1 SPETTROSCOPIA NMR DI PROTEINE Struttura tridimensionale della proteina G con il metodo degli...

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SPETTROSCOPIA NMRDI PROTEINE

Struttura tridimensionale della proteina G

con il metodo degli accoppiamenti dipolari

Candidato: Francesco Stellato

Relatore: Prof. S. Morante (Dip.Fisica, Tor Vergata)

Correlatore: Prof. M. Blackledge  (IBS, Grenoble)

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SOMMARIO

• Basi teoriche fisiche

• Apparato sperimentale

• Basi “teoriche” biologiche

• Preparazione del campione

• Simulazione

• Conclusioni

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Basi teoriche fisicheGià nel 1946 Bloch1 e Purcell2, indipendentemente l’uno dall’altro, intuirono le potenzialità della Risonanza Magnetica Nucleare (NMR). L’NMR si basa sull’interazione tra il momento magnetico nucleare ed un campo magnetico esterno e può, quindi, essere utilizzato solo se J≠0.

A Z J

Pari Pari 0

Pari Dispari Intero

Dispari Pari/Dispari Semi-intero

A = numero di massa, Z = numero atomico1Bloch, Hansen, Packard. (1946), Phys.Rev. 69, p. 1272Purcell, Torrey, Pound. (1946), Phys. Rev. 69, pp. 37-38

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J2 =│J2│= J∙J = ħ2[J(J+1)]

μ = γJ momento magnetico associato, γ = rapporto giromagnetico

La degenerazione è rimossa in presenza di un campo magnetico

esterno, B

Jz= ħm, m = (-J, -J+1,…, J-1, J)

Em = -μ∙B = -J∙B

prendendo B // z B B0

Em = - γJzB0 = -mħγB0 2J+1 livelli equispaziati (livelli Zeeman)

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All’equilibrio: stati popolati secondo la statistica di Boltzmann

12J

T/kγBm1

T)/kEexp(

T)/kEexp(

N

N B0

J

Jm

Bm

Bmm

ħ= 1.05 x 10-34 J·s; = 108 (T·s)-1; B= 10T; kB= 1.38 x 10-23 J·K-1

T300 K mħγB0/kT << 1

Per un campione macroscopico M=M0 z

T3k

1)J(JBNγmNγM

B

022J

Jm

m0

ˆ

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EQUAZIONI DI BLOCH

dJ(t)/dt=M(t) x B(t);

Poichè, M=γJ dM(t)/dt=M(t) x γB(t)

Sistema di riferimento rotante intorno ad un asse fisso con velocità angolare costante, ω

(dM(t)/dt)rot=(dM(t)/dt)lab+M(t) x ω= M(t)x(γB(t)+ω)

Ponendo, Beff=B(t)+ω/γ

Si ottiene, (dM(t)/dt)rot=M(t) x γBeff(t)

M(t) precede intorno a B(t) con frequenza ω = γB;

se B=(0,0,B0) ω = ω0= γB0:

M(t): campo magnetico variabile nel tempo f =-d/dt.

f = segnale NMR

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All’equilibrio:

M//B Non c’è segnale

impulso rf

M(t) precede intorno a B0

c’è segnale

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A causa di fenomeni dissipativi (rilassamento) decadimento di: magnetizzazione trasversa (Mx e My) e longitudinale (Mz)

Bloch ha proposto semplici espressioni per descrivere il fenomeno del rilassamento:

dMx(t)/dt=-Mx(t)/T2 → Mx(t)=Mx(0)exp(-t/T2)

dMy(t)/dt=-My(t)/T2 → My(t)=My(0)exp(-t/T2),

dMz(t)/dt=[M0-Mz(t)]/T1 → Mz(t)=M0-[M0-Mz(0)]exp(-t/T1)

T1 e T2 : costanti di tempo longitudinale e trasversale

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Apparato sperimentale1. Magnete: solenoide super-

conduttore; B > 10 T

2. Sonda (coassiale al

magnete): invia l’impulso rf e

riceve il segnale

3. Programmatore di impulsi e

trasmettitore: generano

l’impulso perturbante

4. Rivelatore:

preamplificazione e

conversione digitale

5. Computer: acquisizione dati

e FT spettro NMR

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Schema generale di un esperimento NMR

1. Il campione è posto in un campo magnetico B

2. L’invio di un impulso elettromagnetico perturba l’equilibrio

3. La precessione della magnetizzazione genera un segnale

elettrico noto come FID (Free Induction Decay)

4. Il FID è registrato, e quindi trasformato di Fourier, nel

dominio della frequenza: FID(t) → ()

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Basi “teoriche” biologicheLe proteine sono polimeri lineari di aminoacidi (aa) e svolgono la maggior parte delle funzioni necessarie alla vita (trasporto, catalisi, difesa immunitaria, etc…). I 20 diversi aa naturali differiscono per le caratteristiche fisico-chimiche della catena laterale R.

Gli aa sono legati tramite il legame peptidico, che ha luogo tra il gruppo carbossilico di un aa ed il gruppo amminico del successivo, con la formazione di una molecola d’acqua.

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In una proteina sono individuabili 4 livelli strutturali:

1. Struttura primaria = sequenza lineare di aminoacidi

2. Struttura secondaria = struttura locale della catena (-elica, -

sheet, …)

3. Struttura terziaria = struttura 3D globale

4. Struttura quaternaria = disposizione spaziale di subunità diverse

E’ utile definire 2 angoli torsionali:

: rotazione intorno a C-N

: rotazione intorno a C -C’

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Preparazione del campione1. Selezione del gene che codifica la proteina

2. Inserimento del gene in un plasmide e trasferimento in batterio (E. coli)

3. Scelta del mezzo di crescita*: crescita a 37 °C

4. Lisi e purificazione della proteina

Caratteristiche necessarie:

1. Campione puro (almeno) al 95 %2. Proteina stabile per tutta la durata

dell’esperimento3. La proteina non deve formare

aggregati alla concentrazione necessaria per l’esperimento (generalmente, circa 1 mM)

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• 15NH4Cl (cloruro di ammonio) come unica fonte di N, per avere

proteine marcate con 15N

• 13C6H12O6 (glucosio) come unica fonte di C, per avere proteine

marcate con 13C

• 2H2O (acqua pesante) per avere proteine marcate all’80% con 2H

+ C62H12O6 (glucosio) per avere il 100% di 2H

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SimulazioneDati sperimentali

RDC3

InsightII*

File PDB2Dati cristallografici1

MECCANO5

MODULE4

RMS

Σ[( (x1-x2)2 + (y1-y2)

2 + (z1-z2)2]½ / N

*©Accelrys Inc.

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Sito GB3

-elica

-sheet1

-sheet2

-sheet3

-sheet4

La proteina G

proteina della parete batterica con vari siti di legame per l’anticorpo

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HEADER IMMUNOGLOBULIN BINDING PROTEIN 05-AUG-94 XXXX TITLE THE THIRD IGG-BINDING DOMAIN FROM STREPTOCOCCAL PROTEIN G: TITLE 2 AN ANALYSIS BY X-RAY CRYSTALLOGRAPHY OF THE STRUCTURE TITLE 3 ALONE AND IN A COMPLEX WITH FAB COMPND PROTEIN G KEYWDS IMMUNOGLOBULIN BINDING PROTEIN EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.P.DERRICK, D.B.WIGLEY

ATOM 1 N MET A 1 1.482 2.881 4.315 1.00 10.85 N ATOM 2 CA MET A 1 1.504 3.440 5.674 1.00 9.28 C ATOM 3 C MET A 1 1.417 4.966 5.566 1.00 7.23 C ATOM 4 O MET A 1 1.828 5.536 4.548 1.00 10.61 O ATOM 5 CB MET A 1 2.786 3.039 6.438 1.00 13.17 C ATOM 6 CG MET A 1 4.008 3.686 5.823 1.00 23.31 C ATOM 7 SD MET A 1 5.553 3.396 6.808 1.00 28.10 S ATOM 8 CE MET A 1 5.224 4.534 8.175 1.00 29.75 C ATOM 9 N THR A 2 0.914 5.587 6.600 1.00 9.74 N ATOM 10 CA THR A 2 0.874 7.070 6.635 1.00 12.11 C ATOM 11 C THR A 2 2.218 7.455 7.275 1.00 10.05 C ATOM 12 O THR A 2 2.738 6.701 8.119 1.00 11.94 O

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•RDC: Accoppiamento dipolare per un sistema di 2 nuclei, A e B

1)θ2(3cosJJDH zz BAABmax

< >: media temporale o sull’ensemble

( solvente anisotropo)

: angolo AB, B;

DAB=-0(h/2π)γAγB/(4π2r3)

DAB può essere data in funzione di e di una matrice diagonale, A,

(tensore di allineamento). Gli elementi Aii corrispondono alla probabilità

di trovare l’i-esimo asse parallelo a B0.

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Sono stati misurati (Ulmer 3)

• 6 campioni (A-F) di proteina G da E.coli HMS174 in mezzo

minimo di crescita: 13C6H12O6 e 15NH4Cl e con diversi

solventi

• 4 valori di RDC per residuo: Cα-C’, Cα-Hα, N-H, C’-N

MODULE4

RDC sperimentali

A

RDC calcolati

3 T.S. Ulmer, B.E.Ramirez, F.Delaglio, A.Bax. (2003), JACS 125: pp. 9179-9191 4 MODULEBy P.Dosset, J.C.Hus, M.Blackledge. IBS, Grenoble

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MECCANO

RDC in 2 mezzi

PDB

φ e ψ (se disponibili)

Aii

nei 2mezzi

Procedura “step-by-step”: dal 1° peptide determinando

l’orientazione relativa di quelli seguenti per cui

σ

) ψ (ψ

σ

) (k) (109

σ

) D (Dχ

2calcexp

2calcexp2

ij ij

2calcexp2

è minima.

2χ

5 MECCANOBy M.Blackledge. IBS, Grenoble

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Residui RMS1(Å) RMS2(Å) RMS3(Å) RMS4(Å) RMS5(Å) RMS6(Å) RMS7(Å)

8-60 12.863 11.003 9.540 2.775 5.530

8-41 10.838 2.614 2.681 2.311 2.699

22-41 5.122 5.635

29-41 2.963 2.563 0.680 0.334 0.651

RMS1 : -elica; RMS2 : intera struttura; RMS3 : vincolo su e (=10°); RMS4 : vincolo su e (=0.001°); RMS5 : come RMS3 tranne tra 41-44 dove come

RMS4; RMS6 : come RMS1 ; RMS7 : come RMS4

La simulazione è stata eseguita utilizzando i seguenti campioni:

peg: polietilen glicolo; npg: gel di poliacrilamide carico negativamenteppg: gel di poliacrilamide carico positivamente

In particolare: da 1 a 5 è stata usata la coppia npg-ppg (Anpg · Appg = -0.132), per 6 e 7 la coppia npg-peg (Anpg · Apeg = 0.224)

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Conclusioni

L’NMR è una tecnica molto potente per lo studio della struttura

delle molecole in soluzione. La ricerca di strategie sempre più

efficienti per estrarre informazione dagli spettri è di importanza

fondamentale. L’uso degli RDC come unico mezzo per

determinare la struttura 3D va proprio in questa direzione, e il

lavoro di simulazione qui presentato ne ha dimostrato le

potenzialità nel caso specifico di una proteina strutturalmente

rappresentativa.

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Interpretazione dei risultati delle simulazioni

RMS1: il risultato è buono solo nella parte di elica, che è la

parte usata per trovare il tensore di allineamento.

RMS2: il risultato è buono anche tra 8 e 41, mentre nella parte

finale persistono problemi.

RMS3: il risultato è migliore di quello ottenuto senza questi

vincoli, ma nella parte finale persistono problemi.

RMS4: il risultato è buono ovunque.

RMS5: Per i residui 6-41 si ottiene come aspettato un RMS simile

a quello di RMS3 mentre l’RMS dell’intera proteina è

sensibilmente migliore.

RMS6 e RMS7: Quanto più piccolo è Aa · Ab tanto migliore è la

determinazione della struttura 3D.

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Nucleo J (T·s)-1 %1H ½ 2.67·108 99.982H 1 4.11·107 0.0213C ½ 6.73·107 1.1114N 1 1.93·107 99.6415N ½ 2.71·107 0.3617O 5/2 -3.63·107 0.0419F ½ 2.51·108 100.00

Proprietà di nuclei leggeri con J0

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V = - V0 + ½ k r2 – Vls ls – Vl l(l+1)

Modello a strati Livelli a particella singola