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Animais transgênicos e Xenotransplantes
Prof. Dr. Vinicius Farias Campos Disciplina de Transgênese Animal
Graduação em Biotecnologia - UFPel
1. Histórico e contextualização
2. Animais transgênicos e xenotransplantes
3. Métodos de geração e controle da expressão
4. Minisuínos transgênicos
6. Aplicações dos xenotransplantes
Abordagens da aula...
Autotransplante (auto = próprio) – transplante de tecido de uma parte para outra do corpo da mesma pessoa – sem rejeição Ex. ponte de safena
Alotransplantes (alo = outro) – transplante entre indivíduos de uma mesma espécie mas geneticamente diferentes. Ex. transplante de coração a partir de um doador compatível
Xenotransplante (xeno = extranho) – transplante entre espécies diferentes. Ex. suíno para um humano
Contextualização e classificação dos transplantes
Tipo mais comum de transplante
Alotransplantes
Revolucionaram a medicina década de 50
Atualmente são realizados cerca de 30.000 transplantes por ano no Brasil
Set/2013 – haviam 28.337 pessoas na fila de espera no Brasil
Escassez de órgãos
Busca de novas fontes de órgãos
Dados: ABTO, 2012
ABTO, 2013
Novas fontes de órgãos para transplantes
Órgãos robóticos ou mecânicos
Engenharia de tecidos – células tronco
Xenotransplantes
• 1682 – Transplante de parte do crânio de um cão para um homem na Rússia
• 1800 – Transplante da pele de sapo para feridos na guerra inglesa
• 1965 – Transplante de rins de chimpanzé para um homem
• 1992 – Transplante de um fígado de babuíno para um homem
• 2012 – Testes pré-clínicos com transplante de ilhotas pancreáticas de suínos transgênicos para humanos
Histórico dos Xenotransplantes
Por que gerar animais transgênicos para os xenotransplantes?
Nos alotransplantes barreiras genéticas imunológicas precisam ser superadas
Busca de doadores geneticamente compatíveis e uso de imunossupressores
O que nem sempre é bem sucedido!
E causa redução da resposta imune no paciente transplantado
Nos xenotransplantes isto ocorre também!
Por que gerar animais transgênicos para os xenotransplantes?
Com o desenvolvimento da transgênese animal
Modificação os animais doadores para remover as barreiras imunológicas
Fornecendo uma solução genética para um problema genético!
Quais espécies podem ser usadas para os xenotransplantes?
Macacos Suínos
– Animal com maior semelhança ao humano;
– Transmissão de vírus patogênicos (HIV);
– Problemas éticos;
– Não é mais usado
Macacos
Suínos
Humano (9 semanas) Suíno (4 semanas)
• Não-primata mais semelhante fisiologicamente ao homem;
• Órgãos com tamanho semelhante aos órgãos humanos;
• Ciclos reprodutivos curtos e proles grandes;
• Crescimento rápido;
• Espécie domesticada e já utilizada no consumo humano – Menos problemas éticos;
• Métodos para a transgênese bem estabelecidos.
Suínos
Modelo ideal para xenotransplantação
Qual o papel da transgênese nos xenotransplantes?
1. Superar barreiras imunológicas
2. Superar barreiras fisiológicas
3. Evitar xenozoonoses
• Remoção dos genes (knockout) dos principais antígenos causadores da rejeição hiperaguda;
• Adição de genes (knockin) para proteínas imunomoduladoras do sistema imune humano – rejeição crônica;
1. Suínos transgênicos para superar barreiras imunológicas
– O epítopo α1, 3-galactosiltransferase (αGal)
• Glicoproteína de membrana das células suínas;
• Presente em quase todas as células suínas;
• Principal responsável pela rejeição hiperaguda;
• Atacado por antícorpos humanos anti-αGal;
• Principalmente em órgãos vascularizados.
D’ápice & Cowan, 2009
Quais genes devem ser removidos
(nocauteados) nos suínos transgênicos?
– Reguladores do sistema complemento
• Função de bloquear o sistema complemento humano
– Reguladores da coagulação e trombose
• Inibir a formação de coágulos e trombos nos órgão xenotransplantados
– Moléculas imunossupressivas
• Atuam bloqueando a resposta imune no órgão xenotransplantado
Quais genes devem ser inseridos (knockin)
nos suínos transgênicos?
Os suínos transgênicos são utilizados nos xenotransplantes para:
1. Superar barreiras imunológicas
2. Superar barreiras fisiológicas
3. Evitar xenozoonoses
• Órgãos complexos como FÍGADO e RIM produzem muitas proteínas circulantes;
• As proteínas suínas podem ser incompatíveis com os receptores humanos devido à diferenças estruturais
Suínos transgênicos para superar barreiras fisiológicas
D’ápice & Cowan, 2009
Proteína Humana Proteína Suína
D’ápice & Cowan, 2009
Genes para proteínas humanas devem ser inseridos em suínos
transgênicos
Garantindo a funcionalidade completa do órgão
Suínos transgênicos para superar barreiras fisiológicas
Os suínos transgênicos são utilizados nos xenotransplantes para:
1. Superar barreiras imunológicas
2. Superar barreiras fisiológicas
3. Evitar xenozoonoses
• Retrovírus endógeno suíno (PERV)
– Integrado no genoma suíno
– Transmitido junto com as células transplantadas
– Risco de ser ativado
Suínos transgênicos para evitar xenozoonoses
Remoção do PERV por nocaute do
genoma viral
PERV em células suínas
Como gerar os suínos transgênicos para xenotransplantes?
Tran
sfer
ênci
a G
ênic
a
Embriões
Gametas
Células
Microinjeção de DNA
Transferência gênica mediada por espermatozoides (SMGT)}
Transferência nuclear de células somáticas (SCNT)
Métodos de geração de suínos transgênicos
SCNT Nocaute Ex. αGal
Inserção Ex. hDAF
Transferência nuclear de células somáticas (SCNT)
Suínos transgênicos para xenotransplantes
Multi-SMGT
Embriões suínos expressando três proteínas fluorescentes
EBFP DsRED GFP
Como controlar a expressão dos transgenes?
Métodos de controle da expressão gênica em animais transgênicos
Construção do vetor (cassete gênico)
Promotores tecido-específicos ou constitutivos
Realizar a expressão tecido-específica dos imunoreguladores; Essencial para prevenir rejeição dos órgãos xenotransplantados
Promotores tecido-específicos;
Evitar o uso de promotores virais e constitutivos;
Genoma suíno (2012) – novas regiões regulatórias devem ser descobertas.
Controle da expressão do transgene em suínos para xenotransplantes
Expressão do imunomodulador CD4 células β
das ilhotas
Klymiuk et al. (2012)
Insulina hCD4
Células β - ilhotas
Controle da expressão do transgene em suínos para xenotransplantes
Minisuínos Transgênicos
Minipigs transgênicos para o estudo da xenotransplantação
Tamanho Reduzido
Fácil manipulação em experimentos
Baixo custo de manutenção
Minipigs nocaute αGal
Aplicações atuais dos xenotransplantes
Aplicações atuais dos xenotransplantes
Transplante de órgãos sólidos
• Ex. Fígado, Rim, Coração
Transplante de células e tecidos
• Ex. Ilhotas pancreáticas
Transplante de ilhotas pancreáticas de
suínos para portadores de
diabetes
Aplicações atuais dos xenotransplantes
Aplicações atuais dos xenotransplantes
Em 2010 foi aprovado o xenotransplante de
ilhotas pancreáticas de súínos para humanos na
Rússia
Outros órgãos suínos para
xenotransplantação
• Não há doadores suficientes para alotransplantes
• Xenotransplantes
• Suínos transgênicos para tornar os xeno-órgãos compatíveis geneticamente com os humanos
– Nocaute do αGal
– Inserção de genes imunomoduladores
• Geração dos suínos transgênicos por SCNT e SMGT
• Controle da expressão por promotores tecido-específicos
• Minipigs
Recapitulando...
Prof. Dr. Vinicius Farias Campos Graduação em Biotecnologia fariascampos@gmail.com vcampos_ib@ufpel.edu.br
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