Η δομή του DNA. H αντιγραφή του γενετικο υλικο · •Κυκλικ...

Η δομή του DNA.

H αντιγραφή του γενετικού υλικού.

Α. Ηλιόπουλος Καθηγητής Βιολογίας & Γενετικής

Δομή του μαθήματος

• Δομή του νουκλεοτιδίου

• Σύνθεση πολυ-νουκλεοτιδικών αλυσίδων

• Οργάνωση των πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων

στο DNA

• Αντιγραφή του DNA

• Εφαρμογή του μηχανισμού αντιγραφής στη

τεχνολογία PCR

DNA: Το μακρομόριο που περιέχει τις

μεταβιβαζόμενες γενετικές πληροφορίες οι οποίες, σε

αλληλοεξάρτηση με το περιβάλλον, καθορίζουν τα

γνωρίσματα ενός οργανισμού (φαινότυπο).

Το νουκλεοτίδιο είναι η βασική μονάδα του DNA

Δομή του νουκλεοτιδίου

N-γλυκοσυλικός δεσμός Phoebus Aaron Theodore Levene,

1929

Cν (H2O)ν

Δομή του νουκλεοτιδίου

Δομή του νουκλεοτιδίου

νουκλεοσίδιο

Ονοματολογία

Χωροπληρωτικό μοντέλο Δομικός χημικός τύπος

Δισδιάστατη vs Τρισδιάστατη δομή του νουκλεοτιδίου

Λειτουργίες των νουκλεοτιδίων πέρα του δομικού τους ρόλου

Στα μόρια DNA τα νουκλεοτίδια συνδέονται μεταξύ

τους με ομοιοπολικούς φωσφοδιεστερικούς

δεσμούς

Στα μόρια DNA τα νουκλεοτίδια συνδέονται μεταξύ

τους με ομοιοπολικούς φωσφοδιεστερικούς

δεσμούς

Οι πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες

χαρακτηρίζονται από:

δομική πολικότητα

(οργάνωση)

Αρνητικό φορτίο

Άτομα με δυνατότητα

σχηματισμού «δεσμών

υδρογόνου»: αλληλεπιδράσεις

με μόρια RNA, DNA,

πρωτεϊνών.

Οργάνωση των πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων

στο DNA Δεσμοί σε μόρια DNA:

• ομοιοπολικοί φωσφοδιεστερικοί • υδρογόνου

Σημασία της συμπληρωματικότητας

των βάσεων

• Κάθε έλικα του DNA μπορεί να αποτελέσει το καλούπι (οδηγίες) για τη σύνθεση ενός νέου κλώνου που θα είναι ταυτόσημος με τη συμπληρωματική της έλικα.

• Έτσι, κάθε μόριο DNA καθοδηγεί την ίδια του την αντιγραφή.

• Η συμπληρωματικότητα των βάσεων χρησιμοποιείται για τη σύνθεση μονόκλωνης αλυσίδας RNA (μεταγραφή).

Οργάνωση των πολυνουκλεοτιδικών

αλυσίδων στο DNA με αντι-παράλληλη

διάταξη

O

P

O - CH2 P Ο

O - CH2 P Ο

O

O

O

P

O - CH2 Ο

O - CH2 P Ο

O

O - CH2

P Ο

O

Ο

O - CH2

P Ο

Ο

5’

5’

3’

3’

O

O

O

…

Θα μπορούσαν οι κλώνοι να είναι παράλληλοι?

ΟΧΙ! Κλώνοι είναι αντιπαράλληλοι γιατί μόνο

D-ισομερή νουκλεοτιδίων υπάρχουν στην φύση!

Σχηματίζει δεξιόστροφη έλικα.

Αντιπαράλληλες αλυσίδες.

Περίπου 10 βάσεις (base

pairs bp) ανά στροφή έλικας.

Μία στροφή της έλικας είναι

34 Å.

Οι βάσεις διατάσσονται στο

εσωτερικό, οι φωσφορικές

ομάδες στο εξωτερικό της

έλικας.

Περίληψη δομής DNA

Τρισδιάστατη δομή και σταθερότητα DNA:

1. Δεσμοί υδρογόνου

Τρισδιάστατη δομή και σταθερότητα DNA:

2. Δεσμοί Van der Waals – πλήρωση χώρου

Τρισδιάστατη δομή και σταθερότητα DNA:

2. Δεσμοί Van der Waals – πλήρωση χώρου

Τρισδιάστατη δομή και σταθερότητα DNA:

3. Δεσμοί υδρογόνου μεταξύ βάσεων σε

παράλληλα επίπεδα

Πλεονεκτήματα της διπλής

έλικας

• Σταθερότητα: προστατεύει τις βάσεις από

προσβολή από υδατοδιαλυτά μόρια ή/και από

μόρια H2O.

• Παρέχει ευκολία στον μηχανισμό αντιγραφής.

Αποδιάταξη του DNA

Αποδιάταξη του DNA

H θερμοκρασία στην οποία το ½ του δείγματος DNA έχει

αποδιαταχθεί ονομάζεται «θερμοκρασία αποδιάταξης»

(melting temperature (Tm)

Προφιλ αποδιάταξης DNA

DS

SS

SS

Ab260

Tm

Temperature

Το προφιλ αποδιάταξης μπορεί να διαφοροποιήσει δίκλωνο

(double stranded) από μονόκλωνο (single stranded) DNA

Προφιλ αποδιάταξης DNA

Το προφιλ αποδιάταξης μπορεί να διαφοροποιήσει μόρια DNA με

διαφορετικό ποσοστό G-C και A-T.

• Περιοχές πλούσιες σε A═T αποδιατάσσονται πρώτα (χαμηλή Tm)

• Περιοχές πλούσιες σε G≡C αποδιατάσσονται τελευταία (υψηλή Tm)

DS

SS

GC rich DNA

AT rich DNA

GC/AT DNA

Tm1 Tm2 Tm3

Δομή του μαθήματος

• Δομή του νουκλεοτιδίου

• Σύνθεση πολύ-νουκλεοτιδικών αλυσίδων

• Οργάνωση των πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων

στο DNA

• Αντιγραφή του DNA

• Εφαρμογή του μηχανισμού αντιγραφής στη

τεχνολογία PCR

Ποιός είναι ο ρόλος του DNA?

Πως μεταβιβάζεται με πιστότητα η γενετική πληροφορία?

Κάθε κλώνος του DNA παίζει το ρόλο εκμαγείου για την

σύνθεση ενός καινούργιου κλώνου.

Κάθε κλώνος του DNA παίζει το ρόλο εκμαγείου για την

σύνθεση ενός καινούργιου κλώνου.

C – G A -T

Συμπληρωματικότητα Βάσεων:

Η αντιγραφή του DNA είναι ημισυντηρητική

Αντιγραφή στο E.coli

• Κυκλικό DNA περίπου 4.6x106 bp

• H αντιγραφή αρχίζει στην (1) αφετηρία αντιγραφής (origin of replication : OriC)

• H αντιγραφή κινείται προς τις 2 κατευθύνσεις μέχρι να συναντηθούν (θέση τερματισμού - termination site)

• H αντιγραφή επιτυγχάνεται μέσω μιας πρωτεϊνικής μηχανής (replisome).

• H διχάλα της αντιγραφής κινείται 1000 bp/sec – έτσι το χρωμόσωμα του E.coli αντιγράφεται σε 38 min = 2280 s.

Αντιγραφή στο E.coli

• Κυκλικό DNA περίπου 4.6x106 bp

• H αντιγραφή αρχίζει στην (1) αφετηρία αντιγραφής (origin of replication : OriC)

• H αντιγραφή κινείται προς τις 2 κατευθύνσεις μέχρι να συναντηθούν (θέση τερματισμού - termination site)

• H αντιγραφή επιτυγχάνεται μέσω μιας πρωτεϊνικής μηχανής (replisome).

• H διχάλα της αντιγραφής κινείται 1000 bp/sec – έτσι το χρωμόσωμα του E.coli αντιγράφεται σε 38 min = 2280 s.

• Λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα

• Η διαδικασία διακρίνεται σε έναρξη (initiation), επιμήκυνση (elongation) και τερματισμό (termination)

• Πρωτεϊνικά σύμπλοκα «καταλύουν» κάθε τμήμα της διαδικασίας.

Αντιγραφή στο E.coli

• Λαμβάνει χώρα στον πυρήνα

• Η διαδικασία διακρίνεται σε έναρξη (initiation), επιμήκυνση (elongation) και τερματισμό (termination)

• Πρωτεϊνικά σύμπλοκα «καταλύουν» κάθε τμήμα της διαδικασίας

• Πολλαπλά σημεία έναρξης της αντιγραφής

Αντιγραφή στα ευκαρυωτικά

κύτταρα

Η αντιγραφή στο ευκαρυωτικό κύτταρο ξεκινάει από

πολλαπλές ‘αφετηρίες αντιγραφής’ (origins of replication)

Κάθε κλώνος του DNA παίζει το ρόλο εκμαγείου για την

σύνθεση ενός καινούργιου κλώνου.

• εκκινητής

• dNTPs

• εκμαγείο

• πολυμεράση

• Κατεύθυνση

αντιγραφής 5’ 3’

Μερικές από τις πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την διαδικασία

της αντιγραφής στα ευκαρυωτικά κύτταρα

DNA replication: a summary

Μερικές από τις πρωτεϊνες που ρυθμίζουν την διαδικασία

της αντιγραφής

• Στον καθυστερημένο κλώνο, η κίνηση του ενζύμου γίνεται προς

αντίστροφη κατεύθυνση από την κατεύθυνση ξεδιπλώματος.

• Επομένως η αντιγραφή γίνεται τμηματικά (~1000): Okazaki

fragments

• Η DNA Pol απομακρύνει τον εκκινητή RNA

• DNA λιγκάση συνδέει τα τμήματα Okazaki

DNA replication: a summary

https://www.youtube.com/watch?v=TNKWgcFPHqw

a: εναρκτήρια (πριμάση)

d: Επιμήκυνση και επιδιόρθωση

e: Επιμήκυνση και επιδιόρθωση (μύκητες)

b: Επιδιόρθωση

g: Αντιγραφή μιτοχονδριακού DNΑ

Οι ευκαρυωτικές DNA πολυμεράσες

Το πρόβλημα της αντιγραφής στα άκρα των χρωμοσωμάτων

Το πρόβλημα της αντιγραφής στα άκρα των χρωμοσωμάτων

Το πρόβλημα της αντιγραφής στα άκρα των χρωμοσωμάτων

Tελομερή και τελομεράση

GGGGTTA

Το πρόβλημα της αντιγραφής στα άκρα των χρωμοσωμάτων

λύνεται από τις τελομεράσες…

Τα τρία στοιχεία αλληλουχιών που είναι απαραίτητα

για την σωστή αντιγραφή του DNA στα χρωμοσώματα.

Δομή του μαθήματος

• Δομή του νουκλεοτιδίου

• Σύνθεση πολύ-νουκλεοτιδικών αλυσίδων

• Οργάνωση των πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων

στο DNA

• Αντιγραφή του DNA

• Εφαρμογή του μηχανισμού αντιγραφής στη

τεχνολογία PCR

Melting

94 oC

Tem

per

atu

re

100

0

50

T i m e

5’ 3’

3’ 5’

Melting

94 oC

Tem

per

atu

re

100

0

50

T i m e

3’ 5’

5’ 3’

Heat

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ure

100

0

50

T i m e

3’ 5’

5’ 3’ 5’

5’

Melting

94 oC

Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ure

100

0

50

T i m e

30x

3’ 5’

5’ 3’

Heat

Heat

5’

5’

5’

Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ure

100

0

50

T i m e

30x

3’ 5’

5’ 3’ 5’

5’

5’

5’

5’

5’

Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ure

100

0

50

T i m e

30x

3’ 5’

5’ 3’ 5’

5’

5’

5’

5’

5’

Heat

Heat

Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ure

100

0

50

T i m e

30x

3’ 5’

5’ 3’ 5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Fragments of

defined length

Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ure

100

0

50

T i m e

30x

3’ 5’

5’ 3’ 5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

DNA Between The Primers Doubles With

Each Thermal Cycle

0

Cycles

Number

1

3

8

2

4

1

2

4

16

5

32

6

64

Περισσότεροι κύκλοι= περισσότερο DNA

Number of cycles

0 10 15 20 25 30

Size

Marker