4. Σύνδεση σε υποδοχείς 2013

Ποσοτική έκφραση της δράσης των φαρμάκων

Φαρμακοδυναμική

Η αλληλεπίδραση των φαρμάκων με τους στόχους

τους (‘υποδοχείς’) καθορίζει την βιολογική απόκριση

του οργανισμού στα φάρμακα

Η έννοια του υποδοχέα οφείλεται στους

John Newport Langley (1852-1925) και Paul Ehrlich (1854-1915)

«υποδεκτική» (receptive) ουσία πλευρικές αλυσίδες ή υποδοχείς (lateral chains, receptors)

ΚορεσμόςΣτερεοεξειδίκευσηΑναστρεψιμότητα

Εξειδικευμένη κατανομή

Η μελέτη των χαρακτηριστικών της σύνδεσηςφαρμάκων σε υποδοχείς εκτίμηση απόκρισης τουοργανισμού σε φάρμακο

την συγγένεια των φαρμάκων-προσδετών προς υποδοχείς την κινητική της αλληλεπίδρασης του προσδέτη με τον υποδοχέα

Σύνδεση υποδοχέα-προσδέματος (receptor-ligand binding)

Σήμανση προσδέματος με 3Η το πρόσδεμα παραμένει βιολογικά αναλλοίωτο διατηρείπαρόμοια χαρακτηριστικά πρόσδεσης με το μη σημασμένο πρόσδεμα μεγάλος χρόνος ημιζωής (~ 12 χρόνια)

Σήμανση προσδέματος με 125Ι Υψηλή ειδική ραδιενέργεια (specific radioactivity) ανίχνευση

υποδοχέων ακόμη και σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις ΑΛΛΑ μικρός χρόνος ημιζωής (~ 60 ημέρες)

μεγάλο μόριο (π.χ. δύσκολη σύνδεση με νευροδιαβιβαστή) αλλαγή της βιολογικής δραστικότητας προσδέματος

Ειδική σύνδεση προσδέματος-υποδοχέα

Η μελέτη της ειδικής σύνδεσης (specific binding) ενός ραδιενεργού προσδέματος με τους υποδοχείς του συνίσταται στη μέτρηση της ραδιενέργειας που παραμένει δεσμευμένη στους υποδοχείς και οδηγεί στον υπολογισμό της ποσότητας των υπό μελέτη

υποδοχέων και τις κινητικές σταθερές της σύνδεσης

Διαδικασία υπολογισμού ειδικής σύνδεσης

συγκέντρωση (c)

Ειδική σύνδεση (καμπύλη κορεσμού)

1. Το μόριο-προσδέτης που χρησιμοποιείται πρέπει να έχει την ικανότητα να δεσμεύεται σε ένα

μόνο υπότυπο υποδοχέων

π.χ. επειδή υπάρχουν 15 περίπου υπότυποι σεροτονεργικών υποδοχέων, η χρησιμοποίηση της σεροτονίνης ως ραδιενεργού

προσδέτη για τη μελέτη ενός από αυτούς δεν είναι χρήσιμη, γιατί η ραδιενέργεια που θα μετρήσουμε θα μας δώσει τη

συγκέντρωση και των 15 σεροτονεργικών υποδοχέων

είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός συνδέτη ικανού να αναγνωρίσει έναν και μόνο έναν υπότυπο υποδοχέα

2. Ο ραδιενεργός προσδέτης πρέπει να είναι σημασμένος με υψηλή ειδική ραδιενέργεια

Επιτρέπει την ανίχνευση του συμπλέγματος ραδιενεργού προσδέτη-υποδοχέα ανίχνευση υποδοχέων που απαντούν σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση στο δείγμα μας

Η ένδειξη του μετρητή ραδιενέργειας μας επιτρέπει να υπολογίσουμε με ακρίβεια την συγκέντρωση του υποδοχέα

ειδική ραδιενέργεια του προσδέτη εκφράζεται σε Ci/mmoleτα Ci μετατρέπονται σε διασπάσεις/λεπτό (dpm: desintegration permin) ή χτύπους/λεπτό (cpm: counts per min)

Για ακριβείς μετρήσεις πρέπει ο μετρητής ραδιενέργειας να μετρήσει minimum 1.000 cpm ραδιενέργειας ειδική ραδιενέργεια πάνω από 10Ci/mmole ανίχνευση 100 fmoles/mg πρωτεϊνών μεμβράνης

Μη ειδική σύνδεση του προσδέτη μπορεί να γίνει σε θέσεις διαφορετικές του υποδοχέα, λόγω των υδρόφοβων ή ηλεκτρόφιλων έλξεων που δημιουργούνται

Η συγκέντρωση των υποδοχέων των νευροδιαβιβαστών είναι πολύ μικρή (100-1.000 fmoles/mg πρωτ.) Η συγκέντρωση των μη ειδικών θέσεων σύνδεσης είναι σχεδόν άπειρη

Mη ειδική σύνδεση (non specific binding)

Διάκριση ειδικής από την μη ειδική σύνδεση

χρήση της τεχνικής της γρήγορης διήθησης στο κενό (rapid filtration under vacuum)

σε ένα από τους δοκιμαστικούς σωλήνες του πειράματοςχρησιμοποιείται μείγμα του ραδιοσημασμένου συνδέτη μαζί με μη ραδιοσημασμένο συνδέτη σε υψηλή συγκέντρωση (1.000-10.000 φορές υψηλότερη από τη συγκέντρωση του ραδιενεργού μορίου) η ραδιενέργεια που μετράμε στον σωλήνα αυτό αντιστοιχεί στην μη ειδική σύνδεση

R+L* ↔ RL* + 1000X ‘ψυχρό’ πρόσδεμα

Τυπικό πείραμα υπολογισμού ολικής σύνδεσης

Ολική σύνδεση = Ειδική + Μη ειδική σύνδεσηRL* ΧL*

[C]

[RL]

Ελεύθερο ραδιοπρόσδεμα (nM)

Δεσ

μευμ

ένο

ραδι

οπρό

σδεμ

α (c

pm)

B (Bound)

F (free), L (ligand)

Καθορισμός των συνθηκών σε ένα πείραμα σύνδεσης

Χρόνος επώασης

Θερμοκρασία επώασης22ο C (θερμοκρασία δωματίου) : πιο πρακτική επιλογή 37ο C (φυσιολογική θερμοκρασία) : καλύτερη επιλογή 4ο C : πιο επαναλήψιμα αποτελέσματα λόγω μειωμένης αποικοδόμησης του ραδιοπροσδέτη, χαμηλότερης μη ειδικής σύνδεσης και γιατί ορισμένα προσδέματα έχουν υψηλότερη συγγένεια σε χαμηλότερες θερμοκρασίες

pH επώασης κυμαίνεται μεταξύ 7 - 8

Συγκέντρωση παρασκευάσματος υποδοχέων

Ειδική σύνδεση (cpm)

[Παρασκεύασμα υποδοχέων] mg/mlχρόνος (min)

Β

B =+ ][

][FKFΒ

d

max

[F]

Kd (dissociation constant)

Βmax (maximal Binding): μέγιστος αριθμός θέσεων πρόσδεσης

Καμπύλη κορεσμού Ανάλυση Scatchard

[3Η]5-ΗΤ(F)

(nM)

Ολική σύνδεση(TΒ)(cpm)

Μη ειδική σύνδεση

(NSB)(cpm)

1 1717 432

1.5 2241 648

2 2655 865

2.5 3163 1081

3 3781 1279

4 4451 1729

5 5023 2161

6 5571 2594

7 6502 3026

8 7018 3458

9 7491 3891

10 8023 4323

[3Η] 5-ΗΤ με ειδική ραδιενέργεια 16,2 Ci/mmole, 2 mg πρωτεΐνης του ομογενοποιήματος10-5 Μ μη σημασμένης 5-ΗΤ επώαση στους 22o C για 30 λεπτά

F TB NSB SB = TB-NSB B/F

1 1717 432 1285 1285

1.5 2241 648 1593 1062

2 2655 865 1790 895

2.5 3163 1081 2082 833

3 3781 1279 2502 834

4 4451 1729 2722 681

5 5023 2161 2862 572

6 5571 2594 2977 496

7 6502 3026 3476 497

8 7018 3458 3560 445

9 7491 3891 3600 400

10 8023 4323 3700 370

Σύνδεση της σεροτονίνης στους υποδοχείς της

Βmax

Βmax/2

KD

NSB

SΒ

Β (c

pm)

0 5 10

10000

5000

T

F (nM)B/

F (x

103

)

Bmax

-1/KD

B (cpm x 103)0 2 4 6

2

1

Σύνδεση της σεροτονίνης στους υποδοχείς της

Το πρόσδεμα συνδέεται σε περισσότερες από μία θέσεις σύνδεσης

Υπερβολή Σιγμοειδής

Αλλοστερική πρόσδεση (σχέση του Hill, 1910)

Η κλίση της ευθείας δίνει τον n

που συμβολίζει τον αριθμό των

αλλοστερικών θέσεων πρόσδεσης

μέτρηση απόκρισης- in vitro- in vivo

Ισχύς φαρμάκου Αποτελεσματικότητα

Καμπύλη δόσης-απόκρισης

ΕmaxΕC50

Καμπύλη κορεσμού

ΒmaxΚd

Εφεδρικοί υποδοχείς

Όταν η max απόκριση μπορεί να επιτευχθεί σε μια συγκέντρωση στην οποία το φάρμακο δεν καταλαμβάνει το σύνολο των υποδοχέων

Κd = ΕC50 ΕC50<<<Κd

Καμπύλες δόσης-απόκρισης και ισχύς φαρμάκων

ΕC50 (effective concentration)

Ισχύς και αποτελεσματικότητα φαρμάκων

Ενα φάρμακο μπορεί να είναι • Αγωνιστής

πλήρης αγωνιστής μερικός αγωνιστής (ακόμη και η μέγιστη συγκέντρωση δεν μπορεί να προκαλέσει την μέγιστη απόκριση)

• Ανταγωνιστήςσυνδέεται στον υποδοχέα, αλλά δεν προκαλεί απόκριση συναγωνιστικός και μη συναγωνιστικός ανταγωνιστής

• Αντίστροφος αγωνιστής (αρνητικός ανταγωνιστής)αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα και προκαλεί μείωση της οποιαδήποτε μοριακής δραστικότητας του υποδοχέα που εκδηλώνεται σε κατάσταση ηρεμίας

Ο μερικός αγωνιστής έχει μικρότερη βιολογική απόκριση από τον πλήρη αγωνιστή μετά από την πλήρη κατάληψη των υποδοχέων

Φαρ

μακο

λογι

κό α

ποτ

έλεσ

μα

log [φαρμάκου]

Ο συναγωνιστικός ανταγωνιστής προκαλεί μετάθεση της καμπύλης

προς τα δεξιά

Καμπύλες δόσης-απόκρισης παρουσία συναγωνιστικού και μη συναγωνιστικού ανταγωνιστή

Μοντέλο δράσης των μερικών αγωνιστών

R- Receptor (αδρανής μορφή)R’- Receptor (δραστική μορφή)L (Ligand)

Δράσεις των μερικών αγωνιστώνΣύ

νδεσ

η σε

υπ

οδοχ

είς

Απ

όκρι

ση

Αντίστροφος αγωνιστής (αρνητικός ανταγωνιστής)

σταθεροποιεί την ανενεργή (μη δραστική) διαμόρφωση του υποδοχέα και παύει την αυθόρμητη και ανεξάρτητη από αγωνιστές δραστηριότητά του

Πειράματα εκτόπισης/ανταγωνισμού (competition experiments)

προσδιορισμός κινητικών σταθερών όταν ένα μόριο (αναστολέας, inhibitor) συναγωνίζεται την πρόσδεση ενός ραδιοσημασμένου προσδέματος στον υποδοχέαπ.χ. όταν υπάρχει αδυναμία ραδιοσήμανσης ενός μορίου

συναγωνιστική αναστολή (competitive inhibition) μη συναγωνιστική αναστολή (non competitive inhibition) ασυναγώνιστη αναστολή (uncompetitive inhibition)

Καμπύλη συναγωνιστικής αναστολής

IC50 (Inhibitory Concentration)συγκέντρωση του συναγωνιστικού αναστολέα που προκαλεί 50%

μείωση της ειδικής πρόσδεσης του προσδέτη στον υποδοχέα

αναστολέας

Εκτόπιση με συναγωνιστικούς αναστολείς

Όσο μικρότερη είναι η IC50 τόσο μεγαλύτερη η συγγένεια

? αν είναι αγωνιστής ή όχι ?

IC502

Ki =

inhibition constant

Καμπύλες εκτόπισης συναγωνιστικής και μη συναγωνιστικής αναστολής

Συναγωνιστική αναστολή Mη συναγωνιστική αναστολή

2 συγκεντρώσεις ραδιοσημασμένου προσδέματος (υψηλή και χαμηλή)

Θεραπευτικός δείκτης

Θεραπευτικός δείκτης = Τοξική δόση

Αποτελεσματική δόση

αποτελεί μέτρο της ασφάλειας ενός φαρμάκου