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CLASE 11 DE BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
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Técnicas moleculares para el aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un
fragmento de ADN específico
Esta tecnología se denomina:Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o ingeniería genética
Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica
Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:
El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado
Herramienta básica
Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato.
• Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar)
• Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes
5´-acgtattccggaacatcgacctGAATCCactttagcgtagctaccgctcgcag- 3´
3´-tgcataaggccttgtagctggaCTTAGGtgaaatcgcatcgatggcgagcgac- 5´
EcoRI: E. ColiBamHI: Bacillus amyloliquefaciens
Dos tipos de cortes:
• Corte plano: extremos romos
• Corte escalonado:extremos pegajosos o cohesivos
Las enzimas de restricción tipo II:
Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos
Clonado de ADN
•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
•Vector de clonación (vehículo)
•Organismo huésped (E. Coli)
•Selección de vectores
TEJIDO VECTORES
mRNA DNA
cDNA DNA digerido(doble cadena metilado)
DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE
INTRDUCCION EN CELULA HUESPED
Biblioteca (Screening-subclonado)
Clonado de ADN
VECTORES
Construidos a partir de plásmidos y bacteriófagos naturales
Características
1) ORIGEN DE REPLICACION : Posee secuencias que permiten su propagación
2) MCS: (multiple cloning site) sitio para insertar el DNA a clonar- Posee sitios únicos para varias ER
3) MARCADORES DE SELECCIÓN: Confieren propiedades fenotípicas a la célula huésped.
TIPOS DE VECTORES
1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos de DNA
2) VECTORES DE EXPRESIÓN- Expresión de genes clonados
3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de promotores y secuencias regulatorias de la expresión génica
TIPOS DE VECTORES DE CLONADO
PLASMIDOS: Límite clonado 0.1- 10 Kb
FAGOS: Derivados del bacteriófago Lambda, 8-25 Kb
COSMIDOS: Combinación fago l y plásmido, 35-50 Kb
BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) Derivados plásmido F, 75-300 Kb
Vectores derivados de Bacteriofago P1 , 100 Kb
YAC (Yeast artificial Chromosome) cromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kb
PLASMIDOS
Molécula DNA doble cadena circular extracromosomal que replica en forma autónoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb)
FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS
Resistencia a antibióticos
Degradación de compuestos orgánicos (Pseudomonas)
Producción de toxinas (ej E.coli enterotoxinas)
Producción de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)
Inducción de tumores (plantas)
Sistemas de Restricción-modificación
Producción de antibióticos (ej Streptomyces)
Resistencia a metales pesados
CLASIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS
Nº DE COPIAS: Alto o bajo Nº de copias.
El Nº de copias depende del tipo de ori de replicación
30 Replicones diferentes
Bajo Nº de copias:1-5 copias
Alto Nº de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias)
CONJUGATIVOS O NO
GRUPO DE COMPATIBILIDAD
PLASMIDOS -VECTORES DE CLONADO
CARACTERISTICAS
1) ORI (derivados de ColE1)
2) POLILINKER (MCS)
3) MARCADORES DE SELECCIÓN
4) SECUENCIAS PARA SCREENING: b-Galactosidasa
MARCADORES DE SELECCIÓN
Permiten la selección de aquellas células que poseen el vector :
- Marcadores de resistencia a antibióticos
-Marcadores de auxotrofía (permiten sobrevivir en ausencia de un componente esencial ej aminoácidos)
MARCADORES DE SELECCIÓNAmpicilina: Interfiere con síntesis de pared bacterianaResistencia: gen bla (b-lactamasa)
Tetraciclina: Inhibe síntesis de proteínas por unión a subunidad ribosomal 30sResistencia: gen tet (proteína que se une a membrana bacteriana e impide transporte del antibiótico)
Kanamicina: Se une a ribosomas 70s , produce misreading del mRNAResistencia: gen kan (aminoglicosido fosfo transferasa modifica el antibiótico)
pUC19
Vectores de clonado
•Fago (2 sitios de corte) < 24 kb
•Cromosomas artificiales P1 (derivados del bacteriófago P1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb
Fago
Formación de placa de lisis
Vectores de clonado•Cósmido: extremos cos + DNA plásmido (origen replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb
•BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas
Cósmido
Huésped: E. coli
Introducción del vector recombinante en el huésped:
• Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma
• Fago (transducción, inserción en DNA huésped)
• Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido)
Selección de vectores recombinantes
• Plásmido: resistencia a antibióticos
• Fago : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de si contiene el inserto foráneo)
ETAPAS DE CLONADO EN PLÁSMIDOS
DIGESTION con ER : Plásmido y ADN a clonar
LIGACION (in vitro, ligasa)
TRANSFORMACION ( bacterias competentes)
SELECCIÓN
SCREENING
Desfosforilación del vector: fosfatasa alcalina
Como mejorar la reacción de ligación
Ligación como una reacción bimolecular en dos etapas
1º reacción intermolecular entre el vector y el fragmento
2º reacción intramolecular
favorecida por una elevada concentración de extremos
favorecida por una baja concentración de extremos
Como mejorar la reacción de ligación
TRANSFORMACION Y SELECCION
TRANSFORMACION
Bacterias competentes:
Métodos químicos: Cl2Ca, DMSO, etc
Eficiencia:107 cel/ug DNA
Métodos físicos: Electroporación (pulsos electricos )
Ef: 108cel/ug DNA
SELECCIÓN
Presión de selección : crecimiento en presencia de antibiótico
Métodos de selección de clones recombinantes
para detectar la mólecula de plásmido que posee inserto
b-galactosidasa (no es concluyente)
Mapeo de restricción
PCR (colony PCR)
Hibridización in situ en la colonia con sonda específica
Operón Lactosa
Selección de clones recombinantes mediante alfa complementación
Métodos de selección
· Resistencia a antibióticos
La resistencia la confieren genes que porta el vector, en este caso a ampicilina y a tetraciclina
PlásmidopBR322
El ADN foráneo se inserta en el gen de resistencia a Ampicilina
Sin plásmidoSin inserto
· Resistencia a antibióticos
La resistencia la confieren genes que porta el vector
Con ampicilinay tetraciclina
Con plásmidoSin inserto
Con plásmidoCon inserto
Con tetraciclina
Métodos de selección
Vectores de expresiónProteínas expresadas en E. coli
1) Proteínas de fusión:
Región que codifica una proteína “tag” fusionada en marco de lectura a la región que codifica para la proteína target.
Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión purificación
protege de proteólisis a la proteína de interés mejora la solubilidad de la proteína estabiliza a la proteína de interés
oriAmpr
ATG A B MCSPromotor
A Secuencia “tag”:*Dominio con función enzimática*Señales topogénicas
B Secuencias consenso paraCorte con una proteasa
MCS Sitio múltiple de clonado
Esquema genérico del vector
Optimización de la expresión de proteínas en E. coli
1) Iniciación de la traducción: Promotor fuerte producirá altos niveles de mRNASe requiere optimizar la traducción.
UAAGGAGGAUUCCUCC AUG5’ 3’
mRNA
3’ 5’16S rRNA
small ribosomal subunit
Secuencia de Shine Dalgarno: Secuencia complementaria a región en 16S rRNA
(subunidad pequeña del ribosoma)
Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG
Problemas cuando se expresan proteínas eucarióticas en cél procariotas:Inestables.
Sin actividad biológica.Contaminantes procarióticos.
Soluciones: se han desarrollado sistemas de expresión en eucariotas• Esp. importantes para proteínas terapéuticas.• Necesidad de que tengan idénticas propiedades bioquímicas, biofísicas y funcionales a la
proteína natural.
Modificaciones post-traduccionales– Formación de uniones disulfuro correctas.– Clivaje proteolítico del precursor inactivo.– Glicosilación- agregado de residuos de azúcar– Alteración de aminoácidos en la proteína: fosforilación, acetilación, agregado de
grupos sulfato, agregado de ácidos grasos
Vectores de expresión eucariotas
Elementos para clonado en bacteriasori de replicaciónMarcador de selección bacterianoSitios múltiples de clonado
Elementos específicos de vectores eucariontes
Promotor eucariotaSeñal de poliadenilaciónSecuencias Kozak y codón ATGIntrónTags-proteínas de fusiónori de replicación eucarionte como el de SV40 (opcional)Marcador de selección para células eucariontes (para transfecciones estables)Segmentos de DNA para recombinación homóloga
Vector de expresión eucariota
Vector de fusión a EGFP
Expresión de proteínas fluorescentes
Proteína fluorescente verde
Hay dos tipos básicos de bibliotecas de ADNGenómicas cDNA
Para que se construyen librerías:
- Identificar genes.- Identificar secuencias regulatorias. - Identificar genes expresados diferencialmente.- Secuenciar genomas- Conocer secuencias de aminoácidos, en librerías de cDNA.
Es una colección de moléculas de DNA consistiendo de fragmentos del genoma entero (Librería genómica) o copias de todos los RNAm producidos por una célula o tipo celular (Librería de cDNA) insertado en un vector de clonación e introducido en una célula hospedera.
Bibliotecas de ADN o genotecas
Fuentes de RNA???.
Clonado de gDNA y cDNA
Caminar sobre DNA
Construcción Biblioteca de ADNc
1. Purificación de ARNm 2. Síntesis de la primera ADNc.3. Síntesis de la segunda cadena del ADNc.4. Clonado en el vector
Purificación ARN
Purificación ARN
Oligo (dt)Celulosa
T T T T T
Poly A, hibridizacon Oligo (dt)
A A A A
100 Mm NaCl
10 Mm Tris1mM EDTA
Poly mRNA eluido
Purificación de mRNA
A A A A T T T T
A A A A T T T T
A A A A T T T T
A A A A T T T T
A A A A A A
A A A A A A
A A A A A A
A A A A A A
A A A A
A A A A
T T T T T
T T T T TT
• Primer método
Síntesis de la primera cadena de cDNA
• Segundo método
Síntesis de la primera cadena de cDNA
Ligación al vector
Adaptadores
Ligación
Cómo obtener un animal genéticamente modificado
Ratón transgénico: microinyección del ADN de interés en el pronúcleo.
Ratón knockout: inyección de células embrionarias modificadas con el gen de interés en el blastocisto.
Microinyección pronuclear para hacer un ratón transgénico
Los que desarrollan se llaman fundadores y son hemicigotas para el transgen.
Diferencias entre transgénico y knockout
target
targetingvector
neor
neor
homologous recombination
“knockout”
gene microinjection
gene
“transgenic”
TK
Embryonic Stem Cells
• totipotent/pluripotent in vivo/in vitro• extraordinary proliferation potential in vitro• homologous recombination
Positive and Negative Selection of Targeted ES Cells
Recombinants with random insertion
Selection for neor positive
Con antibiótico G418
Selection for TK negative
ES cells with homologous recombination
neor TKES Cells
target
X
Generation of Chimeras
Targeted ES cells
Goal: obtain germline transmission
Cómo “construir el transgen”
ADNc
Promotor UTR
Intrón
Vector
Peces fluorescentes para todos!
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