体

ベシクル

Staining procedure

1. Harvest roots, wash gently to remove soil, immersed in 50% EtOH for 3 h.

2. Remove EtOH, add 20 % KOH (covering the roots) and leave for 3 days at RT.

3. Remove KOH and rinse thoroughly (5x) with deionized water.

4. Rinse once with PBS, remove PBS and add 10 mL WGA-HRP solution .

5. Let at least 16h in WGA-HRP solution.

6. Remove WGA-HRP solution, rinse (3x) with PBS and add 10 mL DAB staining

solution.

7. Let at least 20 min in DAB staining solution.

8. Remove DAB staining solution, rinse once with deionized water and add 10 mL

TE to stop the HRP reaction.Yoshihiro Kobae kobae@affrc.go.jpkobaemail@gmail.com

生産現場、教育現場でもぜひ！